Acta Biológica Colombiana

NEXT GENERATION SEQUENCING AND PROTEOMICS IN PLANT VIROLOGY: HOW IS COLOMBIA DOING?

ABSTRACT Crop production and trade are two of the most economically important activities in Colombia, and viral diseases cause a high negative impact to agricultural sector. Therefore, the detection, diagnosis, control, and management of viral diseases are crucial. Currently, Next-Generation Sequencing (NGS) and 'Omic' technologies constitute a right-hand tool for the discovery of novel viruses and for studying virus-plant interactions. This knowledge allows the development of new viral diagnostic methods and the discovery of key components of infectious processes, which could be used to generate plants resistant to viral infections. Globally, crop sciences are advancing in this direction. In this review, advancements in 'omic' technologies and their different applications in plant virology in Colombia are discussed. In addition, bioinformatics pipelines and resources for omics data analyses are presented. Due to their decreasing prices, NGS technologies are becoming an affordable and promising means to explore many phytopathologies affecting a wide variety of Colombian crops so as to improve their trade potential.

RESUMEN La producción y el comercio de cultivos es una de las actividades económicas más importantes para el país. Las enfermedades causadas por virus ocasionan graves pérdidas económicas en el sector, por lo tanto, la detección, diagnóstico y diseño de estrategias para su control y manejo es crucial. Las tecnologías de secuenciación masiva (NGS por sus siglas en ingles) y las ciencias Ómicas constituyen hoy, una herramienta para el descubrimiento de nuevos virus y para el estudio de la interacción entre los virus y su hospedero vegetal. Este conocimiento no solo permite el desarrollo de nuevos métodos de diagnóstico, sino también permite el descubrimiento de componentes claves en la infección, los cuales podrían usarse para obtener plantas resistentes a los virus. En el mundo, el manejo de cultivos se está trabajando con ese enfoque. Por lo tanto, en esta revisión se presentan las diferentes aplicaciones de las tecnologías ómicas en la virología de plantas y el avance que ha alcanzado Colombia. Adicionalmente, se muestran los diferentes recursos y programas usados para el análisis bioinformático de datos ómicos. Debido a su costo cada vez más reducido, las tecnologías NGS son una excelente oportunidad para explorar fitopatologías en una gran diversidad de productos agrícolas y para mejorar su potencial comercial.

Antibody-dependent enhancement in the immunopathogenesis of severe dengue, implications for the development and use of vaccines

RESUMEN Actualmente, la infección por el virus de dengue (DENV) es uno de los problemas más importantes de salud pública en países tropicales y endémicos como Colombia, pues en tanto puede ser producida por cuatro diferentes serotipos virales, durante las infecciones secundarias se presentan frecuentemente cuadros más severos que incluso pueden llevar a desenlaces fatales. El centro de la fisiopatología del dengue grave es el daño producido al endotelio, que se traduce en un aumento en la permeabilidad vascular que se evidencia como fuga plasmática, descontrol en la coagulación y daño de órganos. Aunque hay varias teorías que explican la enfermedad severa, el fenómeno denominado amplificación de la infección dependiente de anticuerpos (antibody dependent enhancement, ADE) es el más conocido. En este, se postula que el virus causante de una infección secundaria es reconocido, pero no neutralizado, por anticuerpos generados en la infección previa e internalizado en las células susceptibles usando receptores Fc-gamma, lo cual aumenta la replicación viral e induce modificaciones en la respuesta inmune celular que contribuyen al desarrollo de dengue grave. En este escrito, se realiza una revisión de los hallazgos sobre los mecanismos involucrados en el fenómeno de ADE y cómo pueden contribuir a la progresión hacia dengue grave, describiendo los conceptos de ADE extrínseco e intrínseco, además de como este fenómeno debe ser tenido en cuenta para el diseño, desarrollo e implementación de una vacuna para dengue, en tanto es capaz de afectar su eficacia y seguridad.

ABSTRACT Dengue virus infection is the most important vector transmitted disease in tropical countries such as Colombia, where all the four dengue virus serotypes are circulating and are involved in successive secondary infections which induce severe or even fatal cases. The central key to understanding the severe dengue cases is the endothelial function damage which appears as plasma leakage, coagulation impairment, and organ compromise. Severe dengue could be explained by different theories, among them the antibody-dependent enhancement (ADE) phenomenon is the best known. This theory postulates that the second heterotypic virus causing a secondary infection is recognized by antibodies raised during the first infection but are ineffective to neutralize the virus. Instead this virus-antibody complex is internalized by Fc-gamma receptor-bearing cells increasing the viral replication and inducing an aberrant immune response that contributes to severe dengue presentation. This manuscript is aimed to review the evidence about the ADE phenomenon and its involvement in the severe evolution of dengue cases. Here, it will be described the extrinsic and intrinsic ADE concepts and how these phenomena must be considered to the design, development, and implementation of a dengue vaccine because the evidence indicates that ADE affects both efficacy and safety of vaccine prototypes.

First report of begomoviruses infecting pepper (Capsicum spp.) crops in Colombia

RESUMEN Virus del género Begomovirus infectan cultivos de importancia económica en todo el mundo, incluyendo ají. A la fecha, en Colombia no hay reportes de la presencia de begomovirus infectando este cultivo, por lo que el objetivo de esta investigación fue identificar la presencia de virus de este género en ají empleando estrategias moleculares. Se colectaron 197 muestras de ají en diez municipios del Valle del Cauca. Se extrajo el DNA genómico total vegetal y mediante PCR se detectó la presencia de begomovirus. Para establecer la identidad molecular del virus se amplificaron fragmentos de 1,4 kb de muestras colectadas en Palmira y Vijes. Los fragmentos fueron clonados, secuenciados y analizados. Se encontró que el 85,7 % de las muestras de ají evaluadas fueron positivas para begomovirus. Los análisis de secuencia de los fragmentos virales de 1,4 kb arrojaron una identidad de 91,8 % entre ellos y los de secuencia de nucleótidos de los virus aislados en Vijes y Palmira mostró que éstos presentan los valores de identidad más altos (87,2 % y 86,6 %) con el virus de la distorsión de la hoja de maracuyá, un begomovirus aislado de maracuyá en Colombia. Estos análisis estarían indicando que este begomovirus aislado de ají podría ser una nueva especie. De acuerdo con la literatura, este es el primer reporte de un begomovirus infectando cultivos de ají en Colombia.

ABSTRACT Viruses of the genus Begomovirus infect crops of economic importance around the world, including pepper. To date, in Colombia there are no reports of the presence of begomoviruses infecting this crop; therefore, this research work aimed to identify the presence of viruses of this genus in pepper using molecular strategies. Around 197 pepper samples were collected in ten municipalities in Valle del Cauca. Total plant genomic DNA was extracted, and the presence of begomoviruses was detected by using PCR. In order to establish the molecular identity of the virus, fragments of 1.4 kb were amplified from samples collected in Palmira and Vijes municipalities. The fragments obtained were cloned, sequenced, and analyzed. The results show that about 85.7 % of the pepper samples evaluated were positive for begomoviruses. Sequence analysis of the viral fragments of 1.4 kb showed an identity of 91.8 % among them. The nucleotide sequence analysis of the begomoviruses isolated in Vijes and Palmira showed its highest identity values (87.2 % and 86.6 %) with the passion fruit leaf distortion virus, a begomovirus that is affecting passion fruit crops in Colombia. These sequences analyze would indicate that this begomovirus isolated from pepper could be a new species that has not been reported worldwide. To our knowledge, this is the first report of a begomovirus infecting pepper crops in Colombia.

Identification of genogroups of Infectious Bursal Disease Virus in poultry farms at Colombia

RESUMEN El virus de la enfermedad de Gumboro (IBDV) es un avibirnavirus con genoma dsARN que presenta altas tasas de mutación y recombinación. A pesar del efecto inmunosupresor en aves y la frecuencia con que ocurre la infección por este agente en el país son pocos los estudios que caracterizan los cuadros clínicos y se desconoce cuáles son los genogrupos circulantes. Esta investigación tuvo como objetivo determinar la frecuencia de lesiones histopatológicas en órganos del sistema inmune e identificar los genogrupos del IBDV en aves comerciales de Colombia. Para determinar la frecuencia de presentación de lesiones en órganos del sistema inmune se analizaron 381 casos clínicos de las bases de datos del Laboratorio de Patología Aviar (LPA) de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá (periodo 2016-2018). Asimismo, se secuenciaron los productos de RT-PCR del gen que codifica para la proteína viral VP2 provenientes de 35 muestras de bursas de Fabricio. Como resultado se encontró evidencia de lesiones microscópicas compatibles con procesos de inmunodepresión en órganos del sistema inmune (bursa de Fabricio, timo, bazo y médula ósea) en el 25 % (97) de los casos analizados y se identificaron los genogrupos 1, 2 y 4 en la siguiente proporción: genogrupo 1-69 % (virus clásicos), genogrupo 2-25 % (variantes) y genogrupo 4-6 % (identificado en Suramérica). Estos hallazgos demuestran la presencia de lesiones en órganos del sistema inmune y la existencia de los genogrupos 1, 2 y 3 del IBDV circulando en aves comerciales en Colombia. Esta es la primera investigación en el país con este sistema de clasificación que permite evidenciar con mayor precisión los cambios en el genoma del IBDV. Lo anterior señala la necesidad de continuar con este tipo de estudios para tener una mejor comprensión de la infección en campo y orientar el diseño e implementación de estrategias de control.

ABSTRACT Infectious Bursal Disease Virus (IBDV) is an avibirnavirus with a dsRNA genome, which has a high mutation and recombination rates. Despite the immunosuppressive effect in poultry and the frequency of infections by this agent, few studies in Colombia that characterize the clinical signs and identify the circulating genogroups have been reported. This study aimed to determine the frequency of histopathological lesions in immune organs and to identify IBDV genogroups in poultry from Colombia. In this way, the Laboratorio de Patología Aviar (LPA) databases from the Universidad Nacional de Colombia (period 2016-2018) were analyzed in order to identify the frequency of lesions present in immune organs. 35 samples of the bursa of Fabricius, positive by RT-PCR, were sequenced to the gene that codes for the VP2 protein. 97 (25 %) cases showed microscopic lesions in the immune organs. The genogroups identified and the frequencies were: genogroup 1-69 % (classical viruses), genogroup 2-25 % (antigenic variants), and genogroup 4-6 % (identified in South America). These findings demonstrate the lesions of immune organs and the presence of different genogroups circulating in commercial birds in Colombia. This indicates the need to continue with these studies in order to have a better understanding of the infection in the field and to guide the design and implementation of control strategies.

The loss of function of Cyclin-Dependent Kinase 5 (CDK5) alters the Cytoskeleton and decrease the in vitro Dengue Virus-2 infection

RESUMEN La quinasa dependiente de ciclina 5 (CDK5) regula diversas funciones en neuronas, células endoteliales y epiteliales, entre ellas la dinámica del citoesqueleto. Así mismo, se ha reportado que componentes del citoesqueleto, tales como, filamentos de actina y microtúbulos juegan un rol importante durante la infección por el virus dengue (DENV). El objetivo del presente trabajo fue evaluar por dos métodos, inhibición química y silenciamiento génico, la participación de CDK5 durante la infección por DENV-2. La actividad antiviral de roscovitina fue evaluada usando ensayos de Unidades Formadoras de Placa (PFU). La eficiencia de transfección y el silenciamiento de CDK5, empleando miARNs artificiales, se determinó por citometría de flujo. El efecto sobre la proteína de envoltura viral y elementos del citoesqueleto se evidenció mediante microscopia avanzada de fluorescencia y análisis de imágenes. Roscovitina mostró actividad antiviral en etapas pre y post-infectivas en una forma dependiente de la dosis. El tratamiento con roscovitina y miRCDK5 mostró ser efectivo reduciendo la cantidad de CDK5 en células no infectadas. En células infectadas y transfectadas con miRCDK5, así como tratadas con el inhibidor, se observó una reducción significativa de la proteína de envoltura viral; sin embargo, no se encontró reducción significativa de CDK5. Además, el tratamiento con roscovitina indujo cambios celulares morfológicos evidentes en células infectadas. Los resultados indican la potencial participación de CDK5 durante la infección por DENV-2, posiblemente mediando la traducción proteica o la replicación del genoma viral a través de la regulación de la dinámica del citoesqueleto. Se requieren datos adicionales para esclarecer la mecanística del fenómeno usando métodos alternativos.

ABSTRACT Cyclin-Dependent Kinase 5 (CDK5) regulates several functions in neurons, endothelial, and epithelial cells, including the cytoskeleton dynamics. Likewise, it has been reported that some cytoskeleton elements, such as actin filaments and microtubules, play an essential role during Dengue virus (DENV) infection. This work aimed to evaluate the role of CDK5 during DENV-2 infection by two methods, chemical inhibition, and gene silencing. The antiviral activity of roscovitine was evaluated using Plaque Forming Units (PFU) assay. The transfection efficiency and knockdown of CDK5, using artificial miRNAs, was carried out by flow cytometry. The effect on the viral envelope protein and cytoskeleton elements was evidenced by advanced fluorescence microscopy and image analysis. Roscovitine showed antiviral activity in pre and post-infection stages in a dose-dependent manner. Treatment with roscovitine and miRCDK5 decrease the amount of CDK5 in uninfected cells. In cells infected and transfected with miRCDK5, as well as treated with the inhibitor, a significant reduction of the viral envelope protein was observed; however, no significant reduction of CDK5 was found. Also, evident morphological cellular changes were observed during the treatment with roscovitine in infected cells. The results indicate the potential participation of CDK5 during DENV-2 infection, possibly mediating protein translation or replication of the viral genome through the cytoskeletal dynamics regulation. Additional data are required to clarify the mechanistic of these phenomena using alternative methods.

Seroprevalence of Hepatitis C Virus in a blood bank of Medellín-Colombia, 2005-2018

RESUMEN El objetivo de este estudio fue estimar la seroprevalencia del virus de la hepatitis C (VHC) en donantes de un banco de sangre de Medellín- Colombia en el periodo 2005-2018 e identificar sus factores asociados. Se realizó un estudio ecológico mixto con 166603 sujetos. La descripción se realizó con frecuencias, series de tiempo con las seroprevalencias y sus intervalos de confianza del 95 %. Se estimaron razones de odds crudas y ajustadas mediante regresión logística binaria en SPSS 25.0®. La seroprevalencia fue 0,567 % (IC 95 % = 0,53-0,60) con una endemia baja y estable desde el 2010. Los únicos factores que presentaron diferencias estadísticas en la seroprevalencia fueron el grupo etario y la frecuencia de donación, con una infección 23 % mayor en los donantes con edad mayor de 40 años (frente a las personas con edad entre 18-40), y 94 % mayor en los donantes de primera vez, en comparación con quienes donan a repetición . Se concluye que en Medellín los niveles endémicos del VHC han sido estables y bajos en la última década, evidenciando la importancia de la vigilancia epidemiológica que realizan los bancos de sangre. La menor prevalencia en la última década hace suponer una exposición diferencial al virus en función de la generación a la que se pertenece, de manera que el efecto de cohorte de nacimiento debe ser investigada en estudios posteriores.

ABSTRACT The objective of this study was to estimate the seroprevalence of hepatitis C virus (HCV) in donors of a Medellín-Colombia blood bank in the 2005-2018 period and to identify its associated factors. A mixed ecological study was conducted with 166603 donors. The description was made with frequencies, time series with seroprevalences and their 95 % confidence intervals. Odds ratios were estimated raw and adjusted by binary logistic regression in SPSS 25.0®. The seroprevalence was 0.567 % (95 % CI = 0.53-0.60) with a low and stable endemicity since 2010. The only factors that presented statistical differences in seroprevalence were the age group and the frequency of donation, with an infection 23 % higher in donors aged over 40 years (compared to people aged 18-40), and 94 % higher in first-time donors, compared to repeat ones. It is concluded that in Medellín the endemic levels of HCV have been stable and low in the last decade, evidencing the importance of the epidemiological surveillance carried out by blood banks. The lower prevalence in the last decade suggests a differential exposure to the virus depending on the generation to which it belongs, so that the birth cohort effect that should be studied in later research.

LACK OF EXPRESSION OF HEPATITIS C VIRUS CORE PROTEIN IN HUMAN MONOCYTE-DERIVED DENDRITIC CELLS USING RECOMBINANT SEMLIKI FOREST VIRUS

ABSTRACT Hepatitis C Virus belongs to the Flaviviridae family. One proposed mechanism of HCV persistence in the ability to infect hematopoietic cells, including Dendritic cells (DCs). HCV infection of DCs could impair their functions that represent one of the mechanisms, thus hampering viral clearance by the host immune system. Among HCV-encoded proteins, the highly conserved Core protein has been suggested to be responsible for the immunomodulatory properties of this Hepacivirus. Recombinant viral vectors expressing the HCV Core protein and allowing its transduction and therefore the expression of the protein into DCs could be useful tools for the analysis of the properties of the Core protein. Vaccinia Virus and retrovirus have been used to transduce human DCs. Likewise, gene transfer into DCs using Semliki Forest Virus has been reported. This study aimed to express the HCV Core protein in human monocyte-derived DCs using an SFV vector, in which the subgenomic RNA encoding the structural proteins was replaced by the HCV Core sequence and then analyze the effects of its expression on DCs functions.

RESUMEN El virus de la Hepatitis C (VHC) pertenece a la familia Flaviviridae. Uno de los mecanismos propuestos de la persistencia del VHC es la capacidad de infectar células hematopoyéticas, incluidas las células dendríticas (DCs). La infección por VHC de DCs podría alterar sus funciones y corresponde a uno de los mecanismos que impiden el aclaramiento de la infección por VHC por el sistema inmunitario del hospedero. Entre las proteínas codificadas por el VHC, se ha sugerido que la proteína Core, altamente conservada, es responsable de las propiedades inmunomoduladoras de este Hepacivirus. Los vectores virales recombinantes que expresan la proteína Core y permiten su transducción a DCs podrían ser herramientas útiles para el análisis de las propiedades de esta proteína. El virus Vaccinia y el retrovirus se han utilizado para la transducción de DCs humanas. Del mismo modo, la transducción de DCs usando el virus del bosque de Semliki ha sido reportada. El objetivo de este estudio fue expresar la proteína Core de VHC en DCs derivadas de monocitos humanos utilizando un vector de SFV, en el que el ARN subgenómico que codifica las proteínas estructurales fue reemplazado por la secuencia Core del VHC y evaluar los efectos de su expresión en las funciones de DCs.

CELL CULTURE ISOLATION OF HEPATITIS E VIRUS GENOTYPE 3 STRAIN OBTAINED FROM HUMAN FECES

ABSTRACT Hepatitis E virus (HEV) is considered one of the leading causes of acute viral hepatitis worldwide, and about 20 million infections and approximately 57 000 deaths occurred every year. However, little is known about the replicative virus cycle due to the absence of a consensus cell culture model. A549 cell line is considered susceptible to HEV genotype 3, however, both viral strain and cell culture conditions could affect the viral isolation in vitro. The objective of this work was to isolate in vitro an HEV-3 strain obtained from human feces. To this, a genotype 3 HEV strain previously identified by genetic characterization was inoculated in A549 monolayers, and incubated for two hours at 37 °C. Five days post-infection, cells were passaged (subcultured) for the first time, and serial passages were done on average every four days during 41 days. HEV replication was evaluated through RT-qPCR in each passage, and reinfection of the cell line with the viral progeny derived from A549 infected monolayers was assessed through immunofluorescence and RT-qPCR. Viral RNA was detected in each passage from infected monolayers, and the highest amount was found after 26 days (2 x 106 copies/µL). In reinfection assay, capsid antigen was detected perinuclearly and forming foci, and 1x104 copies/µL of viral RNA was detected after 96 hours post infection. This shows that HEV recovered from the cell lysate monolayers was infectious. This viral isolate offers a critical tool to study the unknown aspect of HEV infection.

RESUMEN El virus de la hepatitis E (HEV) se considera como una de las principales causas de hepatitis viral aguda en el mundo; cada año ocurren aproximadamente 20 millones de infecciones y 57 000 muertes. Debido a la ausencia de un modelo de cultivo celular consenso, se sabe poco sobre el ciclo replicativo del virus. La línea celular A549 se considera susceptible al genotipo 3 de HEV, pero tanto la cepa viral como las condiciones del cultivo celular podrían afectar el aislamiento viral in vitro. Por tanto nos propusimos aislar in vitro una cepa genotipo 3 del HEV. Para ello, se inocularon células A549 con una cepa HEV-3 identificada previamente por caracterización genética, y se incubó durante dos horas a 37 °C. Cinco días después de la infección, las células se pasaron (subcultivaron) por primera vez, y se realizaron pases seriados cada cuatro días en promedio, durante 41 días. En cada pase se evalúo la replicación del HEV mediante RT-qPCR. La reinfección de la línea celular con progenie viral derivada de monocapas de A549 infectadas se evaluó mediante inmunofluorescencia y RT-qPCR. Se detectó ARN viral en cada pase a partir de monocapas, y el pico máximo se alcanzó a los 26 días post infección (2 x 106 copias/µL). En el ensayo de reinfección, se detectó antígeno de cápside perinuclearmente y formando focos, y se detectaron 1 x 104 copias/µL de RNA viral a las 96 horas post infección. El HEV recuperado de lisado de monocapas fue infeccioso. Este aislado viral ofrece una herramienta importante para estudiar aspectos desconocidos de la infección por HEV.

Assembly and release of Dengue virus: Role of Alix protein

RESUMEN Algunos virus envueltos usurpan la maquinaria celular ESCRT (complejo de clasificación endosomal requerido para el transporte) para llevar a cabo funciones como la transcripción, la traducción, el ensamblaje y la liberación de partículas virales desde las células huésped. Aunque esta estrategia ha sido estudiada principalmente en retrovirus, son varios los virus envueltos que la usan. El objetivo del trabajo fue explorar la participación de una proteína accesoria de ESCRT, la proteína Alix, en la transcripción, traducción, ensamblaje y liberación del virus dengue (DENV), así como su interacción con la proteína viral NS3. Células A549 infectadas con DENV2 fueron tratadas con pequeños ARN de interferencia (siRNA) para disminuir la expresión ("knock-down") de la proteína Alix. Simultáneamente, se obtuvo una línea A549 que expresaba una proteína NS3 recombinante y sobre este sistema se hicieron ensayos de inmunoprecipitación y "pull-down" para detectar interacción entre NS3 y Alix. Los resultados mostraron que el "knock-down" de Alix no tuvo efecto notable en la transcripción o la traducción viral, pero sí en el ensamblaje y la liberación de DENV2, mientras que los ensayos de "pull-down" revelaron la interacción entre NS3 y Alix. La participación de Alix en la producción de DENV2 y su interacción con NS3 constituyen un potencial blanco para el diseño de estrategias dirigidas a controlar la propagación de DENV.

ABSTRACT Since the finding that HIV recruits cellular ESCRT (endosomal sorting complexes required for transport) machinery to accomplish viral budding, this strategy has emerged as an escape route for enveloped viruses also. The work aimed to explore the participation of the cellular protein Alix (a human protein that acts as an adapter in the ESCRT pathway) on the transcription, protein expression, assembly and release of Dengue virus (DENV), and explore for its potential interaction with the viral protein NS3. To this purpose, A549 cells were infected with DENV2 and treated with small interfering RNAs (siRNA) to generate an Alix stable knockdown cells line. Also, an A549 cells line expressing a histidine-tagged NS3 protein was obtained. Both cells lines were used in immunoprecipitation and pull-down assays to assess the interaction between NS3 and Alix. The results showed that Alix knockdown had no effect on viral transcription or viral protein expression but influenced the assembly and release of DENV2 negatively. Finally, pull-down assays revealed the interaction between NS3 and Alix. The finding of an Alix participation in the production of DENV2 and its interaction with NS3 provides a potential target for the design of control/inhibition strategies against DENV spread.

ISOLATION OF THE HUMAN CYTOMEGALOVIRUS FROM BODILY FLUIDS

ABSTRACT In vitro studies on the pathogenesis of the human cytomegalovirus (HCMV) are conducted regularly using laboratory adapted strains that lose some characteristics during the adaptation process. Since HCMV is excreted from bodily fluids during infection or reactivation, this work aimed to isolate and culture HCMV from the MRC-5 human cells found in the urine, bronchoalveolar lavage, saliva, and plasma samples of pediatric patients with probable or confirmed infection. The samples were inoculated on cell cultures either for 14 days or until a cytopathic effect (CPE) of 80 % was observed. The cell lysates and supernatants were used to perform successive viral passages. Besides HCMV, the herpes simplex virus was detected from all the saliva samples. Inoculation of the HCMV positive sera induced cell clustering and immediate monolayer damage that restricted their use. One sample of bronchoalveolar lavage induced a CPE after inoculation like that of the HCMV reference strains (Towne and Merlin), which was consequently propagated and titrated. A second viral isolate derived from the urine sample of a patient with congenital infection did not demonstrate a CPE, although presence of the virus had been confirmed using PCR. The viral isolates were examined and found to be negative for adenoviruses or enteroviruses. Despite the evident difficulty encountered for the isolation and harvesting of the HCMV, this work shows that it was possible to obtain a low passage viral strain using a modified shell vial method and inoculation protocol with extended follow-up and confirmation.

RESUMEN Estudios in vitro de la patogénesis del citomegalovirus humano (HCMV) se hace empleando cepas adaptadas de laboratorio que han perdido algunas de sus características durante ese proceso. En vista que el HCMV se excreta en distintos fluidos corporales, dependiendo de la condición clínica del paciente, en este trabajo se propuso aislar y propagar HCMV en fibroblastos MRC-5 usando muestras de orina, lavado broncoalveolar, saliva y plasma de pacientes pediátricos. Estas muestras fueron inoculadas sobre los cultivos celulares por 14 días o hasta alcanzar un efecto citopático en el 80 % de la monocapa. El lisado celular y el sobrenadante del aislamiento se usaron para hacer pasajes virales sucesivos. Además de HCMV, el virus de herpes simple se aisló en todas las muestras de saliva. Con el empleo de los sueros positivos para HCMV se observó la formación de agregados y daño inmediato en la monocapa que impidieron su uso. Una muestra de lavado broncoalveolar indujo ECP desde la inoculación, similar al control positivo para HCMV (cepas Towne y Merlin), por lo que fue propagada y se tituló. Un segundo aislamiento viral obtenido de la orina de un paciente con infección congénita no produjo ECP a pesar de ser confirmado por PCR. En los aislamientos llevados hasta el pasaje 1, se descartó la presencia de enterovirus y adenovirus. A pesar de la evidente dificultad para aislar y propagar el HCMV, fue posible obtener un aislamiento usando un protocolo de Shell vial e inoculación modificado, y con un seguimiento prolongado del proceso.

Molecular characterization of a new Begomovirus isolated from five weeds species collected in tomato crops in Valle del Cauca

RESUMEN Las arvenses son hospederos alternos de begomovirus (Geminiviridae), los cuales facilitan su persistencia y propagación a cultivos de interés agronómico, como el tomate. El objetivo de esta investigación fue obtener el genoma completo de un begomovirus bipartita encontrado en Amaranthus dubius, Rivina humilis, Rhynchosia minima, Desmodium sp. y Caesalpinia sp., las cuales fueron colectadas en cultivos de tomate en Ginebra y Cerrito, Valle del Cauca. El genoma del begomovirus fue obtenido utilizando amplificación por círculo rodante y digestión con las enzimas EcoRI y EcoRV, las cuáles cortan el componente genómico A y B, respectivamente. Estos fragmentos fueron clonados, secuenciados y analizados. Finalmente, se verificó la presencia de este begomovirus en todas las arvenses mediante PCR específico. Se obtuvieron tres clonas EcoRI y cinco clonas EcoRV. Los fragmentos que portan los componentes A y B presentan un tamaño de 2 584 y 2 543 nt, respectivamente. El análisis de secuencia de nucleótidos del genoma begomoviral A con otros begomovirus previamente reportados, mostró la mayor identidad (90,9 %) con el virus del mosaico dorado de Rhynchosia de Yucatán. Tomando como base el criterio de demarcación actual para las especies de Begomovirus establecido por el Comité Internacional de Taxonomía de Virus, el geminivirus aislado de las arvenses A. dubius, R. humilis, R. minima, Desmodium sp. y Caesalpinia sp., constituye una nueva especie begomoviral. Con base en la sintomatología observada en campo, se propone el nombre de Virus del mosaico dorado de Rhynchosia de Colombia para designar a esta nueva especie.

ABSTRACT The weeds are alternative hosts of begomoviruses (Geminiviridae), which facilitate their persistence and propagation to crops of agronomic interest, such as tomatoes. The objective of this investigation was to obtain the complete genome of a bipartite begomovirus found in Amaranthus dubius, Rivina humilis, Rhynchosia minima, Desmodium sp. and Caesalpinia sp., which were collected in tomato crops in Ginebra and Cerrito, Valle del Cauca. The genome of the begomovirus was obtained using rolling circle amplification and digestion with the enzymes EcoRI and EcoRV, which cut the genomic component A and B, respectively. These fragments were cloned, sequenced, and analyzed. Finally, the presence of this begomovirus in all weeds was verified by specific PCR. Three EcoRI clones and five EcoRV clones were obtained. The fragments carrying components A and B have a size of 2 584 and 2 543 nt, respectively. The analysis of the nucleotide sequence of the begomoviral A genome with other previously reported begomoviruses showed the highest identity (90.9 %) with the Rhynchosia golden mosaic virus Yucatán. Based on the current demarcation criterion for the Begomovirus species established by the International Committee on Taxonomy of Viruses, the geminivirus isolated from the weeds A. dubius, R. humilis, R. minima, Desmodium sp. and Caesalpinia sp., constitutes a new begomoviral species. Based on the symptoms observed in the field, the name of the Rhynchosia golden mosaic Colombia virus is proposed to designate this new species.

Meta-analyses of the validity and performance of screening tests for Hepatitis C Virus in the blood banks, 2000-2018

RESUMEN Este estudio evaluó la validez y desempeño del inmunodiagnóstico del virus de la hepatitis C (VHC), con base en estudios publicados en la literatura científica mundial. Se diseñó y validó un protocolo de búsqueda y selección de investigaciones en las fases de la guía PRISMA, se analizaron los parámetros de sensibilidad, especificidad, cocientes de probabilidad, razón de odds y curva ROC, en MetaDisc. Se tamizaron 4602 estudios, de los cuales sólo 545 se realizaron en bancos de sangre y 18 evaluaron la validez diagnóstica de las pruebas para el VHC. La mayoría de los estudios fueron de Europa y Asia, con un 78 % basados en determinación de anticuerpos. Los estudios con detección de anticuerpos se realizaron en 21 483 donantes sanos y 3 145 infectados en quienes se halló una sensibilidad de 97,8 % (IC 95 % = 97,3 - 98,2), especificidad 99,0 % (IC 95 % = 98,9 - 99,2), cociente de probabilidad positivo 75,4 (IC 95 % = 27,2 - 209,2) y negativo de 0,02 (IC 95 % = 0,01 - 0,07) y área bajo la curva de 99,8 %. Se concluye que la detección de anticuerpos presenta excelente validez, desempeño y utilidad diagnóstica para la detección del VHC en donantes de sangre y población general.

ABSTRACT This study evaluated the validity and performance of the immunodiagnosis of the Hepatitis C Virus (HCV), based on studies published in the worldwide scientific literature. A search and selection research protocol was designed and validated in the phases of the PRISMA guide, the parameters of sensitivity, specificity, likelihood ratios, odds ratio, and ROC curve were analyzed in MetaDisc. 4602 studies were screened, of which only 545 were performed in blood banks and 18 evaluated the diagnostic validity of the tests for HCV. Most studies were from Europe and Asia, with 78 % based on antibody determination. Studies with antibody detection were carried out in 21483 healthy donors and 3145 infected patients in whom a sensitivity of 97.8 % (95 % CI = 97.3 - 98.2) was found, 99.0 % specificity (95 % CI = 98.9 - 99.2), positive likelihood ratio 75.4 (95 % CI = 27.2 - 209.2) and negative of 0.02 (95% CI = 0.01 - 0.07) and area under the curve 99.8 %. It is concluded that the detection of antibodies presents excellent validity, performance, and diagnostic utility for the detection of HCV in blood donors and the general population.

Natural coinfection of RNA viruses in potato (Solanum tuberosum subsp. Andigena) crops in Antioquia (Colombia)

RESUMEN Las enfermedades virales son uno de los principales problemas fitopatológicos de la papa. Con el fin de determinar los virus más prevalentes en cultivos de papa var. Diacol Capiro en el oriente Antioqueño (Colombia), se evaluó mediante RT-qPCR la presencia de diez virus de ARN (PVY, PVA, PVV, TaLMV, PVS, PLRV, PYVV, PVX, ToRSV y PMTV) en 36 muestras de tejido foliar. Los resultados indicaron la ocurrencia de cinco de los diez virus evaluados, con niveles de prevalencia de 88,9 %, 75 %, 75 %, 41,7 % y 25 % para PVY, PVX, PYVV, PLRV y PVS, respectivamente. Con fines comparativos, cuatro virus también se evaluaron mediante ELISA, siendo detectados PVS (80,5 %), PVY (55 %) y PLRV (5,5 %); mientras que PVX no fue encontrado con esta prueba. La comparación de estas técnicas mediante la razón de prevalencia (RP), indicó que la RT-qPCR ofrece niveles superiores de detección con valores de RP = 1,6 y RP = 7,5 para los virus PVY y PLRV; mientras que para PVS la ELISA detectó más muestras positivas que RT-qPCR (RP = 3,22), evidenciándose la necesidad de diseñar nuevos cebadores ajustados a la diversidad de este virus en Antioquia. La coinfección mixta más frecuente fue PVY-PYVV-PVX (22,2 %), mientras que los cinco virus se encontraron en el 11,1 % de las muestras. Finalmente, utilizando secuenciación Sanger de la cápside y NGS para los genomas completos, se confirmó la circulación de todos los virus detectados en los cultivos de papa del oriente Antioqueño. Estos resultados señalan la necesidad de fortalecer los programas de manejo integrado de enfermedades virales en Antioquia.

ABSTRACT Viral diseases are one of the main phytopathological problems affecting potato crops worldwide. To determine the most prevalent viruses in potato var. Diacol Capiro crops in Eastern Antioquia, 36 leaf samples were tested for the presence of PVY, PVA, PVV, TaLMV, PVS, PLRV, PYVV, PVX, ToRSV and PMTV using RT-qPCR. Detected viruses included PVY, PVX, PYVV, PLRV and PVS with prevalence levels of 88.9 %, 75.0 %, 75.0 %, 41.7 % and 25.0 %, respectively. PVS, PVY, PLRV and PVX were also tested by ELISA. PVS, PVY and PLRV tested positive in 80.5 %, 55.0 % and 5.5 % of samples; PVX was not detected. Prevalence Ratios (PR) suggests that detection is higher for PVY (PR = 1.6) and PLRV (PR = 7.5) using RT-qPCR. ELISA worked better for PVS with a PR of 3.2; this result suggests that the RT-qPCR primers used for PVS must be adjusted to reflect the genome diversity of virus in Antioquia. The most frequent coinfection was PVY-PYVV-PVX, which occurred in 22.2 % of samples; coinfection with PVY, PVX, PYVV, PLRV and PVS was present in 11.1 % of samples. The circulation of these viruses in Eastern Antioquia was further confirmed using Sanger and high-throughput sequence. This work highlights the need to strengthen integrated disease management programs of viruses in Antioquia.

Design of primers for specific detection of Potato Virus Y (PVY) by RT-PCR

RESUMEN El Potato virus Y (PVY) es uno de los virus más limitantes para la producción de papa (Solanum tuberosum y S. phureja) en el mundo. Este virus es transmitido por tubérculo-semilla de papa y por diferentes especies de áfidos. Para su manejo es fundamental la siembra de tubérculos certificados por su sanidad viral, para lo que se requieren metodologías de detección altamente sensibles como ELISA y RT-PCR. Para éstas últimas pruebas, es necesario disponer de cebadores específicos que permitan el diagnóstico del virus en tejidos asintomáticos. En este estudio se reportan los cebadores PVY_Col para la detección del PVY en RT-PCR convencional y en tiempo real (RT-qPCR). Estos cebadores fueron diseñados con base en las secuencias de este virus que se han reportado en Colombia sobre diferentes hospedantes, así como de las diferentes variantes encontradas en el mundo. Una particularidad adicional de estos cebadores es que no presentan reacción cruzada con el genoma del Potato virus V (PVV), otro potyvirus que recientemente se ha encontrado afectando cultivos de papa en Colombia. Se espera que los cebadores PVY_Col sean utilizados para apoyar los programas de certificación de material de siembra de papa, así como para adelantar estudios epidemiológicos y de manejo fitosanitario de este virus.

ABSTRACT Potato virus Y (PVY) is one of the most limiting viruses in the production of potato (Solanum tuberosum and S. phureja) worldwide. This virus is transmitted by aphids and infected tuber-seeds, and for this reason, disease management of PVY requires, among others, using certified planting material through highly sensitive techniques such as ELISA and RT-PCR. However, RT-PCR-based methods require primers of high specificity to allow the unequivocal detection of viruses in asymptomatic tissues. In this work, we report a new set of primers (PVY_Col) for detection of PVY by RT-PCR and real-time RT-PCR (RT-qPCR). These primers were designed using sequences of PVY isolates from Colombia and the rest of the world. An essential feature of these primers is their specificity, since they don't amplify templates from Potato virus V (PVV), a close PVY relative that also infects potato crops in Colombia. It is expected that the PVY_Col primer set will be useful to support potato seed certification programs, epidemiological studies, and PVY disease management programs.