Introducción

Los fenoles son compuestos aromáticos que están formados por uno o varios grupos funcionales hidroxilo. Son metabolitos vegetales secundarios que se sintetizan mediante diferentes rutas como la del shikimato. Se les clasifica en taninos, ligninas y flavonoides. Son agrupados por el número de sustituyentes fenólicos dentro de la molécula (tabla 1).

Los fenoles están asociados a un gran número de propiedades fisiológicas, incluyendo antiinflamatorias, antidepresivos, antotumorales y antilipídicos ^[1], control de diabetes ^[2], antimicrobianos y antioxidantes ^[3]; los antioxidantes constituyen un sistema de defensa para las plantas; por lo tanto, exhiben la misma función en el organismo humano. La capacidad antioxidante de los aceites esenciales puede aumentar si contiene este tipo de estructuras fenólicas.

La caléndula pertenece a la familia Asteraceae, que es una planta anual. Esta planta ha sido tradicionalmente utilizada por sus efectos antiinflamatorios, antioxidantes, antifúngicos, antiedemas, antidiabéticas y propiedades curativas ^[4]. Presenta propiedades antioxidantes (carotenos, flavonoides y compuestos fenólicos), también contiene compuestos como esteroides, triterpenoides, ácidos fénolicos carotenos (p-caroteno, a-caroteno), rutinosido, flavoxantina, entre otros ^[5], compuestos que se puden encontrar en su aceite esencial y, por ende, ejerce un alto número de propiedades farmacológicas y funcionales.

Se han empleado varios métodos para la extracción de aceites esenciales, en cada uno de ellos se ha determinado el rendimiento de extracción y la calidad del aceite obtenido. El método más empleado es la hidrodestilación (HD), y es tomado como referente. Aparecen técnicas emergentes como la hidrodestilación asistida por calentamiento óhmico (OAHD); esta presenta grandes ventajas, en cuanto al tiempo de extracción y calidad del aceite esencial, porque que no hay degradación térmica, y la temperatura dentro del sistema aumenta rápidamente, debido a fenómenos de electroporación y la forma de transmisión del calor, en ésta se registran mínimas pérdidas por degradación térmica, esto hace que el aceite obtenido conserve su bioactividad ^[6,7].

El método de Folin Ciocalteu, es una técnica espectrofotométrica, basado en una reacción redox ^[8]; se emplea para predecir la cantidad de compuestos aromáticos hidroxilados y es un método no específico. Los resultados son expresados como mg de equivalentes de ácido gálico (EAG) (como estándar) / 100g de muestra, pero otros fenoles, como la catequina o los ácidos tánico, clorogénico, caféico, vanílico y ferúlico, pueden ser empleados.

El objetivo de este trabajo fue estimar el contenido total de fenoles, por el método de Folin Ciocalteu, sobre muestras de aceite esencial de caléndula obtenido a través de dos técnicas de extracción: hidrodestilación (HD) e hidrodestilación asistida por calentamiento óhmico (OAHD), como parte de la caracterización preliminar del aceite.

Parte experimental

Las plántulas de caléndula (Calendula officinalis L), se adquirieron en el invernadero del SENA CEDAGRO Duitama Boyacá, con 68 días de germinación; luego fueron trasplantadas con los requerimientos climáticos y agronómicos respectivos hasta la semana 16, tiempo en el que el cultivo presentó la máxima floración. Las flores frescas se secaron en horno a 52°C, por 72 horas. Para extraer el aceite fueron empleados dos métodos de extracción: hidrodestilación (HD) y la hidrodestilación asistida calentamiento óhmico (OAHD). Se realizó extracción de aceite con flores frescas (Ff) y secas (Fs).

La hidrodestilación (HD) se llevó a cabo usando un equipo destilador, con trampa de Clevenger, de acuerdo con la United States Pharmacopoeia, USP 32 NF27. 300 gramos de flores frescas (Ff) y secas (Fs), se colocaron en 500mL de agua destilada respectivamente. En la primera hora de extracción, la cantidad de aceite fue recogida cada 5 minutos, posteriormente cada 15 y la última hora cada 30min. El sistema de calentamiento óhmico (OAHD) fue diseñado y fabricado por el equipo de ingenieros de la Escuela de Ciencias Básicas Tecnología e Ingeniería (ECBTI) UNAD Duitama. Este consistió en un cilindro en nailon cuyo diámetro interno 30,5 mm y longitud 168 mm para una capacidad de 490 mL, y un soporte en acero inoxidable con referencia comercial 304. Se adaptaron dos electrodos de acero inoxidable de la misma referencia. Para la hermeticidad del equipo, se adaptaron empaques siliconados y unas abrazaderas en acero inoxidable. El equipo operó a 166 V, un amperaje en promedio de 1,9 A y como medio conductor se empleó una solución de NaCl al 1%. En la parte superior se adaptó la trampa de Clevenger. Se trabajó con 100 gramos flores frescas (Ff ) y 150 mL de solución salina, así como con 50 gramos de flores secas (Fs) y 150 mL de solución salina. Luego que el proceso alcanzó la temperatura de ebullición, se recolectó el aceite esencial durante los primeros 15 minutos en intervalos de 4 minutos, y después cada 8 minutos hasta terminar la extracción.

La determinación de fenoles totales en μg/ml, se realizó por el método de Folin-Ciocalteu,con ácido tánico como estándar; para proceder a elaborar la curva de calibración, se siguieron los parámetros establecidos por Paladino S ^[9] y se hicieron algunos ajustes al método de acuerdo con lo establecido en PNT n.°19 ^[10] y en Ainsworth y Gillespie ^[11]. Las medidas de absorbancia se hicieron a una longitud de onda de 760 nm en un espectrofotómetro Shimadzu UVmini-1240, para las medidas de absorbancia en el rango visible, se utilizaron cubetas (1cmx1cmx4cm) de cuarzo. El diseño de la investigación empleó dos tipos de aceite esencial, obtenido mediante HD y OAHD, con dos tratamientos (estado de la flor: frescas [Ff] y secas [Fs]) y tres réplicas por tratamiento. Los datos se procesaron a través del programa SPSS 24 para el ANOVA. Las diferencias significativas se evaluaron a través de la prueba de Tukey; el nivel de significancia fue del 95% (α= 0,05).

Resultados

Los resultados obtenidos en la determinación de fenoles totales (μg/mL) del aceite esencial calendula (Calendula officinalis L) obtenido mediante hidrodestilación (HD) e hidrodestilación asistida calentamiento óhmico (OAHD) se presentan en la tabla 2. Los resultados fueron procesados mediante la ecuación de la figura 1, obtenida a partir de los datos de la curva patrón, empleando como estándar diferentes soluciones de ácido tánico (50mg/L).

Tabla 2 Contenido total de fenoles (μg/mL) del aceite esencial de caléndula (Calendula officinalis L). 

^a-b indica que no hay diferencias significativas p>0,05, (n=3) según estado de la flor.

^c-d indica que hay diferencias significativas entre las medias de los grupos estimadas al nivel de 0,05 según interacción estado de la flor-método de extracción. Test de Tukey: con a=0,05 y f= 8 grados de libertad para el error. q=(3,8)=4,53. T=14,56.

Figura 1 Curva de calibración fenoles totales (μg/mL), empleando ácido tánico como estándar. 

Discusión

En flores secas para un mismo estado de la flor, independiente del método de extracción, se llega a duplicar la concentración de fenoles totales (tabla 2). Esto indica que el tiempo y temperatura de secado puede generar variabilidad en la composición química del aceite esencial dadas por las transformaciones químicas sobre los constituyentes del aceite ^[12], en donde, a partir de nuevos mecanismos, se pueden formar nuevos compuestos por reacciones de oxidación, glicosidación, esterificación, entre otros, que pueden potencializar la bioactividad de aceite esencial, como fue el caso del aumento en la concentración porcentual de bioactivos en procesos de secado de Lippia (familia Verbenaceae) ^[13] y en los resultados presentados por Kumar et al. ^[14] en el proceso de secado de Acorus calamus L., un análisis similar lo presentó Pirbalouti etal. ^[15].

El análisis de varianza (tabla 2) indica que se obtiene el mismo contenido de fenoles totales en el aceite esencial, para un mismo estado de la flor, independiente del método de extracción (p >0,05; T<14,56); la cantidad de fenoles presentes en el aceite esencial de caléndula (Calendula officinalis L) es el mismo, cuando se emplea cualquiera de los dos métodos de extracción. Existe significancia estadística (p <0,05) entre grupos, para el contenido total de fenoles, cuando se analiza el efecto combinado entre el estado de la flor, para un mismo método de extracción, sobre el contenido de fenoles totales presentes en cada fracción de aceite (tabla 2).

Son escasas las publicaciones bibliográficas que hay en relación a la medición del contenido total de fenoles y la actividad antioxidante del aceite esencial caléndula y de otras asteráceas; por ejemplo, en los estudios de Johnson et al. ^[16], el valor fue cercano al obtenido en muestras secas (Fs); en los reportes de Sytar et al. ^[17] presentan similitud con los valores registrados en flores frescas (Ff). Estos resultados indican que se debe continuar con la investigación en cuanto a la caracterización de los aceites obtenidos por cada método y tratamiento, para conocer la composición química y la evaluación de la capacidad antioxidante, aplicando métodos específicos como aquellos que evalúan la transferencia de átomos de hidrógeno (HAT) o transferencia de electrones (ET).

La literatura da cuenta de una amplia investigación sobre el contenido de fenoles totales en los extractos florales de caléndula. El contenido promedio de compuestos fenólicos indica que el aceite obtenido por cualquiera de los métodos y estado de la flor es bajo, con respecto a los extractos florales ^[18,19] pero los mismos varían de acuerdo al método de extracción y solvente utilizado (etanol, metanol, etc.). De acuerdo a esto, se puede inferir qué solventes polares favorecen la solubilización de fenoles, y aumentan la concentración en la muestra. En el caso de esta investigación, las estructuras aromáticas hidroxiladas presentes en cada uno de las fracciones de aceite pueden exhibir baja concentración, esto debido al solvente utilizado tanto en la DH como en la OAHD, que genera mayor migración de estas a la fase polar de la extracción (hidrolato o extracto acuoso) y no en la fase apolar (aceite esencial); en éste sentido, es importante analizar la composición química de cada muestra de aceite, y determinar cuáles son las estructuras presentes y que pueden ejercer alguna bioactividad (por ejemplo, terpenos y terpenoides) como también incluir dentro del contexto de la investigación la capacidad antioxidante del hidrolato, o extracto acuoso, que se genera en cada método de extracción (DH y OAHD) y estado de la flor de Caléndula (Ff y Fs).

Conclusiones

El contenido de fenoles totales (μg/mL) en cada una de las muestras de aceite obtenidos por HD e OAHD no registró efectos sobre el contenido de fenoles totales, para un mismo estado de la flor independiente del método de extracción, pero sí en la interacción estado de la flor (Ff- Fs), en un mismo método de extracción. El proceso de secado tiene un marcado efecto sobre el desarrollo de estructuras con capacidad antioxidante; por lo tanto, se concluye que el estado de la flor es quien condiciona el contenido de los fenoles totales (μg/ mL) y no el método de extracción.

Se debe continuar con la caracterización de cada muestra aceite obtenido por HD e OAHD, en relación a la composición química y actividad antioxidante empleando técnicas analíticas de mayor sensibilidad. De igual manera, es relevante incluir en estos objetivos la evaluación de la capacidad antioxidante del hidrolato o extracto acuoso, si bien, una gran cantidad de metabolitos polares con actividad biológica pueden migrar a esta fase y no estar presentes en el aceite esencial de flores Ff y Fs de caléndula (Calendula officinalis L) condiciona el contenido de los fenoles totales (μg/mL) y no el método de extracción, pero se debe continuar con la caracterización del aceite esencial obtenido por HD y OAHD, en relación a la composición química y actividad antioxidante, empleando técnicas analíticas de mayor sensibilidad.