ELKIN LÓPEZ^1,4, GUSTAVO LÓPEZ² y SERGIO ORDUZ^3,4

¹ Natural Control Ltda. La Ceja, Antioquia, Colombia, Km 3 vereda San Nicolás, Tel.: (574) 5536232, Correo electronico: elopez34@gmail.com. Autor para correspondencia.

² Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad CES; Instituto Colombiano de Medicina Tropical ICMT, Medellín Colombia.

³ Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín, Colombia.

⁴ Unidad de Biotecnología y Control Biológico, Corporación para Investigaciones Biológicas, Medellín, Colombia.

La garrapata Boophilus microplus (Canestrini, 1887) es considerada como uno de los más importantes ectoparásitos del ganado bovino en los países tropicales debido a los daños directos que ocasiona y a los agentes infecciosos que transmite y que causan enfermedades como anaplasmosis y babesiosis (da Guedes et al. 2000; Costa et al. 2002). Las garrapatas se encuentran distribuidas en diferentes zonas en todo el mundo pero es principalmente en Centro y Sur América y el occidente de África donde generan las más grandes pérdidas económicas, que en años anteriores fueron calculadas entre US$ 13.900 y 18.700 millones debido a que causan disminución en la producción de leche y carne, mortalidad del ganado, sin considerar el costo derivado de su control (Bittencourt et al. 1997; Kaaya y Asan 2000).

El control de las garrapatas se realiza comúnmente mediante acaricidas, pero por el desarrollo de resistencia (Rodriguez- Vivas et al. 2006), por la demanda de alimentos libres de residuos químicos y por el cuidado del ambiente, se sugiere la utilización de sistemas alternativos de control entre los que se pueden contar el empleo de nemátodos (Hill 1998), vacunas (Jonsson et al. 2000; Ruiz et al. 2007), bacterias (Hassanain et al. 1997)., aceites esenciales (Prates et al. 1998) y hongos entomopatógenos como Beauveria bassiana (Bals. Vuill, 1806) y Metarhizium anisopliae (Metschnikoff ,1879, Sorokin, 1883). Se ha reportado que estos hongos causan mortalidad en garrapatas adultas, a la vez que disminuyen su fecundidad (Bittencourt et al. 1997; Zhioua et al. 1997; Barcelos et al. 1998; Kaaya 2000; Guedes et al. 2000; Kaaya y Asan 2000; Benjamín et al. 2002; da Costa et al. 2002).

M. anisopliae es un hongo Deuteromycete, patógeno generalista que ataca un diverso grupo de insectos (Benjamín et al. 2002; Quesada-Moraga et al. 2004). Este hongo invade el cuerpo del artrópodo hospedero a través de la cutícula y posteriormente se reproduce en él, favoreciendo así la transmisión horizontal del hongo y además puede tener efecto sobre la reproducción del organismo que está siendo atacado (Quesada- Moraga et al. 2004). M. anisopliae ha sido utilizado comúnmente para el control de insectos entre los que se destacan hormigas, termitas, langostas y cucarachas entre otros, y también se ha usado para el control de ácaros y garrapatas (Souza et al. 1999; Bittencourt 2000; Kaaya y Asan 2000; López y Orduz 2003).

El objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto patógeno de M. anisopliae sobre diferentes estados de desarrollo de la garrapatas B. microplus mediante bioensayos en el laboratorio y pruebas en campo, utilizando ganado y pasto naturalmente infestados.

Cepas de hongos. Se utilizaron las cepas 77, 81, 94, 95, 115, 136 y 137bm de M. anisopliae que hacen parte de la colección de hongos de la Unidad de Biotecnología y Control Biológico de la Corporación para Investigaciones Biológicas (CIB). Los hongos se cultivaron en agar papa dextrosa (PDA) y se incubaron a 26ºC por dos semanas. Las conidias de los hongos se cosecharon por lavado de la superficie del medio de cultivo con agua destilada estéril (Gindin et al. 2000).

Bioensayos en laboratorio. Se recolectaron garrapatas teleoginas B .microplus de vacas Holstein en el centro de acopio de ganado en la ciudad de Medellín, Colombia. Grupos de 10 garrapatas fueron lavadas, pesadas y posteriormente sumergidas durante tres minutos en suspensiones de conidias de cada cepa de M. anisopliae con un rango de concentración entre 103 y 109 conidias/ml. Posteriormente, las garrapatas se colocaron en cajas de Petri e incubaron a 26ºC, 85-90% de humedad y fotoperíodo luz: oscuridad 12:12 horas por 21 días para permitir la ovoposición. Los huevos se recolectaron, pesaron e incubaron bajo las mismas condiciones para permitir la eclosión larvaria. Las garrapatas control se trataron con agua destilada estéril e incubaron bajo las mismas condiciones. Se registró la infección producida por el hongo en las garrapatas y el peso de los huevos ovipositados y posteriormente se registró el porcentaje de eclosión larvaria (Bittencourt et al. 1997; Zhioua et al.1997; da Costa et al. 2002).

También se realizaron bioensayos con larvas de B. microplus obtenidas de teleoginas que se incubaron como se mencionó anteriormente. Las larvas se trataron con conidias de cada una de las cepas de M. anisopliae en un rango de concentración entre 103 y 109 conidias/ml. Se agregaron 3 ml de las suspensiones de conidias en cajas de petri con círculos de papel filtro. Posteriormente, se depositaron entre 300 y 500 larvas de 11 a 21 días de nacidas, se cubrieron con otro círculo de papel filtro y se agregaron nuevamente 3 ml de las suspensiones de conidias de M. anisopliae. Se incubaron por 3 min a temperatura ambiente y después las larvas se colocaron en tubos de ensayo cerrados con tapones de algodón e incubadas a 26ºC, 85-90% de humedad por 10 días. Las larvas del grupo control se trataron con agua destilada estéril. Se evaluó la mortalidad larvaria de acuerdo con la técnica descrita por Souza et al. (1999) y Chagas et al. (2003).

Ensayos en campo. Se utilizó la cepa 137bm de M. anisopliae debido a que en los ensayos de laboratorio demostró una la mayor patogenicidad para las garrapatas que las otras cepas. M. anisopliae cepa 137bm fue producido por una empresa dedicada a la comercialización de microorganismos para control biológico y la formulación de las conidias incluye lactosa, talco y goma xantan. El ensayo se realizó en una finca situada a 1600 msnm en el municipio de Barbosa, 50 km al norte de Medellín, Colombia, con una temperatura promedio de 26ºC y una humedad relativa entre 65-75%.

En la prueba se utilizaron 20 vacas del cruce Holstein x Cebú distribuidas en dos grupos de 10 animales cada uno. Un grupo de vacas fue bañado con una suspensión acuosa de conidias de M. anisopliae cepa 137bm a una concentración de 1x108 conidias/ml. Se aplicó 1 litro de la suspensión de conidias por cada 100 kg de peso del animal. El otro grupo de vacas sirvió como control y se utilizó solamente agua en la misma cantidad que el grupo tratado con el hongo. La elección de la dosis utilizada en estas pruebas se hizo teniendo en cuenta los buenos resultados con esta concentración en pruebas de laboratorio y por el costo del tratamiento de un producto comercial.

Las aplicaciones se hicieron en tres ocasiones con una bomba de aspersión, con intervalos de una semana y se continuó el monitoreo por tres semanas después de la última aplicación. El seguimiento del experimento se realizó mediante el recuento semanal de garrapatas adultas con un tamaño superior a 4 mm en cada uno de los animales. Después de 48 horas de las aplicaciones de M. anisopliae, de cada una de las vacas se recolectaron garrapatas que fueron llevadas al laboratorio para determinar el peso de los huevos ovipositados y el porcentaje de eclosión larvaria. Los especimenes recogidos se trataron de igual forma como se mencionó en los bioensayos en laboratorio.

El hongo M. anisopliae cepa 137bm se aplicó también en el pasto (pradera) en parcelas de 9 m2 con una dosis de 5x1012 conidias/ha. Se utilizó un potrero distinto al experimento con vacas y libre de ganado. Las aplicaciones y evaluaciones se hicieron en las mismas fechas en que se hizo el experimento con los bovinos. Se determinó el número de larvas de garrapatas en las parcelas contabilizando las larvas que se adherían a una tela blanca de 1 m2 que se extendió sobre el pasto tres veces durante tres minutos en cada visita (Benjamín et al. 2002). Una parcela de igual tamaño que la anterior donde se aplicó solamente agua sirvió como control. Durante el período de observación no se permitió al ganado pastorear en esas parcelas.

Análisis de datos. Se obtuvieron índice de producción de huevos (IPH= peso postura/peso inicial de garrapatas) y eficiencia reproductiva (ER= IPH x % eclosión larvaria) (Bittencourt et al. 1994a; 1997). Los datos fueron sometidos a análisis de varianza y a la prueba de Tukey para determinar diferencias significativas entre tratamientos y controles. En los ensayos con larvas en laboratorio se determinó la concentración letal media (LC50) usando el programa Probit.

Bioensayos en laboratorio. En todas las concentraciones utilizadas se observó esporulación del hongo M. anisopliae sobre las garrapatas tratadas siete días después de la inoculación. M. anisopliae causó disminución en el IPH y en la ER de las garrapatas cuando se aplicó cualquier cepa y en todas las concentraciones usadas, con diferencias estadísticamente significativas respecto al grupo control (Tabla 1). La cepa 137bm causó la más alta IPH llegando a ser entre las dosis 1x106 y 1x109 conidias/ml de hasta 22 veces menor que en el control. Además, mientras que el valor de ER en el grupo control fue cercano al 50%, en el grupo tratado con la cepa 137bm en las dosis 1x108 y 1x109 conidias/ml, estuvo por debajo del 0,1% (Tabla 1). La eclosión larvaria a partir de huevos que procedían de las garrapatas tratadas también disminuyó con la aplicación de todas las cepas y dosis, pero, particularmente con la cepa 137bm con la que la eclosión de larvas fue de 1,67% y 0,5% en las dosis 1x108 y 1x109 conidias/ml respectivamente, mientras que en el grupo control el porcentaje de eclosión fue del 97,5% (Tabla 2).

En los bioensayos con larvas de garrapata se encontró una alta susceptibilidad de las larvas a todas las cepas de M. anisopliae y se determinó que las cepas 81, 94, 95 y 136 fueron las más efectivas para matar larvas de garrapata y presentaron una concentración letal media (CL50) en un rango entre 1,57x104 y 6,33x104 conidias/ml (Tabla 3).

Ensayos en campo. Los datos de la semana uno corresponden a la población natural de garrapatas teleoginas o larvas de garrapata en las vacas o en el pasto, respectivamente. Después de las aplicaciones de M. anisopliae cepa 137bm se observó una disminución del 75% en la infestación de garrapatas en los animales del grupo tratado, con diferencias estadísticamente significativas, entre los datos, a partir de la tercera semana (después de dos aplicaciones) y del inicio del experimento (Tabla 4).

En el grupo de vacas control se presentó un aumento en la infestación de garrapatas durante el mismo periodo (Tabla 5). Además, la cepa 137bm M. anisopliae causó una disminución de oviposición y eclosión de larvas provenientes de vacas tratadas por lo que los valores de IPH y ER son de tres y dos veces menores que en el control, con diferencias estadísticamente significativas, después de la segunda y tercera aplicación del hongo, respectivamente (Tabla 5).

En el experimento en pasto el efecto biocontrolador de M. anisopliae fue menos notorio debido a que tanto en la parcela tratada como en el control hubo una disminución en la población de larvas garrapata durante el tiempo de evaluación. De manera que en la segunda semana del experimento en pasto, después de la primera aspersión con las conidias de M. anisopliae, se encontró una reducción del 87% de la población de larvas de garrapata (Tabla 4). Mientras que en el control solo se presentaron diferencias significativas respecto al recuento inicial, hasta cuatro semanas después de haber iniciado el experimento (Tabla 4).

M. anisopliae presentó una alta capacidad para atacar las garrapatas, puesto que aun en las concentraciones más bajas utilizadas afectó diferentes estados de desarrollo de este ectoparásito sobre los bovinos o en el pasto. Además, M. anisopliae causó disminución en la oviposición de garrapatas provenientes de vacas tratadas y en la eclosión larvaria, lo que podría ser interpretado como la transmisión vertical del efecto controlador del hongo a la descendencia del artrópodo. Resultados similares han sido demostrados en otros estudios de control de garrapatas (Bittencourt et al. 1994a, 1994b; Barcelos et al. 1998; Bittencourt 2000; Kaaya 2000; Guedes et al. 2000; Quesada-Moraga et al. 2004). El efecto de transmisión vertical de M. anisopliae ha sido estudiado en cucarachas, en las que se encontró disminución cercana al 50% en la producción de huevos y en la eclosión de ninfas cuando los adultos fueron tratados con la cepa EAMa01/121-Su (Quesada-Moraga et al. 2004).

Los resultados de laboratorio pudieron ser extrapolados a la prueba de campo que se realizó con la cepa 137bm, aunque los cambios en los resultados de IPH, ER y eclosión no tuvieron la misma intensidad de los ensayos de laboratorio posiblemente debido a que las conidias del hongo se vieron afectadas por condiciones ambientales como la intensidad solar y la lluvia.

M. anisopliae causó una disminución en la infestación de garrapatas en el ganado y en el pasto. Este efecto controlador de M. anisopliae sobre las garrapatas se conservó en el ganado tratado durante dos semanas después de la última aplicación. Resultados similares fueron observados en un trabajo previo donde el efecto de las conidias de los hongos B. bassiana y M. anisopliae persistieron entre una a tres semanas en las orejas del ganado después de la aplicación (Kaaya et al. 1996).

De acuerdo con los datos de IPH, ER y el porcentaje de eclosión larvaria, no se presentaron diferencias significativas entre el grupo de vacas tratadas y el control cuando se aplicó M. anisopliae la primera vez, pero después de la segunda y de la tercera aplicación del hongo sobre las vacas se encontró reducción de los parámetros en el grupo de animales tratados, situación que sugiere que una sola aplicación no es lo suficientemente efectiva, por lo que se deben realizar aplicaciones periódicas de hongos en un esquema similar al que se hace cuando se aplican productos químicos. Además, la aplicación de M. anisopliae también debe realizarse en el pasto donde se encuentran las larvas de garrapatas con el fin de disminuir la posibilidad de una nueva infestación en el ganado, ya que se conoce que las larvas son altamente susceptibles a la acción del hongo, como se logró comprobar en este trabajo.

A pesar de que en el experimento de campo en la parcela control hubo disminución en la población de garrapatas, ésta sólo presentó diferencias significativas respecto a la población inicial de larvas a partir de la cuarta semana del experimento mientras que en el lote tratado la disminución se dio una semana después. Además, el experimento de campo fue realizado durante octubre y noviembre de 2003 que estuvieron entre los meses más lluviosos del año con 202 y 156 mm, y 21 y 14 días de lluvia en el mes, respectivamente (Datos obtenidos del Instituto de Estudios Ambientales de Colombia IDEAM). Esta precipitación puede tener dos efectos, el primero es mantener una alta humedad en el ambiente lo que favorece la germinación de las conidias de M. anisopliae y promueve el proceso de infección (Luz y Fargues 1997), pero por otro lado puede causar disminución de la población de larvas del pasto por lavado, tendencia que se observó en el grupo control.

Este proyecto se desarrolló con el apoyo financiero de Colciencias, Corporación para Investigaciones Biológicas y la Empresa Colombiana de Productos Veterinarios, Vecol S.A.

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Recibido: 28-oct-2008 - Aceptado:10-mar-2009