JOHANNA ANDREA OBANDO B.¹, ALEX ENRIQUE BUSTILLO P.², ULISES CASTRO V.³ y NORA CRISTINA MESA C.⁴

¹ Ing. Agr., M. Sc. Centro de Investigación de la Caña de Azúcar de Colombia, Cenicaña - Universidad Nacional de Colombia sede Palmira, Estudiante de Maestría, jaobandob@gmail.com.
² Ing. Agr., Ph. D., Centro de Investigación de la Caña de Azúcar de Colombia, Cenicaña, Florida, Valle del Cauca. alexe. bustillo@gmail.com.
³ Ing. Agr., M. Sc. Centro de Investigación de la Caña de Azúcar de Colombia, Cenicaña, Florida, Valle del Cauca. ucastro@cenicana.org. Autor para correspondencia.
⁴ Biol., Ph. D. Profesora Asociada, Universidad Nacional de Colombia, sede Palmira, Valle del Cauca, ncmesac@palmira.unal.edu.co.

Recibido: 26-abr-2012 - Aceptado: 22-abr-2013

Las especies del género Aeneolamia (Hemiptera: Cercopidae) presentan una amplia distribución, se registran desde México hasta Argentina (Sotelo y Cardona 2001). Sin embargo, Aeneolamia varia (Fabricius, 1787) solo se ha registrado en Trinidad y Tobago y Venezuela (Linares y Pérez 1985). La presencia de A. varia en Colombia data de hace más de 40 años, cuando se encontró en cultivos de pastos en los Llanos Orientales (Posada 1989; Peck 2001, 2002). En el 2007, se detectó en cañaverales del valle del río Cauca, infestando cerca de 20.000 ha, en una zona comprendida entre Yotoco y Tuluá, que causó una gran alarma entre los cultivadores de caña de azúcar (Gómez 2007). En labores de reconocimiento de esta plaga se pudo demostrar que A. varia está muy distribuida en aéreas no cultivadas con caña, en la zona de la cordillera occidental en cultivos de pastos para ganadería. Este salivazo ha continuado su dispersión en cultivos de caña y en 2011, se encontró en predios de Bugalagrande. Es posible que en poco tiempo, colonice gran parte de la zona productora de caña de azúcar del Valle del Cauca.

El daño de A. varia se produce cuando el adulto se alimenta de las hojas y causa una reacción caracterizada por bandas rojizas necróticas longitudinales (Gómez 2007). Las ninfas succionan la savia del xilema de las raíces superficiales y causa el marchitamiento de la planta. La presencia de ninfas en el suelo se reconoce porque alrededor de las plantas de caña y en algunos casos en la base del tallo, éstas secretan y se recubren de un líquido baboso y espumoso de diferentes tamaños. Los lotes de caña con altas infestaciones, muestran una coloración amarillosa al observarlas de lejos, y las plantas presentan una sintomatología similar a la quemazón causada por herbicidas (Bustillo y Castro 2011).

Varias especies de salivazos se presentan en diferentes países causando pérdidas económicas al cultivo de la caña de azúcar. En México, una especie de Aeneolamia, causa reducciones entre 3 y 6 t/ha (Flores 1996) y en Guatemala las pérdidas se estiman en 11 t/ha y 12,76 kg de azúcar/t (Carrillo 1993). En Venezuela se estima que un daño severo de A. varia en cañas de 6 a 9 meses de edad, puede reducir en 25% los rendimientos de azúcar (Salazar y Proaño 1989). En Colombia aún no se conoce el impacto real de A. varia en los rendimientos de la caña de azúcar.

En países como Brasil, Costa Rica, Guatemala, Panamá y Venezuela, varias especies de salivazos se combaten con aplicaciones periódicas de productos comerciales basados en el hongo Metarhizium anisopliae (Metsch., 1879) Sorokin 1883 (Alves 1986; Allard et al. 1990; Salazar y Badilla 1997; Almeida et al. 2003; Batista et al. 2003; Torres de la Cruz et al. 2006). En Colombia, se han realizado estudios de eficacia de M. anisopliae para el control de los salivazos asociados con el pasto braquiaria, encontrando cepas de M. anisopliae capaces de producir mortalidades entre 62,0 y 95,1% (Morales et al. 2001).

Los salivazos infectados por el hongo M. anisopliae muestran crecimiento micelial sobre el cuerpo, el cual se torna más tarde de color verde. El proceso de infección en el insecto se da cuando las ninfas o los adultos entran en contacto con las conidias del hongo, las cuales son capaces de germinar en condiciones de alta humedad y penetrar el cuerpo del salivazo en un periodo de pocas horas. Luego, invaden la cavidad hemocélica y producen toxinas que matan el salivazo. Al cabo de 3 a 4 días, se observan los primeros signos del hongo en forma de un micelio de color blanco sobre el cuerpo, que más tarde lo cubre y al producirse las conidias le dan la coloración verdosa al cadáver del salivazo, característico de este hongo (Bustillo et al. 2011).

El propósito de este estudio, fue evaluar y comparar la eficacia de cepas nativas y de colección de M. anisopliae en el control de A. varia.

Área de estudio. Esta investigación se realizó en un laboratorio de Entomología ubicado en el Sena de Buga, Valle del Cauca, Colombia, que presenta una temperatura media de 24,5 ± 0,5 °C y humedad relativa en el laboratorio de 78,8 ± 1,7%.

Aislamientos de M. anisopliae. Se evaluaron cepas de M. anisopliae aisladas de muestras de suelo provenientes de los departamentos de Santander (Oiba) y Valle del Cauca (Buga y Tuluá) utilizando larvas de G. mellonella como cebo en muestras de suelo (Bedding y Akurst 1975; Chandler et al.1997) y también de insectos con signos de infección (Almeida et al.1997). Además, se incluyeron cinco cepas (CCMa0801, CCMa0802, CCMa0803, CCMa0906, CCMa0907) de la Colección del Laboratorio de Entomología de Cenicaña, con actividad al salivazo Zulia carbonaria (García et al. 2012); dos cepas, una donada por CIAT (CIAT054) y otra por Cenicafé (CeMa9236); cinco formulaciones comerciales y una cepa no formulada, proveniente de una casa comercial (MaSMT).

Reactivación de las cepas y mantenimiento del cultivo. Se infectaron adultos y ninfas de A. varia con las cepas a evaluar, para posteriormente tomar inoculo del hongo del cuerpo del insecto y obtener un crecimiento en medio de cultivo enriquecido con integumento del salivazo, y así producir el inoculo necesario en los diferentes experimentos. Se siguió metodología estandarizada para Z. carbonaria por García et al. (2012) y para otros insectos (Bernal et al. 1994; Bustillo et al.1997; González et al. 1993, 2001; Marín y Bustillo 2002).

Caracterización macroscópica. Los hongos se sembraron en cajas Petri con medio SDA. Se incubaron a 26 ºC por 15 días, durante los cuales se observó el color de las colonias, aspecto, superficie y crecimiento para su identificación (Barnett y Hunter 1998). Se utilizó la tabla Munsell para describir el color y se determinó el tipo de crecimiento (Carmichael 1980; Padilla et al. 2000; Arenas 2009). El ensayo se realizó bajo un diseño completamente aleatorio, con seis repeticiones por cepa.

Tasa de crecimiento. Para determinar esta tasa, se tomó una muestra de 10 µl de cada una de las cepas de los hongos que contenían 1 x 106 conidias/ml. Esta muestra se sembró en un disco de papel filtro de 0,5 cm de diámetro, ubicándola en el centro de una caja Petri con medio SDA y se incubó a 26 °C. El desarrollo de las cepas de los hongos, se estimó midiendo el diámetro a los 5, 10, 15 y 20 días, después de la inoculación (Parker et al. 2003). Para cada cepa se utilizaron cinco repeticiones bajo un diseño experimental completamente aleatorio.

Producción de conidias. De cada una de las cajas Petri de 20 días de desarrollo obtenidas para la evaluación de la tasa de crecimiento, se extrajo cuatro discos de 0,5 cm de diámetro y se mezclaron en 10 ml de Tween 80 al 0,01% estéril. Se contabilizó en cámara de Neubauer el número de conidias (Vélez et al. 1997; Marín y Bustillo 2002; Parker 2003) y se prepararon suspensiones seriadas hasta 10-3. Para estimar la concentración de esporas se contaron cinco cuadros del cuadrante central de la cámara (Vélez et al. 1997). El experimento se organizó bajo un diseño experimental completamente aleatorio con cinco repeticiones por cepa. La variable de respuesta fue el número de conidias/ml.

Germinación de conidias. La germinación se evaluó utilizando cajas Petri, en las cuales se marcaron en la superficie interna inferior cinco puntos. Luego se vertieron 10 ml de agar - agua al 1,5%. En cada punto se sembró 5 µl de la dilución 10-2 de la cepa a evaluar. Las cajas se incubaron a 26 °C durante 24 h y se agregó una gota de azul de lactofenol a cada sito sembrado con el hongo, para detener su desarrollo. Posteriormente, se cortó esta muestra y se observó al microscopio. Se contó mínimo 100 conidias por punto de crecimiento, considerando como conidia germinada aquella cuyo tubo germinativo sobrepasó el doble del diámetro mayor de la conidia (Marín y Bustillo 2002). Se registró el número de conidias germinadas y no germinadas. Se utilizaron de cinco alícuotas por caja por cinco submuestras, bajo un diseño estadístico completamente aleatorio.

Preselección de cepas de M. anisopliae por virulencia a adultos de A. varia. Doce cepas nativas se evaluaron por virulencia a adultos de A. varia, en tres bioensayos independientes bajo condiciones de laboratorio. Cada bioensayo se organizó con cuatro cepas de hongos, ocho repeticiones por tratamiento y un control, utilizando la metodología del cilindro de acetato de Aleán (2003), modificada por García et al. (2012). En el interior del cilindro se colocó una planta de braquiaria, infestada con tres adultos tenerales (< 24 horas de edad) de A. varia. Luego, se asperjaron con 15 ml de una suspensión de 1x107 conidias/ml de cada uno de los hongos a evaluar, usando un atomizador manual previamente calibrado. El experimento se organizó bajo un diseño completamente aleatorio, en donde los tratamientos fueron las cepas de los hongos, con ocho repeticiones por tratamiento y un control absoluto sin aplicación. La variable de respuesta fue la mortalidad de los adultos por los hongos, la cual se evaluó hasta seis días después de aplicado los tratamientos.

Evaluación de formulaciones comerciales de M. anisopliae enadultos de A. varia. Se evaluaron cinco formulaciones comerciales y la cepa CeMa9236 como testigo. Las unidades experimentales y la dosis, fueron las mismas usadas en el experimento anterior. Se registró la mortalidad durante seis días bajo un diseño completamente aleatorio con ocho repeticiones por tratamiento. El control de calidad de estas formulaciones se llevó a cabo por el Laboratorio "Control de Bioinsumos" localizado en Cenicafé (Marín y Bustillo 2002).

Selección de cepas de M. anisopliae sobre adultos de A. varia. Basados en los ensayos de preselección, se escogieron las cepas nativas y la formulación comercial de mayor eficacia sobre adultos de A. varia. La unidad experimental y la dosis aplicada fue la misma descrita en la etapa de preselección. Se registró la mortalidad durante seis días bajo un diseño completamente aleatorio con seis repeticiones por tratamiento, incluyendo un control. El experimento se replicó tres veces en el tiempo bajo las mismas condiciones.

Selección de cepas de M. anisopliae sobre ninfas de A. varia. Se sembraron plantas de caña variedad CC 85-92 en tubos de poli vinil cloruro o PVC de 7 cm de diámetro y 7 cm de largo, con tapa del mismo material de 4 cm de alto y 6 cm de diámetro, y se infestaron con 12 huevos de A. varia S4 (cercanos a la eclosión) cuando tuvieron un volumen considerable de raicillas secundarias (Cuarán et al. 2012). A ocho días después de la eclosión, se realizó una aplicación a la rizósfera de 4 ml de una mezcla de la suspensión 1x109 conidias/ml del hongo y 2 µl de Carrier® utilizando un atomizador manual calibrado. Las evaluaciones se realizaron cada dos días después de la aplicación y se registró el número de ninfas vivas, muertas y adultos emergidos. Las evaluaciones finalizaron cuando las ninfas sobrevivientes alcanzaron el estado adulto. El diseño experimental fue completamente aleatorio con seis repeticiones y un control. Las condiciones en el invernadero fueron de 26,6 ± 0,85 °C y 74,7 ± 0,47% de HR.

Los datos de todos los experimentos se analizaron mediante un análisis de varianza y las diferencias entre tratamientos con la ayuda de la prueba de Tukey (P = 0,05).

Aislamientos de M. anisopliae. El método del insecto trampa usando larvas de G. mellonella en muestras de suelos de caña panelera resultó ser muy útil para obtener aislamientos de M. anisopliae, se lograron obtener 12 de los 14 aislamientos. Los dos restantes se obtuvieron a partir de insectos con micosis.

Reactivación del hongo. Se reactivaron 22 cepas de M. anisopliae (14 obtenidas en este estudio, 5 aisladas previamente y 3 cepas de referencia) todas patogénicas a A. varia, pero solo 13 de ellas esporularon en el 60% a 80% de la población tratada con el hongo. Debido a esto se incluyeron en las pruebas de preselección por virulencia a adultos de A. varia. Este grupo se denominó Grupo de Prueba de Virulencia" (Tabla 1).

Caracterización macroscópica. Los colores de las cepas variaron desde amarillo pasando por verde olivo, hasta verde grisáceo oscuro, en concordancia con las descripciones de Arenas (2009) para varias cepas de M. anisopliae. En el envés de la colonia del hongo, se observaron coloraciones amarillas, anaranjadas, rosadas y rojo carmesí, de acuerdo con lo observado por Guerrero et al. (1999).

Tasa de crecimiento. La cepa CCMa1009 presentó el menor desarrollo y fue diferente significativamente (P < 0,001) del resto del grupo. La cepa CCMa0803 tuvo un mayor crecimiento (Tabla 2), sin embargo al observar su crecimiento y virulencia, se encontró que solo causó una mortalidad de 29,2% sobre A. varia (Tabla 3). En este estudio no se pudo establecer ninguna concordancia entre el desarrollo in vitro del hongo y su virulencia, algo que también ha sido encontrado por Padilla et al. (2000), y Chan-Cupul et al. (2010), aunque está en contraposición con otros estudios (Heale et al. 1989; Montesinos 2008).

Producción de conidias. Las cepas CCMa1005, MaSMT (de referencia) y la CCMa0801, produjeron más conidias 16,0; 13,0 y 12,0 x 107 conidias/ml, respectivamente, presentando diferencias estadísticas altamente significativas (P < 0,0001) con el resto del grupo (Tabla 2). No se encontró ninguna correlación entre estos valores y la tasa de crecimiento (Tabla 2), lo cual está acorde con los resultados de Padilla et al. (2000).

Germinación de conidias. Todas la cepas mostraron una germinación mayor al 90% (Tabla 2); característica deseable, debido a que las conidias de los hongos entomopatógenos deben presentar un rápido desarrollo del tubo germinativo, para acelerar el proceso infectivo y disminuir el tiempo de exposición a factores adversos como la radiación UV y humedad cuando son aplicadas en campo (Hajek y St. Leger 1994; Goettel e Inglis 1997).

Preselección de cepas de M. anisopliae por virulencia a adultos de A. varia. Se registraron valores diferentes para cada uno de los bioensayos. En el primero, todas las cepas causaron mortalidades superiores al 80% de la población tratada; en el segundo, se registraron mortalidades menores al 60%; y en el tercer bioensayo, las cepas exhibieron mucho menos virulencia, tres de las cuatro cepas causaron mortalidades por debajo 40%, y solo la cepa MaSMT alcanzó una mortalidad del 62,5% (Tabla 3). Cuando se comparó la producción de esporas con la virulencia de las cepas CCMa0801, CCMa1005 y MaSMT, no se estableció una correlación clara. Narváez (1996) y Padilla et al. (2000) afirman que la alta producción de esporas no está asociada a mayor virulencia. Las características fisiológicas de los hongos entomopatógenos no son determinantes para establecer su virulencia (Tabla 2). Factores como producción de proteasas, esterasas, quitinasas, lipasas y toxinas, son los que determinan la patogenicidad de un hongo entomopatógeno (Kershaw et al. 1999; St. Leger et al. 1986a, 1986b; Pal et al. 2007; Schrank y Vainstein 2010). La información lograda sobre patogenicidad y características fisiológicas, permitieron seleccionar las cepas de M. anisopliae: CCMa0906, CCMa1001, CCMa1005, CCMa1008 y las de referencia CIAT054, CeMa9236 y MaSMT, para los ensayos de selección final.

Evaluación de formulaciones comerciales de M. anisopliae sobre adultos de A. varia. La eficacia de las formulaciones comerciales de M. anisopliae sobre adultos de A. varia (Tabla 4), fue variable y la mortalidad fluctuó entre el 12,5 y 79,2%. El análisis estadístico detectó diferencias altamente significativas entre los productos evaluados (< 0,0001). La cepa de referencia CeMa9236, causó la mayor mortalidad sobre los adultos de A. varia (78,3%) y las formulaciones CoMa01 y CoMa02 alcanzaron mortalidades del 68,2% y del 54,6%, respectivamente (Tabla 4). CoMa01 presentó las mejores características microbiológicas (pureza, viabilidad y concentración de conidias). CoMa02 registró una mezcla de M. anisopliae y B. bassiana (Tabla 4), por la tanto su eficacia se le atribuye al sinergismo de los dos hongos; ya que B. bassiana, puede infectar hemípteros (Peñaranda et al. 1999; Ibarra- Aparicio et al. 2005; Marti et al. 2005). CoMa04 causó 26,1% de mortalidad, asociada a la presencia de contaminantes del género Aspergillus, que a pesar de ser saprófito se registra patogenicidad sobre Saccharicoccus sacchari Cockerell y Culex sp.(Toscano y Reeves 1973; Drummond et al. 1991). CoMa03 causo 4,5% de mortalidad atribuida a la no viabilidad de las conidias (0,08%). CoMa05 fue igual al testigo.

Selección de cepas de M. anisopliae sobre adultos de A. varia. En las pruebas de preselección se seleccionaron las cepas de referencia CIAT 054, CeMa9236 y MaSMT, las cepas nativas CCMa0906, CCMa1008, CCMa1005 y CCMa1001 y la formulación comercial CoMa01. El análisis estadístico no estableció diferencias significativas entre las tres réplicas (P = 0,57). CCMa0906, CCMa1005, CCMa1008 no presentaron diferencias significativas con las cepas de referencia CeMa9236 y CIAT054 (Tabla 5). Estas cepas son candidatas para pruebas posteriores en condiciones de campo con el fin de desarrollar una formulación dirigida a controlar poblaciones de A. varia presentes en caña de azúcar.

Selección de cepas de M. anisopliae sobre ninfas de A. varia. La virulencia del "Grupo de prueba de virulencia" sobre ninfas de A. varia en condiciones de invernadero, varió entre 27,1% y 75,7% de mortalidad (Tabla 6). Las cepas CCMa0906, CCMa1001, CCMa1005, CCMa1008 y la formulación comercial CoMa01, no presentaron diferencias estadísticas significativas (P < = 0,0001) con CIAT054 y CeMa9236. En la dosis aplicada se logró controlar entre 30% y 70%, esta mortalidad se considera alta, si se compara con otros estudios (Arango et al. 1994; Camó 1999). Aunque en este estudio se registraron mortalidades hasta del 70%, algunas investigaciones señalan que la saliva de las ninfas del salivazo puede ser una barrera para estos organismos. Las espumas de estos insectos están constituidas por proteínas surfactantes especializadas, que en sinergia con otras proteínas (glucopéptidos y proteoglicanos), dan estabilidad estructural y protección contra la actividad microbiana y ataques de parásitos (Mello et al. 1987; Cooper y Kennedy 2010). Para sobreponerse a esta barrera, es importante utilizar dosis adecuadas de conidias del hongo a utilizar con coadyuvantes que faciliten su penetración a través de la saliva y así facilitar el proceso infectivo.

Los resultados de este estudio permiten contar con una colección de nuevas cepas de M. anisopliae, caracterizadas macroscópica, fisiológica y patogénicamente, de las cuales CCMa0906, CCMa1005, CCMa1008 causaron las mayores mortalidades a los estados de ninfas y adultos de A. varia. La cepa CCMa1001, mostró bastante especificidad hacia el estado ninfal. Entre las formulaciones comerciales, CoMa01 fue la más eficaz en el control de A. varia. Este grupo de cepas seleccionadas se pueden evaluar para estudios de control de A. varia bajo condiciones de campo.

Al Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural de Colombia, por la cofinanciación a través del Convenio 141-2008P4896-4070. Al Dr. Carlos Moreno por su asesoría estadística, al Ing. Agr. Gerson Ramírez, por proporcionar los insectos utilizados en el estudio y al Práctico Agrícola Álvaro Tulio Urresti, por su ayuda en la logística de la investigación.

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