INTRODUCCIÓN

Escherichia coli y Salmonella spp. son bacterias entéricas comensales comunes a humanos y animales, importantes por su potencial riesgo zoonótico causantes de enfermedades de origen alimentario, con efectos importantes en la economía de los países ¹. De igual manera, son agentes causantes de enfermedades en porcinos, que causan grandes pérdidas económicas debido al aumento en la mortalidad, la disminución en la ganancia de peso y los costos relacionados con tratamientos ².

Dentro del grupo de antibióticos polimixinas se encuentra la colistina, éste fue ampliamente usado en porcinos como promotor del crecimiento ³, y para el tratamiento de infecciones entéricas ⁴. Asimismo, debido a la emergencia de patógenos Gramnegativos resistentes a cefalosporinas de tercera generación y carbapenémicos, se reintrodujo la colistina para su uso clínico en humanos entre la década de los ochenta y mediados de los noventa a nivel mundial (5,6).

Como consecuencia del amplio uso de la colistina, se ha registrado un aumento en la resistencia a este antibiótico en bacterias de humanos y animales ⁷. La resistencia a colistina se debe a la modificación del lipopolisacárido bacteriano a través de dos mecanismos principales: uno cromosómico, moderado por cambios genéticos en el sistema regulatorio de PhoPQ-PmrAB y, otro plasmídico, mediado por el gen de resistencia móvil a colistina (mobile colistin resistance, por sus siglas en inglés)⁴. Este último, es considerado de mayor importancia por su rápida diseminación, incluso entre bacterias patógenas de diferentes especies mediante mecanismos de transferencia horizontal ⁵.

La resistencia a colistina por mcr fue reportada inicialmente en China en E. coli y Klebsiella pneumoniae, de origen porcino a nivel de planta de beneficio animal, en carne de cerdo y de pollo ⁴. Actualmente, se han reportado diez variantes del gen mcr⁸,⁹,¹⁰,¹¹,¹²,¹³, siendo el mcr-1 la más frecuente ¹⁴. Específicamente en porcinos, el gen mcr-1 fue identificado en aislados de E. coli y Salmonella spp., a nivel de granjas, plantas de beneficio y en carne cruda, en diferentes lugares de los continentes asiático, americano y europeo ¹⁵.

En Colombia se reportó el gen mcr-1 en aislados humanos de E. coli, Salmonella enterica serovar Typhimurium, y K. pneumoniae¹⁶. Asimismo, se identificó el gen mcr-1 en aislados de Salmonella enterica en alimentos de origen animal ¹⁷ y en 86 aislamientos de E. coli provenientes de una granja porcícola ¹⁸. Recientemente, fue publicado la detección de este mismo gen en un 43.2% (240/555) de aislados crioconservados de Salmonella spp. provenientes de porcinos, aves, bovinos, equinos, caninos, peces, cuyes y tortugas morrocoy de diferentes partes del país ¹⁹.

Teniendo presente la posibilidad de que los porcinos actúen como reservorios de bacterias con resistencia a antibióticos, es importante monitorear la presencia de este tipo de microorganismos portadores de genes de resistencia durante la etapa de beneficio, por la alta probabilidad que tienen de llegar hasta el ser humano a través del consumo de productos cárnicos. En consecuencia, este estudio se planteó como objetivo evaluar la resistencia adquirida a colistina mediada por el gen mcr-I en aislados de E. coli y Salmonella spp., provenientes de muestras de materia fecal de porcinos con destino a consumo humano en una planta de beneficio animal ubicada en Medellín, Colombia.

MATERIALES Y MÉTODOS

Tipo de estudio: EL presente es un estudio descriptivo transversal.

Localización. Este estudio fue realizado del 2 al II de marzo del 2020, en una planta de beneficio animal ubicada en Medellín, Antioquia. Los porcinos provenían del departamento de Antioquia y de Caldas, criados en granjas tecnificadas, que alcanzaron la etapa de levante-ceba.

Selección de los animales. Se muestrearon 190 cerdos, seleccionados aleatoriamente a través de un muestreo sistemático, sometidos a inspección ante mortem, e identificados con la marca visible durante todo el proceso.

Colección de la muestra. Se recolectó un gramo de materia fecal directamente del ciego, se depositó en un recipiente estéril, e inmediatamente se diluyó en 2 mL de solución salina, siguiendo las recomendaciones del fabricante del CHROMID Colistina R agar (COLR)^® (BioMérieux, Lyon, Francia). Las muestras fueron transportadas en refrigeración hasta el Laboratorio de Diagnóstico ubicado en la Facultad de Ciencias Agrarias perteneciente a la Universidad de Antioquia para su procesamiento inmediato. Se utilizó un termómetro para asegurar que la temperatura no superara los 4°C.

Aislamiento de E. coli y Salmonella spp resistentes a colistina. Para el aislamiento selectivo (tamización), 50 uL de cada muestra fueron diluidos en 9 mL de caldo de enriquecimiento cerebro corazón (Brain and heart infusion- BHI Merk, Darmstadt, Alemania), con un disco de colistina (COL 10 ug) (Oxoid, Basignstoke, Reino Unido) e incubados a 35±2°C por 4 a 5 horas. Posteriormente, 50 uL del caldo previamente incubado fue sembrado por agotamiento en el agar cromogénico CHROMID Colistina R agar (COLR^®) (BioMérieux, Francia), y llevados nuevamente a incubación a 35±2°C durante 18 a 24 horas. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, las colonias de interés presuntivas de E. coli presentan un color rosa-burdeos y aquellas colonias presuntivas de Salmonella spp. presentan un color blanco 0 incoloro. Como cepa control positiva se usó la E. coli National Type Culture Collection NCTC 13846, y como negativa la E. coli American Type Culture Collection ATCC® 25922®.

De cada muestra se tomaron máximo dos colonias por morfotipo y se sembraron en agar MacConkey (Merk, Darmstadt, Alemania) suplementado con sulfato de colistina a 2mg/l siguiendo las recomendaciones de preparación de diluciones de trabajo de la ISO 20776-1: 2006, y posteriormente incubadas a 35±2°C durante 18 a 24 horas.

A partir del agar MacConkey, se seleccionaron las colonias con mayor similitud morfológica a las especies de interés, las cuales fueron resembradas en 3 mL de caldo BHI suplementado con sulfato de colistina a 2 mg/L e incubadas nuevamente a 35±2°C durante 18 a 24 horas, para luego ser congelados a -80°C en una suspensión de 300 uL de glicerol al 50% y 700 uL del crecimiento bacteriano en BHI.

Detección del gen mcr-1. Para el aislamiento del ADN bacteriano, se utilizó el Kit de extracción de ADN Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Madison, Estados Unidos). La existencia de gen mcr-1 fue identificada mediante PCR utilizando los cebadores descritos por Liu y colaboradores en el 2016 ³. Las amplificaciones de la PCR fueron visualizadas en gel de agarosa al 1% mediante electroforesis. Se utilizó como como control positivo la cepa BK47554 (aislado mcr-1 positivo) donada por el Laboratorio Kreiswirth del Center for Discovery and Innovation (CDI, New Jersey, USA).

Identificación bacteriana. La identificación bacteriana de las bacterias que albergaban el gen mcr-1 se hizo utilizando los paneles CIM Gramnegativos/paneles combinados y paneles NC72 específicos para bacterias Gramnegativas (Beckman Coulter, Indianápolis, Estados Unidos) utilizando el sistema Microscan^® (Beckman Coulter, Indianápolis, Estados Unidos), siguiendo las recomendaciones del fabricante.

Sensibilidad antimicrobiana. La evaluación de sensibilidad antimicrobiana se efectuó con la prueba de microdilución en caldo, utilizando los paneles NC72 específicos para bacterias Gramnegativas (Beckman Coulter, Indianápolis, Estados Unidos).

Se evaluaron e interpretaron un total de 21 antibióticos de acuerdo lo establecido por las directrices CLSI ²⁰: ampicilina, ampicilina/ sulbactam, aztreonam, cefoxitina, ticarciclina/ ácido clavulánico, cefotaxima, cefepima, piperacilina/tazobactam, ceftazidima, amicacina, gentamicina, tobramicina, tetraciclina, levofloxacina, trimetoprim/ sulfametoxazol, cefuroxima, imipenem, meropenem, ertapenem y ácido nalidíxico. La cepa E. coli ATCC 25922 se utilizó como control.

Análisis de datos. Los resultados fueron recopilados, filtrados y evaluados mediante estadística descriptiva en el software Excel 2003 (Microsoft Office, Redmond, Washington).

Aspectos éticos. El estudio contó con aval expedito por el Comité de Ética para la Experimentación con Animales de la Universidad de Antioquia (acta N° 127, septiembre del 2019).

RESULTADOS

Características de la población. Los animales muestreados provenían de 40 granjas diferentes, 38 de ellas del departamento de Antioquia, y 2 de Caldas, Colombia. La mayoría provenían de los municipios de Donmatías 41.5% (79/190), Yolombó 8.4% (16/190) y Medellín 6.8% (13/190). El 100% de los porcinos pertenecieron a la etapa de levante - ceba, de los cuales 48.4% (92/190) eran hembras y 51.6% (98/190) machos (Tabla 1).

Aislados de E. coli y Salmonella spp. resistentes a colistina. En el 70.5% (134/190) de las muestras hubo crecimiento de Salmonella spp y/o E. coli. en el medio cromogénico para la detección de resistencia fenotípica. El 56% (106/190) fueron compatibles con E. coli y 39%, (75/190) con Salmonella spp. (Tabla 1). En el 20.5% (39/190) de las muestras hubo crecimiento de ambas especies, y en el 29.5% (56/190) no se observó ningún crecimiento.

Detección del gen mcr-1. Se obtuvieron 49 aislados resistentes a colistina, que mantuvieron las características fenotípicas de las especies de interés y, posteriormente, procesados para la detección de mcr-1 mediante PCR. El gen mcr-1 se detectó en el 15.8% (30/190) de las muestras (Tabla 1).

Identificación bacteriana de aislados positivos al gen mcr-1. De los 30 aislados positivos al gen mcr-1, se recuperaron 15 posterior a la congelación. De estos, 4.2% (8/190) fueron E. coli, 1.0% (2/190) Salmonella enterica, y 2.6% (5/190) Providencia heimbachae. También se logró identificar el gen en aislados de Salmonella enterica y Providencia heimbachae, en uno de los predios del municipio de Medellín, Antioquia.

Evaluación de la sensibilidad antimicrobiana en aislados de E. coli y Salmonella spp., portadores del gen mcr-1. En los 10 aislados de E. coli y Salmonella entérica portadores del gen mcr-1, se observó resistencia a tetraciclina (10/10), seguidos por el trimetoprim/sulfametoxazol y ampicilina con resistencia (8/10), para ampicilina sulbactam (5/10), piperacilina tazobactam, ácido nalidíxico y tobramicina (3/10), gentamicina, cefuroxima y cefotaxima (2/10), y para ceftazidima del (1/10). Se observó sensibilidad (10/10) para levofloxacina y carbapenémicos (Tabla 2).

De forma específica para E. coli, se encontró en el grupo de los betalactámicos resistencia a ampicilina (7/8), ampicilina/ sulbactam (4/8), seguida por piperacilina/tazobactam (3/8), a cefuroxima (2/8), y para aztreonam, ceftazidima y cefotaxima (1/8), de igual forma, se identificó resistencia para trimetoprim/sulfametoxazol (6/8). En el grupo de los aminoglucósidos se observó resistencia a tobramicina (2/8), gentamicina (1/8), pero sensibilidad a amikacina (8/8). Para las quinolonas y fluoroquinolonas solo se observó resistencia para el ácido nalidíxico (2/8), y sensibilidad completa para la levofloxacina (8/8). Se identificó que el aislado E1092, fue positivo para la producción de BLEE presentando resistencia a cefotaxima y cefuroxima. Todos los aislados fueron sensibles para el grupo de los carbapenémicos evaluados (Tabla 2).

Para Salmonella enterica, se observó resistencia (2/2) trimetoprim/sulfametoxazol, y tetraciclina. En el grupo de los betalactámicos se observó resistencia para ampicilina, ampicilina/sulbactam y aztreonam (1/2). En los aminoglucósidos se observó resistencia para gentamicina y tobramicina (1/2) y, sensibilidad para amikacina. Solo se observó para las quinolonas y fluoroquinolonas un aislado resistente al ácido nalidíxico. Los aislados fueron sensibles a levofloxacina y al grupo de los carbapenémicos (Tabla 2).

De forma general se observa que todos los aislados (10/10), presentaron un patrón de multiresistencia, caracterizados por ser resistentes a un agente antimicrobiano en al menos 3 categorías de antibióticos ²¹.

DISCUSIÓN

En el presente estudio, se identificó la presencia de Salmonella spp y E. coli fenotípicamente resistentes a colistina, y portadoras del gen mcr-1 , en diferentes regiones de los departamentos de Antioquia y Caldas.

Todos los porcinos pertenecieron a la etapa levante - ceba, etapa donde se considera al porcino listo para ser beneficiado en planta de beneficio. La identificación de bacterias con genes de resistencia en esta etapa supone un riesgo por la posibilidad de diseminación a través de la cadena cárnica por contaminación de productos ²². La distribución equivalente de aislados que albergaban el gen mcr-1 en relación con el sexo de los animales posiblemente se deba a que no existe un manejo diferencial por sexo de los animales destinados para ceba.

La identificación del gen mcr-1 en varios individuos provenientes de un mismo predio, podría estar explicada por el uso de colistina como profiláctico ²³, el contacto directo entre cerdos portadores y no portadores, o exposición a un ambiente contaminado ²⁴. Por lo tanto, las buenas prácticas pecuarias, podrían ayudar a disminuir la permanencia de genes de resistencia a antibióticos a nivel de granjas, limitando el uso terapéutico de antibióticos cómo la colistina ⁴.

Por otra parte, la presencia del gen mcr-1 en aislados bacterianos de porcinos originarios de 6 de las 9 subregiones del departamento de Antioquia, podría sugerir que la resistencia a colistina se trata de un problema generalizado en el departamento. La necesidad de producir cada vez más y mejor, ha llevado a la implementación de medidas preventivas basadas en el uso antibióticos ²⁵. No obstante, el gen fue reportado también en otros departamentos de Colombia, indicando que la presentación de este gen puede darse en lugares con baja y alta producción de cerdos ¹⁹.

De forma particular, un estudio donde se analizaron aislados clínicos de bacterias Gramnegativas resistentes a colistina provenientes de muestras de humanos entre el 2002 y el 2016, se reportó resistencia fenotípica en un 8.7% (513/5887) y la presencia el gen mcr-1 en un 2.3% (12/513), siendo Antioquia, Valle del Cauca y Santander, en donde se identificaron la mayor cantidad de aislados resistentes y portadores del gen mcr-1¹⁶.

La frecuencia de E. coli portadora del gen mcr-1 encontrada en este estudio de (4.21%) es más alta a la reportada del 0.7% en plantas de beneficio en Europa ²⁶, y considerablemente más baja que las reportadas en cerdos en planta de beneficio en China del 21 % ³ y del 25.5% a nivel de granjas ²⁴. Esto podría explicarse dado los estrictos controles establecidos por las entidades gubernamentales de Europa relacionados con el uso de antibióticos, al contrario del uso masivo de colistina China ³.

Un estudio previo en Colombia reportó la presencia del gen mcr-1 en el 23.3% de aislamientos de Salmonella spp en granjas de cerdos, provenientes de 17 departamentos del país ¹⁹, siendo más alta que la reportada en el presente estudio (1.05%). Asimismo, las diferencias metodológicas con este estudio, podría explicar la baja frecuencia encontrada, además, a partir del 2018 el uso de colistina como promotor de crecimiento fue prohibido en Colombia por la Resolución 22747 del 208 del ICA. La frecuencia encontrada en este estudio es más cercana a la reportada en Europa del 0.1% en canales de porcinos en plantas de beneficio ²⁶. Estos reportes indican que los programas dirigidos a limitar el uso de colistina y pueden impactar positivamente en la disminución de resistencia cómo fue demostrado por China²⁷. Es por esto que, la estrategia Una Salud ha reconocido como beneficiosa y necesaria, la vigilancia de la resistencia antimicrobiana de origen zoonótico a través de la cadena cárnica ²⁸.

Basados en la hipótesis de Liu et al ³ en el 2016, del posible origen del gen mcr-1 a nivel de granjas porcinas, la detección del gen mcr-1 en enterobacterias de porcinos al beneficio, genera preocupación a nivel de salud pública, y refuerza la necesidad de garantizar la inocuidad del producto y la protección del consumidor.

De igual manera, puesto que las excretas animales son consideradas como biofertilizantes agrícolas ²⁹, la presencia de enterobacterias portadoras del gen mcr-1 en la materia fecal de cerdos de granja, podría suponer una fuente de contaminación ambiental, cuando es usada como abono de cultivos y pastizales ³⁰. Especialmente, para Salmonella spp., se identificó la capacidad para adherirse en productos agrícolas cómo vegetales y frutas, siendo una posible fuente de infección, o diseminación de mecanismos de resistencia ³¹.

La identificación del gen mcr-1 en aislados de los géneros Providencia y Salmonella spp., en una misma granja en este estudio, podría indicar la transferencia horizontal del gen a través de elementos genéticos móviles acelerando su diseminación ³². Providencia heimbachae es una bacteria Gramnegativa que posee resistencia intrínseca a colistina ³³, reconocida como agente etiológico en diarreas en lechones ³⁴.

Es probable que las muestras con aislados fenotípicamente resistentes sin detección del gen mcr-1, presentaran mecanismos cromosómicos de resistencia antimicrobiana que se dan a través de la modificación del sitio de acción del antibiótico ³³, o que albergaran otra de las 10 variantes del gen mcr reportadas a nivel mundial hasta el año 2021 ⁹.

La identificación de aislados multirresistentes, genera una gran preocupación por la diminución crítica de las posibles opciones terapéuticas ²¹. Especialmente, se resalta los aislados E. coli 109E2, solo susceptibles a carbapenémicos y a fluoroquinolonas y el 167E1 solo a carbapenémicos. A razón de estos hallazgos, se enfatiza que la aparición de estas bacterias con un amplio espectro de resistencia a antimicrobianos, pudiera impactar negativamente la salud animal debido al fracaso terapéutico y generar pérdidas económicas ²².

Los aislados de nuestro estudio que albergaban el gen mcr -1 mostraron una alta resistencia especialmente a ampicilina y tetraciclina, en concordancia con lo reportado por Arenas et al ²², quienes encontraron que el uso no terapéutico de antibióticos constituyó la mayor presión selectiva relacionada en las practicas pecuarias a nivel nacional.

Cepas de E. coli y de Salmonella spp. portadoras de genes tipo mcr y productoras de BLEEs, han sido reportadas en diferentes contextos tanto en animales como en humanos ³⁵. Aunque en este estudio sólo un aislado presentó esta característica, este hallazgo de resistencias conjuntas, sigue representando un gran reto en las estrategias de control en el uso de antibióticos bajo el enfoque de una salud ³⁶.

Este estudio presentó varias limitaciones. Primero, debido a la emergencia sanitaria decretada en marzo de 2020 a razón de la pandemia del COVID-19, no fue posible alcanzar el tamaño muestral calculado (n=321). Segundo, no se incluyeron las condiciones de uso previo de colistina por parte de los productores y finalmente, este estudio se enfocó en la detección del gen mcr-1 por lo que los aislados podrían presentar otras variantes del gen.

En conclusión, esta investigación encontró una alta frecuencia de resistencia fenotípica adquirida a colistina y la circulación del gen tipo mcr-1 en cerdos al momento del sacrificio, lo que demuestra el efecto que puede tener el uso previo de la colistina en la selección de aislados resistentes en porcinos. Por consiguiente, y con el fin de limitar la diseminación de estos genes de resistencia en la cadena alimentaria y el ambiente, el monitoreo de este fenómeno desde el enfoque de Una Salud podría identificar de manera más amplia y precisa los determinantes ecológicos que impactan de forma crítica la diseminación de agentes zoonóticas portadores de genes de resistencia a antibióticos, logrando de manera objetiva establecer estrategias de mitigación y control efectivas que logren mantener la inocuidad de los alimentos origen animal, y el riesgo ambiental que supone el uso y disposición de residuos generados en la industria pecuaria