Luz Adriana Botero, Ana María Mejía, Omar Triana

Grupo de Chagas, Instituto de Biología, Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia.

Recibido: 19/12/05; aceptado: 24/04/06

Introducción. T. cruzi I y T. cruzi II son grupos genéticamente diferentes y se cree que dicha variabilidad es determinante del tropismo tisular en el hospedero vertebrado y responsable de las diversas manifestaciones clínicas de la enfermedad de Chagas.

Objetivo. Caracterizar biológica y genéticamente dos clones colombianos de los grupos T. cruzi I y II en el modelo murino.

Materiales y métodos. Las cepas CAS15 y AF1 pertenecientes a los grupos T. cruzi I y II fueron clonadas en medio semisólido. Un clon de cada una de ellas y una mezcla de ambos se utilizaron para infectar ratones, los cuales se sacrificaron a diferentes tiempos post-infección. Para analizar la presencia del parásito en sangre y diferentes órganos, se utilizaron el microhematocrito y la reacción en cadena de la polimerasa con los marcadores de la secuencia satélite del ADN nuclear y con el espaciador intergénico del gen mini-exón.

Resultados. El clon T. cruzi I fue más infectivo, observándose un tropismo preferencial por corazón, recto y músculo esquelético, mientras que el clon T. cruzi II presentó un tropismo preferencial por bazo e hígado. Durante la infección con la mezcla de los clones, se observó que el clon T. cruzi I predominó sobre el T. cruzi II tanto en sangre como en órganos.

Conclusiones. Los resultados confirman que las diferencias genéticas entre los grupos de T. cruzi podrían estar determinando el tropismo tisular y de esta manera jugar un papel fundamental en el entendimiento de las manifestaciones clínicas de la enfermedad de Chagas en Colombia.

Palabras claves: Trypanosoma cruzi, enfermedad de Chagas, variación (Genética), tropismo.

Introduction. Genetic differences between T. cruzi I and T. cruzi II may determine differences in their tissue tropism in the vertebrate host and may also be responsible for the differences in clinical manifestations of Chagas disease.

Objective. Two Colombian clones of the T. cruzi groups I and II were characterized biologically and genetically in a murine model.

Materials and methods. Strains Cas15 and AF1 belonging to the T. cruzi groups I and II were cloned in semisolid medium. A clone of each strain and a mix of both were used to infect mice; the mice were subsequently sacrificed at selected post-infection intervals. In order to identify the parasite presence in blood and organs, two methods were used (a) microhematocrit and (b) polymerase chain reaction with primers for satellite DNA and the intergenic region of mini-exon.

Results. The T. cruzi I clone was more infectious, with a preferential tropism observed in heart, rectum and skeletal muscle, whereas clone T. cruzi II exhibited a preferential tropism for spleen and liver. During the infection with the clone mixture a predominance of the T. cruzi I clone over clone II in blood as well as in organs was observed.

Conclusions. The results corroborate that the genetic differences between the T. cruzi groups correlate with their tissue tropism, and can play an essential role in explaining the clinical manifestations of Chagas disease observed in Colombia.

Key words: Trypanosoma cruzi, Chagas disease, variability (Genetics), tropism.

La enfermedad de Chagas, causada por el parásito Trypanosoma cruzi, se encuentra ampliamente distribuida en países de Centro y Sur América, afectando aproximadamente a 20 millones de individuos (1). En Colombia, afecta a cerca del 5% de la población y aproximadamente el 11% está en riesgo de contraer la infección (2).

La enfermedad presenta un curso clínico variable que inicia con una fase aguda asintomática, caracterizada por alta parasitemia y detección de T. cruzi prácticamente en todos los órganos del hospedero (3). La enfermedad avanza a una fase crónica, caracterizada por baja parasitemia y un impredecible curso clínico que puede involucrar problemas cardiacos o gastrointestinales (4). En esta fase el parasitismo en tejidos es muy alto y restringido a algunos órganos como corazón, músculo esquelético, hígado, esófago, bazo y recto (5,6). La habilidad del parásito para sobrevivir a la fase aguda y avanzar hacia la fase crónica e invadir determinados órganos depende tanto de factores genéticos del parásito como del hospedero (7-11). Por esto, diversas investigaciones han estudiado la variabilidad genética del parásito y su posible relación con las manifestaciones clínicas de la enfermedad (7). En T. cruzi se han utilizado diferentes marcadores bioquímicos y moleculares para tratar de correlacionar la diversidad genética del parásito con sus características biológicas. El uso del espaciador intergénico de los genes mini-exón genera dos claras divisiones filogenéticas conocidas como T. cruzi I y T. cruzi II (12), las cuales permiten establecer algunas asociaciones importantes entre la taxonomía y la biología del parásito, el desarrollo de la enfermedad y diferentes parámetros epidemiológicos, entre otros (13,14).

Tradicionalmente, el grupo T. cruzi I se ha asociado al ciclo selvático de transmisión y se dice que predomina en los países ubicados al norte de la cuenca amazónica, entre ellos Colombia, mientras que el grupo T. cruzi II predomina en los países del sur y se encuentra asociado a los humanos y, por ende, al ciclo doméstico de transmisión (15). Por otra parte, se ha visto que áreas con gran morbilidad presentan la circulación del grupo T. cruzi II, mientras que en donde circula el grupo T. cruzi I es poco frecuente la enfermedad (7). Sin embargo, estudios recientes muestran que los dos grupos están circulando en ambos ambientes (13-16); en Venezuela, por ejemplo, un estudio realizado durante el año 2004 reveló un mayor número de pacientes infectados con el grupo T. cruzi I que presentaban la fase aguda de la enfermedad con manifestaciones clínicas similares a las observadas en pacientes infectados con el grupo T. cruzi II (16). Así mismo, en infecciones experimentales se ha encontrado que el grupo al que pertenecen los parásitos determina el tropismo a tejidos, la parasitemia y la patogénesis de la enfermedad (1,7,17).

En Colombia también se ha reportado recientemente la presencia simultánea de los dos grupos filogenéticos en varias de las cepas estudiadas, evidenciando una mezcla de ambos, pero con predominio del grupo I en medios de cultivo (18). Este resultado, junto con el hallazgo de los dos grupos de T. cruzi en las heces de vectores recolectados de poblaciones silvestres del norte de Colombia (datos no publicados), sugiere la posibilidad de que ambos grupos circulan de manera simultánea en la naturaleza, generando una epidemiología más compleja, pues tanto vectores como hospederos podrían estar infectados con los dos grupos y, en éstos últimos, darse un tropismo diferencial a tejidos ocasionan-do manifestaciones clínicas diversas (1,18,19).

Por lo anterior, y teniendo en cuenta que en Colombia se ha reportado la presencia de los dos grupos de T. cruzi, el objetivo del presente trabajo fue caracterizar biológica y genéticamente dos clones de T. cruzi aislados de cepas colombianas pertenecientes a los grupos I y II. Para esto, se evaluó el tropismo a órganos de ratones infectados individualmente con cada uno de ellos y durante una infección mixta con ambos clones. Este aspecto es de gran importancia para entender las manifestaciones clínicas y la epidemiología de la enfermedad de Chagas en Colombia.

Se utilizaron las cepas colombianas I.RHO/CO/00/CAS-15.CAS (CAS15) y I·PANS/CO/93/AF-1.ANT (AF1) caracterizadas genéticamente por isoenzimas, por RAPD y con el marcador mini-exón como T. cruzi I y T. cruzi IIb, respectivamente (datos no publicados). La cepa CAS15 se aisló en el año 2000 del vector Rhodnius prolixus silvestre del departamento de Casanare y la cepa AF1 del vector Panstrongylus geniculatus silvestre del municipio de Amalfi, departamento de Antioquia. Las cepas se han mantenido en el laboratorio del Grupo de Chagas de la Universidad de Antioquia por repiques cada siete días en medio de cultivo LIT suplementado con suero bovino fetal al 10% y a una temperatura de 28°C (20).

Los clones para cada una de las cepas fueron obtenidos a partir de epimastigotes cultivados en medio semisólido AGAR-LIT-BHI-sangre (21). Para esto se mezclaron 50 ml de agar estéril con pH 7,2, 100ml de LIT con suero bovino fetal al 10%, 100 ml de infusión de hígado y corazón (BHI) estéril y 6,25 ml de sangre desfibrinada. A continuación, se vertieron 25 ml de esta mezcla en cajas de Petri de 95 mm de diámetro y, luego de comprobar la esterilidad del medio, se sembraron 20 células por caja. Posteriormente se envolvieron las cajas en papel estéril y se incubaron aproximadamente 30 días a 28°C hasta observar el crecimiento de colonias puntiformes transparentes. Se aislaron y cultivaron siete clones para la cepa CAS15 y dos para la cepa AF1 en medio LIT suplementado con suero bovino fetal al 10%, según lo reportado previamente (22).

El ADN de las cepas parentales y de sus respectivos clones se obtuvo por el método salting out (23). Cada clon se caracterizó genéticamente por la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con el espaciador intergénico de los genes del mini-exón para evaluar si efectivamente el grupo de T. cruzi encontrado correspondía al de su cepa de origen, debido a que se han encontrado en las cepas mezclas de ambos grupos (18).

Para amplificar dicha región se utilizaron los iniciadores TC1 (5´-GTGTCCGCCACCT-CCT-TCGGGCC-3´), TC2 (5´-CCTGCAGGCACAC-GTGTGTGTG-3´) y TCC (5´-CCCCCCTCCCAG-GCCACACTG-3´), los cuales amplifican un fragmento de 350 pb para el grupo T. cruzi I y un fragmento de 300 pb para el grupo T. cruzi II (13). La PCR se hizo en un volumen final de 25 µl que contenían 2,5 µl de ADN molde, 50 mM KCl, 10mM Tris-HCl, 0,1% Triton X-100, 1,5mM MgCl2, 12,5 pmol de cada iniciador, 200mM dNTPs y 0,625 unidades de Taq ADN polimerasa. Los ciclos de amplificación se realizaron a una temperatura inicial de 94°C por 3 minutos, seguida de 27 ciclos a 94°C por 30 segundos, 55°C por 30 segundos, 72°C por 30 segundos y un ciclo final de 72°C por 10 minutos.

Para determinar si los clones aislados eran genéticamente diferentes se utilizó la técnica PCR de baja astringencia con un único iniciador específico (LSSP-PCR), que requiere un primer paso de amplificación de la región variable del ADN del cinetoplasto (kADN). Para amplificar dicha región se utilizaron los iniciadores S35 (5´-AAATAATGTACGGGGAGATGCATGA-3´) y S36 (5´-GGGTTCGATTGGGGTTGGTGT-3´), los cuales amplifican un fragmento de 330 pb correspondiente a la región variable de los minicírculos (24). La PCR se llevó a cabo en un volumen final de 50 µL de reacción que contenía 1 ml de ADN molde, 50 mM de KCl, 10 mM Tris-HCl, 0,1% Triton X-100, 1,5 mM de MgCl2, 10 pmol de cada iniciador, 200 mM de dNTPs y 2,5 unidades de Taq ADN polimerasa. Los ciclos de amplificación se realizaron a una temperatura inicial de 94°C por 3 minutos, seguida de 35 ciclos de 94°C por 45 segundos, 63°C por 45 segundos y 72°C por 45 segundos, y un ciclo final de 72°C por 10 minutos.

La banda de 330 pb, obtenida del kADN, se purificó a partir de geles de agarosa de bajo punto de fusión al 1,5% y se diluyó 10 veces en agua bidestilada. Se usó 1 µl de la dilución como molde para la reacción de LSSP-PCR (24), la cual se llevó a cabo en 25 µl de volumen final utilizando 50 mM de KCl, 10 mM Tris-HCl, 0,1% Triton X-100, 1,5 mM de MgCl2, 120 pmoles del iniciador S35, 200 mM de cada dNTP y 4 unidades de Taq polimerasa. Los ciclos de amplificación se realizaron a una temperatura inicial a 94°C por 3 minutos, seguida de 35 ciclos a 94°C por 45 segundos, 30°C por 45 segundos y 72°C por 45 segundos y un ciclo final a 72°C por 10 minutos (5). Los productos amplificados se analizaron en geles de poliacrilamida al 6% (25) teñidos con nitrato de plata (1). Este procedimiento se realizó por duplicado con el fin de evaluar la reproducibilidad de la técnica.

Tres grupos de dieciocho ratones machos suizos de 20 días de nacidos fueron inoculados intraperitonealmente con tripomastigotes obtenidos de medio de cultivo de cada clon y con una mezcla de ambos. El inoculo utilizado fue de 800.000 tripomastigotes de cada clon, tanto en las infecciones individuales como en la mixta. Para determinar la presencia de parásitos en sangre, al séptimo día de infección se revisaron los ratones por el método del microhematocrito y se tomó una muestra de sangre de la cola de los ratones infectados con la mezcla de los clones en un trozo de tela para su posterior análisis por PCR (26). Para determinar la presencia de los clones en órganos, se sacrificaron grupos de tres ratones de cada infección y se les extrajo corazón, hígado, bazo, recto y músculo esquelético tomado del fémur de cada ratón. Estos procedimientos se repitieron cada siete días hasta llegar al día 28 y luego se hicieron a los días 60 y 90 de la infección (pi). Como control negativo se utilizó un ratón macho suizo no infectado al que se le tomaron las mismas muestras. El sacrificio de los ratones se llevó a cabo por el método de inhalación de CO2, el cual fue aprobado por el Comité de Bioética de la Universidad de Antioquia.

La obtención del ADN de la tela impregnada con sangre de los ratones se hizo por el método de Chelex®, que consiste en adicionar a la sangre una resina y someterla a altas temperaturas que liberan el ADN en el sobrenadante (26). El ADN de los órganos fue extraído por el método de fenol-cloroformo-alcohol isoamilico (25:24:1), previa homogenización en solución de digestión (SDS 10%, NaCl 5 M, EDTA 0,5M, Tris-HCL 1M pH 7,5) y proteinasa K (100mg/ml), con posterior precipitación con etanol (27).

Para determinar si el parásito se encontraba presente en los diferentes órganos de los tres tipos de infección se usó una secuencia satélite del ADN nuclear de T. cruzi (Sat-ADN).

Para amplificar el Sat-ADN se utilizaron los iniciadores TcZI (5´-CGAGCTCTTGCCCACACG GGTGCT-3´) y TcZII (5´-CCTCCAAGCAGCGG ATAGTTCAGG-3´), los cuales amplifican un fragmento de 188 pb (28). La PCR se llevó a cabo en un volumen final de 50 µL de reacción que contenía 1 µl de ADN molde, 50 mM de KCl, 10 mM Tris-HCl, 0,1% Triton X-100, 1,5 mM de MgCl2, 20 pmol de cada iniciador, 200 mM de dNTPs, y 2,5 unidades de Taq ADN polimerasa. Los ciclos de amplificación se realizaron a una temperatura inicial de 94°C por 3 minutos, seguida de 35 ciclos de 94°C por 45 segundos, 60°C por 1 minuto y 72°C por 1 minuto, y un ciclo final de 72°C por 10 minutos.

Además, para determinar el grupo filogenético presente en las muestras de sangre y órganos de la infección con la mezcla de los clones se utilizó el marcador mini-exón mediante el procedimiento descrito anteriormente.

Los productos amplificados fueron analizados en geles de agarosa al 2%, teñidos con bromuro de etidio y visualizados bajo un transiluminador UV (29). Cada uno de estos ensayos se hizo por duplicado.

La enfermedad de Chagas se considera un problema de salud pública en muchos países por la gran cantidad de personas afectadas y la variedad de manifestaciones clínicas con que se presenta. Muchos estudios han llevado a pensar que dicha variación está ligada directamente al genotipo de los parásitos circulantes, ya que diferencias genéticas en las poblaciones del parásito hacen que estos presenten un tropismo diferencial por tejidos del hospedero durante la fase crónica de la enfermedad (1).

Muchas de las cepas naturales de T. cruzi son multiclonales y se encuentran compuestas de poblaciones del parásito tanto del grupo T. cruzi I como del grupo T. cruzi II. Sin embargo, este número de clones puede cambiar drásticamente a medida que trascurre el tiempo de infección, ya que en la fase crónica de la enfermedad ciertos clones del parásito son eliminados probablemente como resultado de factores inmunológicos del hospedero o debido a la capacidad de multiplicación o requerimientos nutricionales de cada clon (30). En el presente trabajo, mediante una infección mixta de clones pertenecientes a los dos grupos de T. cruzi, se simularon las condiciones de una infección natural en el modelo murino, permitiendo entender varios aspectos de la enfermedad, entre ellos, cuál es el genotipo causante de un tropismo específico y cuál de estos predomina en el hospedero después de un largo periodo de infección.

La clonación de las cepas de T. cruzi ha permitido establecer la homogeneidad o heterogeneidad genética y el comportamiento biológico y bioquímico de las poblaciones del parásito que las componen. Campos y Andrade (31) encontraron que la cepa 21SF, aislada de un paciente en la fase aguda de la enfermedad, presentó homogeneidad en cuanto a parámetros biológicos y bioquímicos entre los clones y subclones que la componen, sugiriendo la presencia de un clon principal representante del comportamiento biológico de dicha cepa. Los resultados encon-trados en este estudio, específicamente durante la clonación de la cepa CAS15, nos permiten sugerir que también se observa la predominancia de un clon, ya que los perfiles de bandas obtenidos con la LSSP-PCR son iguales para cinco de los siete clones aislados. Por otra parte, se podría pensar que muchos de los resultados encontrados en este trabajo son consecuencia del clon seleccionado, pues al ser uno de los predominantes en la cepa CAS15 puede sobresalir frente al clon de AF1 debido a una mayor capacidad de replicación, favoreciendo su presencia en el transcurso de la infección como se observó en el presente estudio.

En cuanto a la cinética de aparición de los clones en sangre de los ratones en los diferentes cortes de tiempo pi, se encontró que los dos clones presentaron diferentes tiempos de aparición. El clon CAS15 cl3 apareció en sangre en el día 7 pi y el clon AF1 cl1, en el día 14. Además, la cantidad de muestras de sangre de ratones que fueron positivas en todos los tiempos de infección fue mayor para el clon CAS15 cl3 que para el AF1 cl1. Estos resultados evidencian la capacidad de infección de cada clon, encontrándose un genotipo más infectivo en el clon CAS15 cl3.

Reportes previos han encontrado en suero de humanos provenientes de Argentina, Chile y Brasil anticuerpos contra los dos grupos de T. cruzi (32), indicando infección con ambos grupos. Los resultados obtenidos en este estudio con el marcador mini-exón nos permiten inferir que probablemente haya en la sangre de los ratones inoculados con la mezcla de los clones un predominio del clon CAS15 cl3 con respecto al clon AF1 cl1, ya que las pocas muestras que se encontraron positivas amplificaron la banda de 350 pb. Sin embargo, podría pensarse también que en sangre había muy pocos parásitos pertenecien-tes a ambos clones, principalmente al clon AF1 cl1, y que éstos fueron escasamente detectados por la PCR con dicho marcador. Por otra parte, numerosos estudios han mostrado que durante la fase crónica de la enfermedad los parásitos ya han invadido y colonizado órganos y, por tanto, no están circulando en sangre, lo que se verificó en este estudio, pues se encontró una ausencia total de parásitos en sangre a los tres meses después de la infección, tanto en las infecciones individuales como en la mixta.

Trabajos previos en ratones machos BALB/c han demostrado que luego de tres meses de infección, periodo correspondiente a la fase crónica de la enfermedad en dicho modelo experimental, diferentes clones de T. cruzi presentan distribu-ciones titulares diferenciales (9). Así mismo, otros autores han mostrado un tropismo preferencial de la cepa CAS15 por corazón (18) y de la cepa AF1 por bazo e hígado (33). Nuestro estudio apoya tales resultados, al ser el corazón uno de los órganos que más se encontró parasitado con el clon CAS15 cl3, y el hígado y el bazo con el clon AF1 cl1 en la fase crónica de la infección. Esta idea nos permite sugerir que la variabilidad genética de los parásitos es uno de los factores determinantes de la distribución diferencial en los tejidos y, probablemente, de las manifestaciones clínicas de la enfermedad de Chagas.

Por otro lado, se ha encontrado que tanto en Chile como en otros países del Cono Sur, donde se sabe que prevalece el grupo T. cruzi II, predominan las formas digestivas de la enfermedad (7), mientras que en Colombia la manifestación clínica más frecuente es la cardiaca. Nuestros resultados aportan evidencia que confirma que la forma cardiaca de la enfermedad en Colombia puede ser causada por T. cruzi I, puesto que el clon AF1 cl1, representante de T. cruzi II en Colombia, no invadió corazón, mientras que el clon del grupo I se encontró en la mayoría de los corazones. Sin embargo, es necesario que en futuros estudios se evalúe el tropismo tisular de un mayor número de clones pertenecientes a T. cruzi II para verificar lo anterior.

Nuestros resultados concuerdan con lo planteado por N. Añez y col (16), quienes encontraron que la infección con T. cruzi I presenta parasitemias mucho más altas que las causadas por T. cruzi II y que, además, T. cruzi I genera en pacientes durante la fase crónica un alto grado de daño en miocardio y músculo esquelético (34). Por el contrario, otros autores han encontrado que las infecciones con T. cruzi II son bastante graves y que comprometen algunos tejidos como recto y esófago (1,16,31). Los resultados encontrados en este estudio muestran que la parasitemia y el tropismo por órganos de parásitos pertenecientes al grupo T. cruzi II es menor que la de parásitos del grupo T. cruzi I, con tropismo preferencial por bazo e hígado. Consideramos que estas diferencias pueden deberse al alto polimorfismo encontrado en parásitos pertenecientes al grupo T. cruzi II, ya que se ha comprobado que los diferentes subgrupos en los que se encuentra dividido difieren en su infectividad, virulencia y patogenicidad. Como ejemplo está el clon CL-Brener, perteneciente al grupo T. cruzi IIe, que después de ser inoculado en ratas presentó una alta tasa de mortalidad al sobrevivir a la fase aguda de la infección (31).

Es importante destacar que diversos estudios han reportado el músculo esquelético como uno de los órganos que más se encuentra parasitado con T. cruzi tanto en la fase aguda como en la fase crónica de la enfermedad (35). Lo encontrado en este estudio corrobora lo anterior, pues en las infecciones individuales ambos clones se encuentran parasitando dicho músculo. Además, los resultados obtenidos en este órgano y en el hígado fueron muy interesantes, ya que a pesar de que el parasitismo en dichos órganos se observó en las dos infecciones individuales, durante la infección mixta sólo se encontró la presencia del grupo T. cruzi I (clon CAS15 cl3). Esto podría explicarse por diferencias entre los dos clones en la cinética de la fase aguda, ya que las respuestas inmunes estimuladas por una población de T. cruzi podrían favorecer la invasión y colonización tisular de la otra (16). Además, como se ha informado anteriormente, algunos clones pueden ser eliminados por su inhabilidad para competir y propagarse en el hospedero, o por la acción de sus mecanismos de defensa (36). Se podría pensar también en la posibilidad de que ambos grupos lleguen a infectar los órganos, pero al igual que ocurre con las cepas, T. cruzi II no se puede detectar por estar presente en menor proporción. A pesar de que el mini-exón es un buen marcador para diferenciar los dos grupos de T. cruzi, los resultados obtenidos mostraron que no fue muy sensible en la detección del parásito, posiblemente por su bajo número de copias comparado con el marcador sat-ADN.

Finalmente, nuestro trabajo aporta evidencia que sugiere que en Colombia el grupo T. cruzi I es más virulento que T. cruzi II y probablemente por ello es que predomina en las infecciones. Además, se comprueba que el polimorfismo genético de las poblaciones de T. cruzi puede ejercer influencia sobre el tropismo tisular y consecuentemente sobre las manifestaciones clínicas de la enfermedad. Estos aspectos son de gran importancia para una mejor comprensión de la epidemiología de la enfermedad de Chagas.

Luz Adriana Botero recibió apoyo del CODI–Universidad de Antioquia a través del programa de jóvenes investigadores.

Los autores declaramos que no existe ningún conflicto de intereses.

Este proyecto fue financiado por el programa de sostenibilidad 2005–2006 del CODI, Universidad de Antioquia.

Correspondencia: