DENV y proteínas estructurales E y prM

Los DENV son virus de ARN de sentido positivo (grupo IV en la clasificación propuesta por Baltimore) y hacen parte de la familia Flaviviridae, género Flavivirus (^{Westaway et al., 1985}; Velandia y Castellanos, 2011). Los viriones del DENV presentan morfologías icosaédricas de aproximadamente 40 - 50 nm de diámetro acompañada de una envoltura de lípidos donde están insertadas múltiples copias de la proteína de envoltura (E) y la precursora de membrana (prM). La nucleocápside posee la tercera proteína estructural (Proteína C, core) empaquetando una hebra de ARN genómico que tiene un tamaño de alrededor 11 kb y que codifica para diez productos, las tres proteínas estructurales y siete no estructurales (^{Lindenbach et al., 2007}; ^{Zhang et al., 2013}).

Después de su maduración durante el ensamblaje y gemación, el DENV dispone a las proteínas E y prM en la membrana y a la proteína C en la cápside viral, la cual, debido a su carácter muy básico y a su peso aproximado de 10 kDa participa activamente en el ensamblaje viral y la encapsidación específica del genoma viral (Velandia y Castellanos, 2011; ^{Nemésio et al., 2013}). La proteína prM y la proteína M intervienen en la maduración del virus, pues después de traducirse, es clivada por la furina celular (un miembro de la familia de proteasas tipo subtilisina/ kex2p de mamíferos) en la posición 91 de los 166 aminoácidos que lo componen, para producir el péptido pr y la proteína M (^{Zhang et al., 2003}; ^{Hsieh et al., 2014}). Después de este corte, el cambio conformacional que sufre la partícula viral es irreversible y en este momento se considera una partícula viral madura e infecciosa, en la cual el fragmento M se encuentra cubierto por la proteína E (^{Perera y Kuhn, 2008}). Gracias a la criomicroscopía electrónica, se sabe que después del corte realizado por la furina, la proteína M queda constituida por un bucle ubicado en los primeros 20 aminoácidos del extremo amino terminal, un dominio α-helicoidal (también denominado MH) y dos dominios transmembranales MT1 y MT2 (Zhang et al., 2003). La importancia del dominio MH fue confirmada por estudios de mutagénesis dirigida realizados en nueve residuos altamente conservados (Hsieh et al., 2014), demostrando que la sustitución por alanina en cuatro de estos residuos disminuyen significativamente la producción de partículas recombinantes similares a virus (VLP) y partículas en un sistema de replicón, debido a que la furina necesita de ciertas secuencias consenso de aminoácidos básicos tipo Arg-Xaa-Arg / Lys-Arg para realizar el corte (^{Thomas, 2002}). También se conoce que después de su síntesis en el retículo endoplasmatico rugoso, la prM actúa como una chaperona formando un heterodimero con la proteína E cuyas funciones específicas serian dos, la primera ayudar a plegar adecuadamente a E y la segunda evitar que por afinidad la proteína E se incorpore a compartimientos ácidos de la vía secretora (^{Guirakhoo et al., 1992}; Hsieh et al., 2014). Además de las funciones ya mencionadas de prM y M, estas proteínas tienen también funciones no estructurales; los estudios de ^{Catteau et al., (2003)} demostraron que existe un ectodominio intraluminal de la proteína M con propiedades pro apoptóticas en líneas celulares como la Neuro2a y HepG2, debido a nueve aminoácidos que están ubicados en el extremo C-terminal y que fue denominado ApoptoM, lo cual podría explicar en parte el efecto citopático producido por DENV.

La proteína E, presenta una masa de aproximadamente 50 kDa y posee tres dominios en su porción extracelular claramente definidos (I, II y III respectivamente) con glicosilaciones en Asn67 y Asn153 (Velandia y Castellanos, 2011; ^{Zhang et al., 2013}). Una vez en la membrana, se arreglan como dímeros de tipo cabeza y cola, y se conoce bien que los dominios II y III intervienen en la unión del virus a los receptores celulares, entre los cuales se han descrito HSP-90 y 70 (proteínas de choque térmico), CD14, GRP8/BiP, el receptor de laminina, receptores de lectina tipo C, receptor de manosa, integrinas αvβ3 y receptores de heparán sulfato (^{Miller et al., 2008}; ^{Dejnirattisai et al., 2011}). Por otro lado, en tanto es la proteína más inmunogénica, es la que más se usa para el diseño de vacunas, y por ejemplo recientemente se reportó un prototipo de vacuna de nanopartículas de ácido-poliláctico glicólico recubiertas de la proteína E recombinante que fue probada en ratones (^{Metz et al., 2018}). No obstante, es importante tener presente que también es la proteína en la que más se acumulan las diferencias genéticas entre los serotipos de DENV (extra-serotipo) e inclusive entre las cepas que se encuentran en un mismo serotipo (intra-serotipo), que por ejemplo ha permitido que se definan dos grupos antigénicamente diferentes para DENV2 (^{Qiu et al., 2018}). Los epítopes a los que se unen los anticuerpos se denominan posiciones dominantes de antigenicidad y recientemente usando un algoritmo matemático se identificaron 97 de estos en la superficie de la proteína E y se hizo la correlación con el estudio previo realizado con sueros de monos por Katzelnick et al., (2015) encontrando que los epítopes en E son similares entre serotipos, pero que existe mayor similitud en algunos de ellos entre DENV de serotipos diferentes, lo cual puede ayudar a entender mejor la reactividad cruzada de anticuerpos por los serotipos que causan infección en diferentes momentos.

En adición a lo mencionado, (^{Chaudhury et al., 2017}), en un estudio que analizó 406 anticuerpos monoclonales (mAb) humanos que incluían características generales, de actividad y de residuo del epítope al que se une (datos almacenados en la base de datos de anticuerpos contra DENV (DENV-Ab-DB)); identificaron que de 99 mAbs generados durante una infección primaria, el 45 % de estos era exclusivamente específico para el serotipo infectante, mientras que el 55 % restante podía reconocer a más de un serotipo. Sorprendentemente, de 139 mAbs de infección secundaria solo el 4 % resultó ser específico para un único serotipo de DENV. Además, también se observó que los epítopes de la proteína E que son opsonizantes y que son reconocidos en las infecciones secundarias, se encontraban en el péptido de fusión (dominio II de la proteína E), en la cadena A del dominio III y en la región bisagra entre el dominio I y II, mientras que los epítopes específicos en cada serotipo se encontraron en la cresta lateral del dominio III, ya que no se encontró reactividad cruzada de mAbs en esta región en infecciones secundarias. En otra investigación, también se identificó un epítope perteneciente a DENV-3 ubicado en el residuo Gly264 el cual se comparte con DENV-1 y DENV-2; y otro epítope que se comparte entre DENV-1 y DENV-2 y está ubicado en el residuo Gln211, aunque para este caso, el DENV-1 posee una lisina, DENV-2 posee una arginina. En ese trabajo solo se analizaron epítopes por fuera del dominio III ya que en este se encuentran las secuencias responsables de la mayor parte de los anticuerpos con alta capacidad de neutralización (^{Mikita y Padlan, 2016}). Estas diferencias en el reconocimiento de los mAbs en infecciones secundarias en relación con las primarias debido a la similitud de los epítopes, son esenciales para comprender la patogénesis que contribuye con la progresión a dengue grave, en especial durante el transcurso de fenómenos como el ADE por el reconocimiento cruzado de epítopes (Chaudhury et al., 2017).

Amplificación de la infección dependiente de anticuerpos (ADE)

El primer investigador en postular la hipótesis de ADE como responsable de la severidad del dengue grave fue Scott ^{Halstead en 1977} (Halstead y O'Rourke, 1977), básicamente, su estudio consistió en utilizar leucocitos mononucleares de sangre periférica en los cuales identificó que a un MOI de 0,001 - 0,1 las células no eran permisivas al virus, sin embargo al agregar al medio, suero no neutralizante de una persona positiva para un serotipo diferente, estas se volvieron permisivas a la infección, y con esto, postuló un posible mecanismo en el cual el DENV es reconocido por anticuerpos de tipo IgG, los cuales a su vez facilitan el ingreso a las células usando el receptor para inmunoglobulinas, amplificando la infección. Ampliando la explicación, se puede entender que la infección por alguno de los cuatro serotipos del DENV confiere inmunidad contra el virus infectante, pero no inmunidad permanente contra los otros tres serotipos dando espacio para infecciones secundarias heterotípicas o consecutivas (^{Sangkawibha et al., 1984}; ^{Mikita y Padlan, 2016}). En la actualidad, se sostiene que estas infecciones heterotípicas secundarias mediadas por ADE son el mayor factor de riesgo para la presentación de dengue grave (^{Wang et al., 2017}), ya que como se explicó anteriormente, algunas inmunoglobulinas G (IgG) pueden ser reactivas para dos o más serotipos de DENV (que reconozca algún epítope que comparten dos o más serotipos de DENV), pero no necesariamente es neutralizante, sino opsonizante y por consiguiente, se produce un aumento temprano de la fusión de partículas virales dentro del endosoma (^{Flipse et al., 2016}), aumento de la infectividad viral (^{Dejnirattisai et al., 2010}) e inclusive una inhibición en la señalización intracelular de la inmunidad innata (^{Kou et al., 2011}) (mecanismos que se explicaran adelante con mayor detalle).

Se entiende adicionalmente, que el bajo potencial de neutralización de los anticuerpos por el cual se desarrolla el fenómeno ADE está relacionado (además de la similitud de epítopes que se mencionó anteriormente) con la disminución de los títulos de anticuerpos a medida que pasa el tiempo entre una infección primaria y el momento en el que se contrae una infección heteróloga secundaria. Por esta razón, se ha establecido que después de un periodo de dos o más años entre estos dos eventos es en el que se puede presentar con mayor probabilidad el fenómeno de ADE (^{Halstead, 2017b}). Por ejemplo, en el estudio de ^{Katzelnick et al., (2017)} que incluyó 6684 niños de Nicaragua, concluyeron que aquellos que presentaban títulos de anticuerpos entre 1:21 y 1:80 tenían un riesgo de dengue grave 7,64 veces mayor (95 % CI: 3,19-18,28) en comparación con niños que poseían títulos mayores a 1:1280 (infección más reciente) cuyo riesgo de dengue grave era de 1,5 %. También se determinó que los anticuerpos contra DENV tienen una vida media de cuatro años y que a los tres años después de una infección en el 22 % de los niños los títulos disminuyen hasta 1:21 y 1:80.

Por otro lado, un análisis de datos de dos epidemias de DENV-2 ocurridas en Cuba durante los periodos de 1981 (La Habana) y 1997 (Santiago de Cuba) de personas que habían tenido una infección sensibilizadora con DENV-1 que se transmitió entre los años 1977 y 1979, dieron como resultado una tasa de mortalidad tres a cuatro veces más alta en la epidemia de 1997 que en la de 1981, es decir 20 años después de la sensibilización por DENV-1, resultados que se pueden explicar por la disminución del potencial de neutralización de los anticuerpos a medida que transcurre el tiempo (^{Guzmán et al., 2002}). En contraste, ^{Anderson et al., (2014)} en un estudio de dos cohortes (19982002 y 2004-2007) con niños tailandeses entre cuatro y 16 años, encontraron que la gravedad de una infección secundaria por DENV, es consistente con el intervalo de tiempo en el que se produce la infección secundaria, ya que los niños presentaron infecciones subclínicas en el intervalo de tiempo de 1,41 años, pero aquellos niños que tuvieron una infección primaria durante el estudio tenían mayor probabilidad de evolucionar a dengue grave si eran infectados por un segundo serotipo después de 1,92 años de la primera infección. De manera interesante, en neonatos también se ha descrito que se puede presentar el fenómeno de ADE. En un estudio prospectivo en Vietnam (^{Chau et al., 2009}) se reportó que casi la totalidad de las madres tenían anticuerpos neutralizantes para alguno de los cuatro serotipos de DENV y que al momento del nacimiento se encontró la misma proporción de neonatos con anticuerpos específicos en el suero obtenido de sangre umbilical (por transferencia materna), pero además en mayor concentración en comparación con el suero de las madres. Durante la evaluación posterior de los recién nacidos, se encontró que los anticuerpos específicos desaparecen en el 90 % de los lactantes a los seis meses, lo cual puede ayudar a explicar la protección en niños menores de cuatro meses y la mayor probabilidad de desarrollar dengue grave mediado por ADE en niños mayores a seis meses.

En tanto las células blanco del DENV (monocitos, macrófagos y células dendríticas maduras) poseen el receptor Fcy, son éstas quienes contribuyen mayoritariamente al desarrollo de ADE y a una posterior progresión a dengue grave. Recientemente, se identificó que las células dendríticas que se activan por la vía TLR2/MyD88 en una infección secundaria por DENV son capaces de orientar una respuesta humoral y celular polarizada hacia linfocitos T CD4 Th2 (T helper2) (^{George et al., 2017}). Adicionalmente, esta polarización celular hace que las concentraciones séricas de citocinas del perfil Th2 como IL4, IL5, IL6, IL10 e IL13 aumenten significativamente, derivando hacia el desarrollo de dengue grave. Estas citocinas se encuentran aumentadas en los sueros de pacientes con dengue grave, evidenciando una actividad inmune antiinflamatoria, contraria a los requerimientos para la eliminación del virus y células infectadas y contribuyendo por esta vía al daño endotelial; todo ello en comparación con pacientes que presentan la forma leve de dengue, en cuyo caso las citocinas que se encuentren elevadas son IFNy e IL2 (propias de la respuesta de células Th1) (^{Chaturvedi, 2009}). Este fenómeno, que describe una elevada producción de citocinas que contribuirán a el daño endotelial y posterior fuga plasmática es mejor conocido como tormenta de citocinas (^{Kurane et al., 1991}) y es otro de los mecanismos que explican la patogénesis del dengue grave.

ADE extrínseco

En condiciones de ADE, el proceso temprano de infección celular mediada por anticuerpos (ADE extrínseco), comienza con la unión del complejo virus-anticuerpo al receptor Fcy (FcyR, Fc gamma receptor) por la región Fc (crystallizing fragment) del anticuerpo IgG. Los receptores Fcy en humanos, se clasifican en tres tipos, FcyRI, FcyRII y FcyRIII o también denominados por sus clústeres de diferenciación (CD) CD64, CD32 y CD16 respectivamente (^{Guilliams et al., 2014}). Estos receptores Fcy se expresan en monocitos, macrófagos y células dendríticas y cumplen la función de ser potentes inductores de la fagocitosis en microorganismos opsonizados (DENV para este caso), sin embargo, como se muestra en la Figura 1, en condiciones de ADE para DENV, estos receptores contribuyen aumentando la infectividad viral que a su vez se relaciona con mayor activación inmune y endotelial favoreciendo la progresión a dengue grave (^{Wang et al., 2003}; Wang et al., 2017).

Figura 1 Representación del fenómeno de ADE extrínseco. Los anticuerpos de tipo IgG contra DENV pueden reconocer epítopes propios del serotipo (no compartidos) o bien, epítopes que estén presentes en dos o más serotipos (compartidos). En consecuencia, de esto, los receptores FcyRIIA en las células susceptibles a DENV (monocitos por ejemplo), reconocen los complejos inmunes a través de la porción Fc de la inmunoglobulina y favorecen un aumento en la proporción de células infectadas que llevan a un aumento en la producción de nuevos viriones. 

Para el particular caso de DENV, se sabe que la isoforma IIA del receptor (FcyRIIA, CD32) es más eficiente al momento de mejorar la infectividad del complejo inmune. Esta isoforma presenta una cadena a sobre la membrana celular que contiene en la subunidad complementaria un ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif), el cual es un motivo estructural ubicado en la cola citoplasmática de estas cadenas con función en la transducción de señales en células inmunes (^{Guilliams et al., 2014}). En un estudio in vitro de ^{Rodrigo et al., (2006)} cuyo objetivo fue evaluar la influencia de los receptores FcyRIA y FcyRIIA (competentes y no competentes de señalización transfectados en células COS-7) sobre la capacidad infectiva de los complejos inmunes de DENV-2; se concluyó que FcyRIIA es más eficiente que FcyRIA para promover la infectividad viral, estos autores plantean como hipótesis que FcyRIIA está localizado en balsas lipídicas y dominios membranales en los que están los receptores virales y en donde los complejos inmunes débilmente unidos pueden interactuar más fácilmente e iniciar la entrada a la célula. En otro trabajo in vitro utilizando células NIH 3T3 transfectadas con FcyRIIA y FcyRIIB o solo una de las dos, pero con sus motivos intracelulares intercambiados, es decir, FcyRIIA con un motivo de ITIM y FcyRIIB con un motivo ITAM, que luego fueron inoculadas con DENV-2 en presencia de suero, se determinó que las dos isoformas se unen a los complejos inmunes, sin embargo, FcyRIIA-ITIM inhibió el fenómeno de ADE, concluyendo así que el proceso de activación de las células depende de la fosforilación del motivo ITAM, presente nativamente en receptores FcyRIIA (^{Boonnak et al., 2013}). Por otra parte, los receptores Fcy no son el único factor determinante en la unión y entrada del virus bajo condiciones de ADE, pues se ha demostrado que determinantes moleculares en la proteína E de DENV juegan un papel clave en la unión celular tanto en condiciones normales como en condiciones de ADE (^{Chotiwan et al., 2014}).

Ahora bien, durante el proceso de entrada a la célula en condiciones de ADE, un ensayo in vitro realizado en células P388D1, que consistió en el seguimiento de partículas de DENV opsonizadas con anticuerpos en comparación con partículas de DENV no opsonizadas utilizando DiD como etiqueta fluorescente con el objetivo de identificar si los anticuerpos influían o no en la dinámica de entrada viral (^{Ayala-Nunez et al., 2016}), se determinó que la entrada de DENV en condiciones de ADE está dada por la dinamina que es una GTPasa involucrada en la endocitosis mediada por clatrina, y también por la actina en el sentido que esta es capaz de formar protuberancias que ayudan a envolver las partículas opsonizadas en procesos de fagocitosis (que para este caso vendrían después de la unión de los complejos inmunes con los receptores FcyRIIA) (^{Freeman y Grinstein, 2014}). En resumen, las vías que intervienen en la entrada de DENV en condiciones de ADE son tanto la endocitosis mediada por clatrina (via clásica) y vías fagocíticas que involucran actina.

ADE intrínseco

Después de la internalización del DENV por el FcyR, la activación de la cascada de señalización por los motivos ITAM induce un apagamiento de la inmunidad innata, proporcional al aumento en la producción de partículas virales (ADE intrínseco). Por ejemplo, en el reporte de ^{Modhiran et al., (2010)} se describieron análisis de RT-qPCR, western blot y microarrays con el objetivo de identificar si las infecciones por DENV mediadas por el complejo inmune tenían algún efecto sobre la señalización de los receptores tipo toll (TLRs). En resumen, encontraron que la unión de los complejos inmunes disminuía la transcripción de TLRs, además de estimular la expresión de SARM (Sterilealpha and armadillo motif) y TANK en células monocíticas (Figura 2), lo que aparentemente contribuye a mayores tasas de replicación viral y por ende, viremias más altas y mayor activación inmune, que se pueden relacionar con el desarrollo de dengue grave.

Figura 2 Esquema del ADE intrínseco. La unión de los complejos inmunes a los receptores FcyRIIA estimula la sobreexpresión de SARM y TANK. En tanto SARM es la única proteína perteneciente a la familia de proteínas con dominio TIR con capacidad de inhibir la expresión de los TLRs (que reconocen el virión en el lisosoma), la cascada de señalización utilizada por estos se ve afectada. Por ejemplo, proteínas como MyD88 que cumplen el objetivo de activar el factor nuclear-(B para inducir la expresión de citocinas en pro de controlar la infección viral no se activan, dando como resultado un aumento en la producción de partículas virales. También se esquematizan otras vías de señalización como la de RLR-MAVS que son activadas por el RNA viral y cumplen la función de activar factores de transcripción como los IFRs que aumentarán la expresión (flechas verdes) de componentes antivirales como óxido nítrico y/o IFN tipo I. 

Los TLRs son proteínas que participan en las respuestas de inmunidad innata, y cumplen la función de reconocer componentes moleculares expresados por los patógenos. Para el caso de los virus, los TLR 4 y 7 reconocen proteínas virales en la superficie, mientras que los TLR 3, 7, 8 y 9 son endosomales y se activan con los ácidos nucleicos (^{Koyama et al., 2008}). Una vez estos TLRs reconocen su diana, inician una cascada de señalización reclutando a una familia de proteínas adaptadoras con un dominio TIR (Toll/ interleukin-1 receptor), entre las cuales están MyD88, TIRAP (MAL), TRIF (TICAM) y TRAM (TICAM2), cuyo objetivo es activar factores de transcripción como el factor nuclear-/kB (NF-/kB) y algunos miembros de los factores reguladores de interferon (IRF) (^{O'Neill y Bowie, 2017}) o regular la expresión de IFN tipo I, principales citocinas involucradas en la respuesta antiviral. Ahora bien, bajo condiciones de ADE esta respuesta de los TLRs se ve afectada por el aumento de expresión de SARM, esta proteína también pertenece a la familia de proteínas con dominio TIR, sin embargo, es la única con función de suprimir los TLRs (^{Modhiran et al., 2010}), conllevando a la disminución en la expresión de IFN de tipo I, lo cual es un aspecto clave en la inmunopatogenesis de DENV en condiciones de ADE, ya que estos IFN de tipo I son capaces de activar la via JAK/ SAT cuyo objetivo es la activación de los ISG (interferon-stimulated genes), entre los cuales se encuentra el NOS2 (Nitric oxide synthase, inducible), encargado de aumentar los niveles de óxido nítrico (NO), que tienen un potente efecto inhibidor de la replicación (^{Samuel, 2001}; ^{Flipse et al., 2013}). Como se puede evidenciar en la figura 2, también se ha encontrado que la activación de los ISG, puede ocurrir a través de otras vías independientes de interferón como la RLR-MAVS (^{Ayala-Nunez et al., 2016}). Se ha propuesto que estas respuestas antivirales tempranas son inhibidas en gran parte por procesos que aumentan la autofagia celular, ya que proteínas autofágicas como ATG5 y ATG12 suprimen la inducción de ISG. En resumen, la modulación de los TLR favorece la replicación viral y una respuesta inmune distorsionada (^{Huang et al., 2016}).

Infecciones de baja severidad en las que se evidencia ADE

A pesar de la amplia evidencia in vitro de ADE como el principal determinante para la progresión a dengue grave, hasta la fecha no existe evidencia in vivo (en humanos) que corrobore los mecanismos tanto de ADE intrínseco como extrínseco reportados; cuando se realizan experimentos con modelos animales (ratones por ejemplo) el ADE se puede o no evidenciar, además las condiciones específicas que suceden cuando se produce dengue grave son difíciles de reproducir (^{Sasmal et al., 2019}). De hecho, existen estudios que no respaldan el ADE como un actor de la progresión a dengue grave. En un estudio que incluyó 4 441 bebes brasileros junto con sus madres, en un periodo de seguimiento de un año identificó que 40 cursaron con una infección sintomática por DENV (DENV-3 en la mayoría de los casos) y 20 con infecciones inaparentes por DENV. Una vez realizado el ensayo de ADE a partir de muestras de plasma de los lactantes con infección primaria para DENV con el objetivo de identificar si las IgG de origen materno podían aumentar la infección, se identificó que tanto los lactantes que presentaron fiebre hemorrágica por dengue (FHD) (antigua clasificación clínica para dengue grave) como los que no presentaron FHD tuvieron una infección viral aumentada, concluyendo así que el ADE no puede ser el único determinante para el desarrollo de FHD (^{Libraty et al., 2009}). Por otro lado, ^{Laoprasopwattana et al., (2005)} tampoco encontraron una relación entre los altos títulos de amplificación in vitro de sueros de niños, con la presentación de una infección severa por DENV-2 o DENV-3, aunque los métodos de laboratorio y en especial la cepa usada en la infección del ADE, pudieran explicar el hallazgo contradictorio. Sin embargo, probablemente en la inmunopatología de los casos severos de DENV, estén involucrados otros aspectos clave además del ADE, por ejemplo la tormenta de citocinas (^{Kurane et al., 1991}), el genotipo del virus (^{Vicente et al., 2016}), el origen étnico (^{García et al., 2010}), etc.

ADE y su relación con otros flavivirus

Resulta de gran interés que se haya reportado que el fenómeno de ADE no solo ocurre entre los 4 serotipos de DENV, sino también con otros virus pertenecientes a la familia Flaviviridae por la presencia de epítopes similares que pueden ser reconocidos por anticuerpos generados en una infección previa por un flavivirus. En lo que respecta a ZIKV, cronológicamente en el 2016 Priyamvada et al., (2016) identificó que anticuerpos monoclonales humanos derivados de plasmoblastos de pacientes positivos para dengue poseen una reactividad cruzada con ZIKV y además causan ADE cuando se realizan ensayos en células U937. En la misma vía de evidencia, se describió que células K562 que expresan FcyR, se infectan 4,4 y 1,6 veces más con ZIKV y DENV respectivamente al usar un suero positivo para DENV (^{Castanha et al., 2017}). Posteriormente ^{Hermanns et al., (2018)} identificó la existencia de un aumento de la infección por ZIKV amplificado por anticuerpos para DENV en cultivos organotípicos de placenta humana. Corroborando los anteriores hallazgos ^{Bardina et al., (2017)} utilizando muestras de plasma que provenían de pacientes en fase de convalecencia por infección de DENV, identificaron mediante ensayos in vitro que la reactividad (medida por ensayos de ELISA) de estas muestras a la proteína E de ZIKV era 350 veces mayor en comparación con las muestras de control, además los ensayos de ADE realizados en células K562 derivadas de humano Fcy positivas mostraron una elevada amplificación de la infección en comparación con los controles. Adicionalmente, las muestras de plasma fueron administradas a ratones infectados con ZIKV en los que se evidencio un aumento de la viremia, morbilidad y algunos signos como fiebre. Finalmente, hasta la fecha el estudio más reciente de este fenómeno que involucra a DENV y ZIKV se encuentra reportado en los estudios realizados por ^{Brown et al., (2019)}, básicamente en un modelo animal de ratones homocigotos recesivos para Stat2 (knockout), que fueron infectados con ZIKV después de inocularlos con plasma de pacientes positivos para DENV o con plasma negativo para cualquier flavivirus. En el primer grupo se describió un aumento de seis veces en la replicación de ZIKV en la placenta y daños histopatológicos más acentuados en los ratones inoculados con sueros reactivos para DENV en comparación con los controles. Adicionalmente, se demostró que el pre-tratamiento con un anticuerpo monoclonal humano que tiene actividad amplificadora para DENV y ZIKV y su derivado modificado para no interactuar con FcyR, induce en el primer caso una disminución de tamaño en el feto y hasta un 50 % de reabsorción de la placenta y no así cuando se usa el monoclonal modificado, confirmando la reactividad cruzada y que el efecto de mayor infección y daño en la placenta es mediado por receptores Fc.

En contravía de estos hallazgos, en varios estudios no se ha identificado el fenómeno de ADE. Por ejemplo, no se encontró asociación con la presentación del síndrome de Guillain-Barré por ZIKV y la seropositividad previa para DENV en la Polinesia Francesa (^{Cao-Lormeau et al., 2016}). En una investigación realizada con voluntarios colombianos con serología positiva para ZIKV, sus sueros no indujeron ADE en monocitos U937 (^{Delgado et al., 2018}); lo cual se puede explicar por un alto título de anticuerpos neutralizantes en muestras tomadas antes de los dos años de haber cursado la infección.

Para el caso de otros Flaviviridae, en relación con la reactividad cruzada de anticuerpos de DENV no neutralizantes, en un estudio con pacientes pediátricos en Asia, se describió que el 57 % de los niños con anticuerpos específicos para virus de encefalitis japonesa (JEV) presentaban dengue sintomático, mientras que en el grupo de seronegativos para JEV la proporción fue de 46 % (^{Anderson et al., 2011}). En adición, aunque no se encuentra reportada amplificación debido a reactividad cruzada con anticuerpos para DENV, estudios en ratones como los realizados por ^{Gould y Buckley (1989)} describieron ADE entre los virus de la fiebre amarilla (YFV) y JEV, mientras que ^{Wallace et al., (2003)} identificaron en ratones el mismo fenómeno entre JEV y el virus de la encefalitis del valle de Murray (MVE).

Relación de ADE con la eficacia de las vacunas

Para comprender la relevancia que el fenómeno de ADE podría tener en una posible vacuna, es necesario entender que los serotipos de DENV poseen diferencias en sus secuencias de aminoácidos entre sí, por ejemplo, cuatro genotipos de DENV-3 difieren en aproximadamente el 7 % en los residuos de aminoácidos de la proteína E, y curiosamente, estos residuos se encuentran ubicados en lugares próximos o en sitios que podían ser reconocidos por anticuerpos (^{Wahala et al., 2010}). Es claro que una vacuna para DENV debe producir una respuesta inmune equilibrada de por vida para los cuatro serotipos, ya que una respuesta heterogénea de anticuerpos en los vacunados puede amplificar una infección secundaria e inducir una progresión hacia dengue grave. Una de las vacunas mejor conocidas y recientemente desarrollada, es la CYD-TDV (nombre comercial Dengvaxia), que fue diseñada utilizando el esqueleto de la vacuna contra la fiebre amarilla YF-17D (debido a su atenuación y a la inducción rápida y duradera de inmunidad) e insertando las proteínas E de los cuatro serotipos de DENV que dio como resultado una vacuna quimérica y tetravalente (^{Yauch y Shresta, 2014}). Fue la primera en ser aprobada para el uso en humanos, para esto se verificó previamente que cada serotipo inducía una excelente respuesta de anticuerpos y que también la formulación con los cuatro serotipos era adecuada. Sin embargo, en los estudios en humanos después de su administración parece producirse un fenómeno de interferencia, en el que uno de los virus no genera suficiente respuesta (^{Swaminathan et al., 2013}) y en ensayos clínicos por ejemplo se encontró que la inmunización tuvo mayor eficacia protectora para DENV-4 (77 %) y no tanto para DENV-2 (34 %) (^{Malisheni et al., 2017}).

Un análisis más detallado de las tasas de hospitalización por dengue en los grupos vacunados y no vacunados con la vacuna CYD-TDV, lanza algunas preocupaciones, pues la cifra de hospitalizados en quienes eran seronegativos para DENV antes de ser vacunados, es levemente mayor que en los vacunados seropositivos y que en aquellos que no fueron vacunados y que habitan en las zonas de estudio, permitiendo lanzar la hipótesis de que la vacuna "sensibiliza" a los seronegativos y los puede poner en una condición de riesgo de dengue grave (^{Halstead, 2017a}). La tasa de hospitalización de los vacunados a cinco años fue de 1,44 % (295/20 439) y el pico ocurrió en niños de cinco a ocho años, ya que seguramente por su corta edad eran seronegativos al momento de la vacunación. En principio, los datos publicados relacionados con esta vacuna, permiten inferir que las tasas de hospitalización no se reducen con el tiempo post-vacunación, posiblemente por la reducción en los títulos neutralizantes con el paso del tiempo, lo cual puede proporcionar en el individuo un ambiente ideal para que una infección por DENV se potencie, y se desencadene una modulación de los mecanismos de inmunopatogénesis que en última instancia conducirán a dengue grave y todas sus características clínicas conocidas.

Otra preocupación con respecto a las vacunas es la universalidad de la protección, en tanto los serotipos pueden tener variaciones especificas dependiendo del lugar geográfico en el que circulen, lo cual presupone que una vacuna que proteja de para los cuatro serotipos de DENV, debería estar en constante actualización o considerar la protección a virus de todo el mundo (^{Malisheni et al., 2017}).

Los resultados expuestos sugieren una amplificación de la enfermedad de dengue después de los cinco años de la administración de la vacuna CYD-TDV, debido a la disminución del potencial de neutralización de los anticuerpos y que conllevan a la aparición de reacciones cruzadas de anticuerpos durante infecciones naturales, favoreciendo el desarrollo de ADE. Se puede plantear que los anticuerpos que un individuo genera contra DENV después de la vacunación, no son suficientes para predecir la protección inmunológica de este individuo frente al virus, pues se ha propuesto que la inmunidad celular contra las proteínas no estructurales también juega un papel clave en la respuesta inmune y la protección contra dengue en las infecciones secundarias (^{Weiskopf et al., 2013}). Como esta vacuna está basada en el esqueleto del virus vacunal de fiebre amarilla, no se genera actividad para proteínas no estructurales de dengue que al parecer son necesarias para el adecuado control de la infección.

Una vacuna tetravalente que recientemente ha probado ser segura y bien tolerada conocida como DENVax o TAK-003, se basa en un esqueleto de un virus DENV-2 atenuado y en el cual han sido insertadas las proteínas prM y E de los otros serotipos, es capaz de generar una respuesta humoral y celular a largo plazo (^{Whitehead et al., 2017}), aunque se requiere comprobar que no induce ADE a largo plazo en individuos que viven en zonas endémicas. Para terminar, durante el desarrollo de una vacuna, se necesita considerar el fenómeno de reactividad cruzada no solo como uno de los factores para el desarrollo de ADE. El razonamiento de la existencia de epítopes conservados entre los flavivirus capaces de dar lugar a una "inmunidad generalizada" debe considerarse, sin embargo, serían necesarios diversos estudios para confirmar que estos epítopes pueden generar una inmunidad persistente