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Introducción
La producción agrícola y ganadera de la Orinoquía colombiana está afectada por la presencia de insectos plaga como la langosta llanera Rhammatocerus schistocercoides (Rehn, 1906) (Orthoptera: Acrididae) (Instituto Colombiano Agropecuario 2017) y Cerotoma tingomariana (Bechyné) (Coleoptera: Chrysomelidae) (León y Guevara 2006), los cuales influyen de manera negativa en cultivos de importancia económica del país. La langosta llanera es uno de los insectos plaga más importantes de la entomofauna en la altillanura colombiana por su alta densidad y comportamiento gregario (Ebratt et al. 2000) y afecta extensas áreas de sabana nativa, pastos mejorados y, potencialmente, cultivos como arroz, maíz, caña de azúcar y sorgo (Instituto Colombiano Agropecuario 2017). Esta plaga está ubicada principalmente en el departamento del Vichada en donde se alimenta de pasturas nativas, pero suele emigrar hacia el departamento del Meta (Contexto Ganadero 2017). Por otra parte, C. tingomariana es un insecto plaga de gran impacto económico el cual se ha convertido en la especie más limitante del cultivo de soya dentro del complejo de crisomélidos que lo afectan; ocasiona daños hasta del 40 % en el área foliar en el piedemonte llanero y en la altillanura del país. Su impacto se debe a su aparición frecuente, distribución y por causar mayores pérdidas en el rendimiento del grano cuando alcanza altos niveles poblacionales (León y Guevara 2006). Además, estos insectos provocan la reducción hasta de un 45 % en la fijación de nitrógeno en estos cultivos (Layton 1983) debido a que el estado larval se alimenta de nódulos y raíces (Texeira y Franco 2007).
El uso indiscriminado del control químico de plagas en el mundo ha direccionado el interés hacia la implementación de alternativas más seguras como el control biológico, mediante el uso de hongos entomopatógenos (Nava-Pérez et al. 2012). Se ha demostrado que Metarhizium spp. y Beauveria spp. ocasionan eficacias; satisfactorias y son candidatos viables como principio activo de micoinsecticidas que sirven para el control de plagas (Faria y Wraight 2007 Espinel Correal et al. 2018). Sin embargo, uno de los aspectos cruciales para la aceptación, adopción y comercialización de agentes de control biológico es la implementación de un sistema de control de calidad, que garantice la inocuidad y la eficacia en condiciones de campo. Este sistema debe ser implementado durante la producción del micoinsecticida como también en el producto final destinado para comercialización (Ravensberg 2011). De igual forma, el control de calidad debe ayudar a reducir los costos de producción, a maximizar los rendimientos, garantizar la seguridad del producto y a reducir los riesgos por fallas, lo cual genera confianza en los usuarios directos, en este caso el agricultor (Jenkins y Grzywacz 2000; Ravensberg 2011; Díaz et al. 2018).
En Colombia, la resolución 068370 de 2020 expedida por el Instituto Colombiano Agropecuario (ICA), establece los requisitos para registro y venta de bioinsumos. Esta resolución exige al fabricante contar con un área de control de calidad, la cual debe tener estandarizado los métodos microbiológicos, fisicoquímicos y biológicos para cada tipo de bioinsumo. A pesar de ser un requisito reglamentario, el fabricante de bioinsumos, debe desarrollar sus propios métodos de control de calidad de producto terminado, con el fin de asegurar la precisión y reproducibilidad en cada prueba, lo cual ha generado una gran diversidad de normas entre fabricantes de productos similares (Jenkins y Grzywacz 2000; Díaz et al. 2018).
Este control de calidad incluye análisis microbiológicos, fisicoquímicos y biológicos. Dentro de los análisis microbiológicos se encuentran la confirmación de la identidad, viabilidad y concentración del agente de control biológico y la pureza del producto final (Burges 1998). Para los análisis fisicoquímicos, se implementan de acuerdo con el tipo de formulación (sólida o líquida) (Jenkins y Grzywacz 2000). Para el análisis de actividad biológica, se involucra la estandarización de bioensayos para la evaluación de la eficacia del producto en condiciones controladas de laboratorio. Este último es la herramienta de mayor importancia en el control de calidad durante el desarrollo y producción de un micoinsecticida (Ravensberg 2011; Lacey 2012). Así pues, la evaluación de la actividad biológica en condiciones de laboratorio, es la única forma segura de validar su resultado y su acción en condiciones de campo (Díaz et al. 2018).
Existen numerosas pruebas disponibles para la evaluación de la actividad biológica; sin embargo, hay carencia de métodos estandarizados, aceptados y específicos para cada tipo de microorganismo (Ravensberg 2011; Shabana et al. 2003; Ugine et al. 2013). Una de las mayores dificultades en el proceso de estandarización de pruebas de actividad biológica es el establecimiento de las crías masivas de los insectos plaga bajo condiciones controladas, debido a varios factores, como su distribución en campo, comportamiento y ciclo de vida. Por ejemplo, la colecta de R. schistocercoides es difícil debido a su comportamiento migratorio; además, las condiciones ambientales son críticas para su desarrollo y su ciclo de vida dura un año (Ebratt et al. 2000). Asimismo, C. tingomariana es una plaga muy asociada al cultivo de la soya, que debido a su carácter rotacional (Valencia y Ligarreto 2010), no garantiza la consecución permanente y suficiente del insecto en los momentos requeridos. Además, no hay disponible una dieta artificial para esta especie de crisomélido.
Debido a los factores que dificultan el establecimiento de las crías masivas de estos insectos, para la evaluación de la actividad biológica de micoinsecticidas, el uso de insectos alternativos que cumplan ciertas características representa una ventaja deseable. Estos deben: tener ciclos de desarrollo corto (Cohen 2004), ser de fácil recolecta, desarrollar en dietas artificiales y las condiciones ambientales para su desarrollo y reproducción deben ser manejables (Portilla y Street 2006; Cohen 2004), y ser susceptibles a los hongos entomopatógenos en cuestión (Sewify et al. 2014). En la actualidad, la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (AGROSAVIA) cuenta con un laboratorio que ofrece, dentro de su portafolio de servicios, el control de calidad microbiológico y fisicoquímico de micoinsecticidas a base de los dos hongos objeto de estudio, pero aún no cuenta con los métodos para evaluar su actividad biológica. Por tal razón, y ante la necesidad de implementar una prueba biológica para el control de calidad de micoinsecticidas a base de Beauveria bassiana (Bals. Criv.) Vuill, 1912 (Ascomycota: Cordycipitaceae) y Metarhizium anisopliae (Metschn.,) Sorokin, 1883 (Ascomycota: Clavicipitaceae) contra los insectos blanco C. tingomariana y R. schistocercoides, respectivamente, se realizó un tamizaje para seleccionar insectos alternativos para evaluar la eficacia de estos microorganismos. Asimismo, se establecieron y estandarizaron los métodos para su evaluación en condiciones de laboratorio.
Materiales y métodos
Los bioensayos se realizaron en el Centro de Investigación (C.I.) Tibaitatá de AGROSAVIA (Mosquera, Cundinamarca, Colombia), en el Laboratorio de Microbiología Agrícola y se mantuvieron a 26 ± 5 °C y 45 ± 5 % de humedad relativa.
Insectos
Los insectos alternativos Diatraea saccharalis (Fabricius, sensu Guenée, 1862) (Lepidoptera: Crambidae), Spodoptera frugiperda (Smith y Abbot, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae) y Chloridea virescens (Fabricius, 1777) (Lepidoptera: Noctuidae) fueron suministrados por la Unidad de Crías del Laboratorio de Entomología de AGROSAVIA. Se mantuvieron bajo las condiciones experimentales descritas arriba.
Los insectos blancos se recolectaron en campo y, posteriormente, se identificaron usando las claves de Rehn (1906) y Riley et al. (2002) y se depositaron y registraron en la Colección Taxonómica Nacional de Insectos (CTNI) “Luis María Murillo” de Colombia. Las ninfas de R. schistocercoides [CTNI 2074] provinieron de pastos de sabana nativa ubicada en el municipio de Puerto López (Meta, Colombia) y los adultos de C. tingomariana [CTNI 224], se recolectaron en cultivos de soya (Glycine max (L.) Merr.), variedad Guayuriba ubicados en el C.I. La Libertad de AGROSAVIA, Villavicencio (Meta, Colombia). Estos insectos provenientes de campo se mantuvieron en cuarentena durante 15 días en jaulas entomológicas antes del montaje de los bioensayos, bajo las mismas condiciones experimentales descritas arriba.
Hongos entomopatógenos
Los aislamientos Bv060 de B. bassiana y Mt004 de M. anisopliae, se suministraron por el Banco de Germoplasma de Microorganismos de AGROSAVIA (BGM) y se cultivaron en Agar Papa Dextrosa (PDA) durante 12 días a 25 °C ± 1 °C (Tabla 1). Estos microorganismos están cobijados dentro del contrato de acceso a recursos genéticos No. 168 de 2017.
Tabla 1 Aislamientos entomopatógenos Bv060 de Beauveria bassiana y Mt004 de Metarhizium anisopliae evaluados en el presente estudio.
| Código | Especie | Hospedero de aislamiento | Lugar de Origen |
|---|---|---|---|
| Bv060 | Beauveria bassiana | Cerotoma tingomariana | Villavicencio (Meta, Colombia) |
| Mt004 | Metarhizium anisopliae | Ancognatha scarabaeoides (Erichson, 1847) (Coleoptera: Melolonthidae) | Rionegro (Antioquia, Colombia) (Espinel Correal et al. 1998) |
Evaluación de B. bassiana
Se determinó la actividad biológica del aislamiento Bv060 sobre el insecto blanco C. tingomariana y sobre los insectos alternativos C. virescens y D. saccharalis. Para ello, se realizó una aspersión sobre diez adultos de C. tingomariana con 450 µL de una suspensión del hongo ajustada a 1 x 107 conidios. mL-1; se usó un aerógrafo a una presión de 30 lb. Los insectos se ubicaron dentro de un recipiente plástico de 48 oz el cual contenía foliolos de soya para su alimentación, constituyendo una réplica. Lo mismo se hizo hasta completar tres réplicas por tratamiento y adicional se evaluó un tratamiento control (testigo absoluto). Se determinó la mortalidad cada tres días hasta el día noveno, post tratamiento. La evaluación del mismo agente de control sobre los insectos alternativos C. virescens y D. saccharalis, se realizó mediante la técnica de inmersión durante 20 segundos. 15 larvas del segundo estadio fueron sumergidas en una suspensión del hongo con una concentración final de 1 x 107 conidios. mL-1. Se calculó la eficacia (%) para los días 11 y 12, respectivamente, mediante la fórmula de Schneider-Orelli (Zar 1999): Eficacia (%) es igual a b menos k dividido 100 menos k por 100 donde: b = Porcentaje de mortalidad en el tratamiento con el hongo y k = Porcentaje de mortalidad en el tratamiento control (testigo absoluto).
Evaluación de M. anisopliae
Se evaluó el aislamiento Mt004 sobre el insecto blanco R. schistocercoides y sobre los insectos alternativos D. saccharalis y S. frugiperda. Para el insecto blanco, se usaron jaulas de 29 x 29 x 30 cm en las cuales se ubicaron 15 ninfas de quinto estadio previamente aplicadas tópicamente con una micropipeta en el pronoto, con 20 μL de una suspensión del hongo en Tween® 80 al 0,1 % ajustada a 1 x 107 conidios. mL-1, constituyendo una réplica. Lo mismo se hizo hasta completar tres réplicas por tratamiento. Los insectos se alimentaron con cortes de pasto kikuyo (Pennisetum clandestinum Hochst. ex Chiov.), y al igual que los insectos del tratamiento control, sin aplicación del micoinsecticida. Se registró la mortalidad cada cuatro días hasta el día 14 posterior a la aplicación y se calculó la eficacia (%), como fue mencionado.
En la evaluación del aislamiento Mt004 sobre el insecto alternativo D. saccharalis, se usó el mismo método de inmersión descrito. Luego se ubicaron de manera individual en recipientes plásticos de 0,5 oz con un grano de maíz (Zea mays L.) como sustrato de alimentación, constituyendo una réplica. Se evaluó un tratamiento control con sus tres réplicas. Se registró la mortalidad hasta el día nueve posterior a la inmersión y se calculó la eficacia (%).
Para el otro insecto alternativo, S. frugiperda, se evaluaron dos tratamientos correspondientes al control y a la aplicación del hongo. Se preparó una suspensión ajustada a 1 x 107 conidios. mL-1 y se realizó una aspersión de 1,8 mL sobre el haz y el envés de una hoja de higuerilla (Ricinus comunnis L., 1753) (Euphorbiaceae) con un aerógrafo a 30 lb de presión. De manera individual se ubicaron trozos de 2 cm2 de la hoja asperjada en recipientes plásticos de 0,5 oz y se dispuso una larva de segundo estadio sobre cada uno de ellos (unidad experimental). Se registró la mortalidad hasta el día nueve y se calculó la eficacia (%) mediante la fórmula de Schneider-Orelli (Zar 1999).
Diseño experimental y análisis de datos para los bioensayos de selección de los insectos alternativos
Para los bioensayos de selección de los insectos alternativos, se utilizó un diseño experimental completamente al azar (DCA) con tres réplicas por tratamiento. Estos correspondieron a un tratamiento control y otro a la aplicación del micoinsecticida. Los datos de mortalidad se sometieron a un análisis de varianza y a una prueba de diferencias mínimas significativas (DMS) utilizando el programa Statistix® versión 7.0 (Analytical Software 2008). Los porcentajes de eficacia se transformaron aplicando la raíz cuadrada del arcoseno.
Estandarización del método con los insectos alternativos seleccionados
Una vez se seleccionaron los insectos alternativos, se estandarizaron los métodos mediante un estudio de repetibilidad (r), reproducibilidad (R) y la relación entre estos dos parámetros (r&R), utilizando el método de promedios y rangos (Llamosa et al. 2007; Paisan y Moret 2010). Para evaluar la eficacia de B. bassiana (Bv060) se seleccionó C. virescens como insecto alternativo y D. saccharalis para M. anisopliae (Mt004). Para cada caso, la estandarización se llevó a cabo por dos analistas, quienes a partir de una misma muestra homogénea (el mismo cultivo del agente de control e insectos de la misma edad, según corresponda), bajo las mismas condiciones, mismos instrumentos, en el mismo laboratorio y durante el mismo día, evaluaron los métodos respectivos descritos anteriormente, con cinco repeticiones (por cada analista) y tres réplicas por cada repetición. Se calcularon los estimadores estadísticos para cada grupo de bioensayos realizados independientemente por cada uno de los analistas (repetibilidad) y entre ellos (reproducibilidad). Para establecer la repetibilidad de cada método, a cada analista se le definió el grado de concordancia entre los resultados obtenidos, mediante el cálculo del coeficiente de variación (Silva et al. 2003). Los porcentajes de eficacia se transformaron aplicando la raíz cuadrada del arcoseno y se estableció si los métodos son repetibles y reproducibles en el tiempo, mediante una prueba r&R (%). El método se aceptó como estandarizado de acuerdo con los siguientes criterios (Llamosa et al. 2007; Paisan y Moret 2010; Arango et al. 2013):
Resultados
Evaluación de Beauveria bassiana (aislamiento Bv060)
El aislamiento Bv060 tuvo una eficacia de 82,6 % sobre adultos de C. tingomariana y no presentó diferencias significativas con las obtenidas sobre los insectos alternativos D. saccharalis y C. virescens, las cuales fueron del 63,6 % y 92,6 %, respectivamente. Sin embargo, estos dos valores fueron significativamente diferentes entre sí (DMS = 4,72, g.l.= 2, P = 0,0587) (Fig. 1), razón por la cual se seleccionó a C. virescens por presentar la mayor mortalidad.
Evaluación de Metarhizium anisopliae (aislamiento Mt004)
El aislamiento Mt004 presentó una eficacia de 77,5 % después de 14 días de aplicación sobre ninfas de R. schistocercoides. No se detectaron diferencias significativas frente a la obtenida al evaluarlo sobre el insecto alternativo D. saccharalis la cual fue de 82,6 %, pero sí cuando se evaluó sobre S. frugiperda cuya eficacia no superó el 5 %, a los nueve días de aplicación para ambos casos (DMS = 34,2, g.l.= 2, P = 0,0005) (Fig. 2).
Figura 2 Eficacia (%) del aislamiento Mt004 de Metarhizium anisopliae sobre el insecto blanco Rhammatocerus schistocercoides y sobre los insectos alternativos Diatraea saccharalis y Spodoptera frugiperda. Letras iguales indican que no hay diferencias significativas, según DMS (α = 0.05).
En los tres bioensayos, la mortalidad del tratamiento control no superó el 11 % y fue significativamente diferente a los tratamientos en los que se evaluó el entomopatógeno contra R. schistocercoides (DMS = 43,7, g.l.= 1, P = 0,0027) y D. saccharalis (DMS = 907, g.l. = 1, P = 0,000), pero no cuando se evaluó sobre S. frugiperda (DMS = 0,40, g.l. = 1, P = 0,5603). Por tal razón, se seleccionó como insecto alternativo a D. saccharalis para hacer la evaluación rutinaria del aislamiento Mt004.
Estandarización del método con los insectos alternativos seleccionados
Los resultados correspondientes a la estandarización del método relacionado con la evaluación de la actividad biológica (eficacia %) de B. bassiana (Bv060) sobre C. virescens para los dos analistas se describen en la Tabla 2.
Tabla 2 Eficacia (%) de Beauveria bassiana en el control de Chloridea virescens obtenidos por los dos analistas.
| Repetición 1 | Repetición 2 | Repetición 3 | Repetición 4 | Repetición 5 | Consolidado por analista | ||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Analista 1 | 100,00 | 88,46 | 88,46 | 76,92 | 100,00 | x | 90,00 |
| 76,92 | 76,92 | 100,00 | 88,46 | 88,46 | SD | 5,16 | |
| 100,00 | 88,46 | 88,46 | 88,46 | 100,00 | CV (%) | 5,77 | |
| Analista 2 | 100,00 | 100,00 | 88,46 | 88,46 | 65,39 | x | 83,08 |
| 100,00 | 76,92 | 65,39 | 76,92 | 88,46 | SD | 7,50 | |
| 76,92 | 88,46 | 88,46 | 53,85 | 88,46 | CV (%) | 9,02 | |
X = Media; SD: Desviación estándar; CV (%): Coeficiente de variación.
Para el Analista 1, se obtuvieron valores de eficacia que oscilaron entre 76,92 % y 100 % con una media del 90,00 % ± 5,16 y un coeficiente de variación del 5,77 % mientras que para el Analista 2, estos valores fueron entre 53,85 % al 100 % con una media de 83,08 % ± 7,50 y un coeficiente de variación del 9,02 %.
El método para la evaluación de la actividad biológica de B. bassiana sobre C. virescens presentó una repetibilidad del 26,93 %, una reproducibilidad del 12,32 % y un porcentaje de relación de estos dos parámetros (r&R) del 29,62 % (Tabla 3).
Tabla 3 Rangos de medición para cada analista y valores de repetibilidad (r), reproducibilidad (R) y la relación entre estos dos parámetros r&R (%) para la actividad biológica de Beauveria bassiana en el control de Chloridea virescens.
| Analista 1 | Analista 2 | |
|---|---|---|
| Rango por medición | 0,12 | 0,12 |
| 0,06 | 0,12 | |
| 0,06 | 0,13 | |
| 0,06 | 0,06 | |
| 0,06 | 0,13 | |
| Repetibilidad (%) | 26,93 | |
| Reproducibilidad (%) | 12,32 | |
| r&R (%) | 29,62 | |
Los resultados correspondientes a la estandarización del método relacionado con la evaluación de la actividad biológica del agente microbiano a base M. anisopliae (Mt004) sobre D. saccharalis para los dos analistas se presentan en la Tabla 4.
Tabla 4 Eficacia (%) de Metarhizium anisopliae para el control de Diatraea saccharalis obtenidos por los dos analistas.
| Repetición 1 | Repetición 2 | Repetición 3 | Repetición 4 | Repetición 5 | Consolidado por analista | ||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Analista 1 | 93,18 | 72,73 | 86,36 | 72,73 | 79,55 | x | 80,45 |
| 93,18 | 65,91 | 79,55 | 72,73 | 72,73 | SD | 8,48 | |
| 93,18 | 79,55 | 93,18 | 86,36 | 65,91 | CV (%) | 10,54 | |
| Analista 2 | 65,91 | 65,91 | 79,55 | 79,55 | 84,27 | x | 77,06 |
| 79,55 | 65,91 | 72,73 | 72,73 | 84,27 | SD | 3,19 | |
| 79,55 | 93,18 | 79,55 | 72,73 | 79,55 | CV (%) | 4,14 | |
X = Media; SD: Desviación estándar; CV (%): Coeficiente de variación.
El Analista 1 obtuvo eficacias del 65,91 % al 93,18 % con una media de 80,45 % ± 8,48 y un coeficiente de variación de 10,54 %. Para el Analista 2, se obtuvieron eficacias de 65,91 % al 93,18 %, con una media de 77,06 % ± 3,19 y un coeficiente de variación de 4,14 %.
Para el método de evaluación de la actividad biológica de M. anisopliae sobre D. saccharalis se obtuvo una repetibilidad del 18,09 %, una reproducibilidad del 4,23 % y el r&R fue del 19,37 % (Tabla 5).
Tabla 5 Rangos de medición obtenidos para cada analista y valores de repetibilidad (r), reproducibilidad (R) y la relación entre estos dos parámetros r&R (%) para la actividad biológica de Metarhizium anisopliae sobre Diatraea saccharalis.
| Analista 1 | Analista 2 | |
| Rango por medición | 0,11 | 0,07 |
| 0,07 | 0,15 | |
| 0,08 | 0,03 | |
| 0,07 | 0,03 | |
| 0,07 | 0,03 | |
| Repetibilidad (%) | 18,09 | |
| Reproducibilidad (%) | 4,23 | |
| r&R (%) | 19,37 | |
Discusión
Debido al gran número de especies de insectos susceptibles a varios agentes biológicos de control, los métodos de evaluación de su actividad varían considerablemente. Por tal razón, estos se deben diseñar y estandarizar teniendo en cuenta varios criterios biológicos y ambientales, así como de análisis de datos y control de resultados que aseguran la precisión de cada prueba. Los bioensayos deben ser reproducibles en el tiempo y generar resultados consistentes (Lacey 2012, 2017).
Desde el punto de vista del control de calidad de la actividad biológica del principio activo de micoinsecticidas, un aspecto clave es el establecimiento de ensayos biológicos confiables, en el que se utilice el insecto blanco o bien un insecto alternativo, al que se le pueda determinar la actividad biológica del agente de control y que los resultados estén dentro de los límites previamente establecidos por el productor (Díaz et al. 2018).
El uso de insectos alternativos para la investigación en diferentes ramas de la ciencia es frecuente y debe cumplir con unas características mínimas. En el caso de insectos usados para explicar diferentes fenómenos e interacciones hay gran número de estudios realizados. Se tienen múltiples referencias sobre el uso de larvas de Galleria mellonella (L., 1758) (Lepidoptera: Pyralidae) como modelo alternativo a los mamíferos para el estudio de infecciones microbiales. Sin embargo, sus limitaciones se basan en que no cuenta con la secuencia completa de su genoma ni con unidades de crías de genotipos específicos establecidas bajo condiciones estandarizadas, como en el caso de otro de los insectos modelo por excelencia como Drosophila melanogaster Meigen, 1830 (Diptera: Drosophilidae) (Tsai et al. 2016). A pesar de esto, se ha utilizado como modelo para el estudio de patógenos humanos (Champion et al. 2016), así como hospedero para la producción de nematodos entomopatógenos (Půža y Mráček 2009), de parasitoides (Boldt y Marston 1974) y para la reactivación de los hongos entomopatógenos B. bassiana y M. anisopliae (Chávarry Baca 2015). También se ha empleado a Tribolium castaneum (Herbst, 1797) (Coleoptera: Curculionidae) como un organismo modelo para dilucidar los mecanismos de resistencia a insecticidas químicos (Zhu et al. 2010) por ser fácilmente producido, tener un ciclo de vida corto y alta tasa de fecundidad. Sin embargo, a la fecha no se encontraron referencias en que se indique el uso de insectos alternativos (modelo) para determinar la virulencia de entomopatógenos dirigidos a otro insecto blanco específico, como es el caso de este estudio y más aún en el ámbito del control de calidad de insecticidas biológicos. Aprovechando la capacidad que tienen algunos hongos entomopatógenos de ser virulentos sobre varios órdenes de insectos (Espinel Correal et al. 1998; Gandarilla-Pacheco et al. 2013; Sewify et al. 2014), es posible establecer una estrategia encaminada a la realización de ensayos rutinarios de control de calidad de bioplaguicidas cuyo insecto objeto de control tenga dificultades en su consecución constante y en el establecimiento y mantenimiento de colonias artificiales. Por otra parte, los insectos alternativos pueden ser utilizados como control positivo en la evaluación de la actividad biológica de micoinsecticidas. Según Lacey (2012), uno de los principios que se pueden incluir en el montaje de un bioensayo es la evaluación de la supervivencia del patógeno a diferentes condiciones (controles positivos). Las cuales pueden involucrar insectos tratados con este y evaluar el éxito de la infección, bajo condiciones conocidas y estandarizadas.
Los resultados del presente trabajo permitieron seleccionar los insectos alternativos D. saccharalis y C. virescens para la evaluación de la actividad biocontroladora de los aislamientos Mt004 y Bv060, dirigidos al control R. schistocercoides y C. tingomariana, respectivamente.
Para D. saccharalis, diferentes estudios indican su susceptibilidad a varias especies de hongos entomopatógenos como M. anisopliae, B. bassiana, M. rileyi e Isaria sp. (Alves et al. 2008; Bustillo-Pardey 2013; Cardona y Soto 2015). Para el caso de M. anisopliae,Alves y Lecuona (1998) reportaron una infección natural cerca del 10 % en cultivos de caña de azúcar en el nordeste brasileño y demostraron que este hongo es patogénico para todos los estados de desarrollo del insecto, siendo altamente eficiente para los huevos de uno a dos días de edad. En ensayos en campo, el patógeno colonizó el 58 % de las larvas, mientras que B. bassiana el 48 % a la dosis de 1 x 1013 conidios. ha-1. Por otra parte, Molina Acevedo et al. (2007) al evaluar dos aislamientos de M. anisopliae obtuvieron mortalidades del 60 % y 100 % sobre larvas de cuarto estadio de D. saccharalis; por estas características se reafirma su potencial para ser usado como insecto alternativo. De la misma manera para C. virescens, existen reportes en donde se evalúa su susceptibilidad a varios hongos y virus entomopatógenos (Ignoffo et al. 1983; Bojórquez-Ramos et al. 2016). Chávarry Baca (2015) encontró una supervivencia de larvas de C. virescens del 30 % y 48 % al ser tratadas con B. bassiana y M. anisopliae a una concentración de 1 x 107 conidios. mL-1 , respectivamente. Por otra parte, Acuña-Jiménez et al. (2015), obtuvieron mortalidades del 33,3 % y del 56,8 % sobre larvas de primer estadio al ser sumergidas durante 30 segundos al evaluar la patogenicidad de esporas microencapsuladas de B. bassiana y M. anisopliae a las 48 h, respectivamente.
Además de la susceptibilidad que tienen D. saccharalisyC. virescensa los hongos entomopatógenosM. anisopliaeyB. bassiana,respectivamente, existen otras ventajas importantes en el uso de los insectos alternativos, relacionadas con el fácil establecimiento de colonias bajo condiciones de laboratorio y la elaboración de dietas artificiales económicas y de fácil preparación para su mantenimiento (Parra 2001; Lastra Borja y Gómez Laverde 2006).
Una vez seleccionados los insectos alternativos, se estandarizaron los métodos desarrollados con el fin de garantizar los resultados obtenidos. Para el caso de B. bassiana (Bv060) sobre C. virescens y de M. anisopliae (Mt004) sobre D. saccharalis, los resultados indicaron que la variabilidad de los ensayos para cada analista fue baja, evidenciado por un coeficiente de variación inferior al 10 %. Estos resultados son similares a los presentados por Silva et al. (2007) y Díaz (2016), quienes establecieron que coeficientes de variación entre 0 y 20 %, son aceptables y se considera un ensayo estandarizado con un coeficiente de variación dentro de este rango.
Teniendo en cuenta los resultados de la prueba r&R, en los dos métodos se presentó un mayor porcentaje de repetibilidad en comparación con el valor de la reproducibilidad, lo anterior según Paisan y Moret (2010) posiblemente se deba a la variabilidad entre los componentes que se evalúan en los métodos. Sin embargo, para estos se obtuvieron porcentajes de relación entre la repetibilidad y la reproducibilidad (r&R) entre el 10 % y el 30 %, lo que sugiere que los métodos analíticos utilizados en este estudio son repetibles y reproducibles en el tiempo. En general, los métodos de evaluación de la actividad biológica mediante el uso de insectos alternativos son útiles para el análisis de agentes microbianos destinados al control biológico de plagas cuya disponibilidad en el momento requerido es una limitante.
Conclusiones
Bajo las condiciones del trabajo, se estandarizaron los métodos de actividad biológica de los hongos entomopatógenos M. anisopliae y B. bassiana, usados comúnmente como ingredientes activos de micoinsecticidas, mediante la utilización de insectos alternativos de fácil manejo, como D. saccharalis y C. virescens. Estos métodos fueron repetibles y reproducibles en el tiempo, y permitieron dar solución al problema de consecución y manejo de los insectos blanco R. schistocercoides y C. tingomariana.
