INTRODUCCION

Hevea brasiliensis es una especie de la familia Euphorbiaceae originaria de la región amazónica, cuyo cultivo comercial se orienta a la producción de caucho natural en más de 40 países. Entre estos se destacan Vietnam, Indonesia, Tailandia, Malasia, India y China, en la actualidad los países con mayor área destinada al cultivo. En consideración a fuertes limitantes fitosanitarios, particularmente derivados de la incidencia del Mal Suramericano de las Hojas (SALB, por sus siglas en inglés), en América solo se cultiva alrededor de 2% del total del área (^{Hou et al., 2017}).

Recientemente, en Colombia, el cultivo de caucho ha cobrado gran importancia cómo resultado de iniciativas públicas y privadas que consideran a la “heveicultura” una actividad que promueve el desarrollo económico y social, desde una perspectiva agroindustrial. En tal sentido, mientras que en el 2.000 se contaba con poco menos de 6.000 ha de caucho, en el 2015 se identificaron alrededor de 68.000 ha, distribuidas por todo el territorio nacional y concentradas principalmente en la Orinoquía, el Magdalena Medio, Antioquia, Córdoba y la Amazonia (Confederación cauchera Colombiana, 2015.). El incremento del área sembrada ha sido posible gracias a la identificación de Zonas de Escape al SALB, una aproximación metodológica que permite la determinación de áreas y clones apropiados para el cultivo de caucho. No obstante, subsisten dificultades tecnológicas que garanticen la identidad de los clones de caucho a comercializar, cuyo destino es el establecimiento de nuevas áreas (^{García et al., 2011}). Por tal razón, bajo el marco legal de la resolución No. 001478/2006 ICA, el estado colombiano exige hoy día que los jardines de propagación clonal certifiquen mediante análisis genéticos la identidad de los clones de H. brasiliensis que comercializan, a fin de garantizar la adquisición de plantas conforme a los requerimientos determinados por el productor a partir de la vocación de los suelos en sus fincas y la zonificación.

En consecuencia y como respuesta a esta demanda, la homologación de clones de caucho en tiempos recientes se soporta cada vez con mayor énfasis en la conducción de análisis genéticos utilizando marcadores moleculares micro satélites conocidos también cómo STR (del inglés “Short Tandem Repeat”). Independientemente del estado fenológico y variaciones metabólicas derivadas del ambiente, los STR facilitan la identificación de variedades y cultivares con base en su nivel de polimorfismo, codominancia, repetibilidad y, más recientemente, posibilidades de automatización (^{García et al., 2011}).

Como respuesta a los requerimientos esbozados más arriba, el presente estudio tuvo como objetivo evaluar 9 marcadores moleculares microsatélites (STR) amplificados mediante primers fluoromarcados y visualizados por electroforesis capilar a partir del ADN extraído de muestras foliares de 12 clones de H. brasiliensis, provenientes de jardines clonales de colección en Colombia y 25 clones conservados en jardines de origen para la propagación clonal en Brasil. El propósito fue seleccionar los marcadores con mayores índices de polimorfismo, para a su vez generar patrones electroforéticos por clon que permitan disponer de tecnologías más apropiadas para la identificación más precisa de los materiales genéticos a homologar.

MATERIALES Y METODOS

El estudio se realizó en el laboratorio de genética molecular de AGROSAVIA, en el Centro de Investigación Tibaitatá, ubicado en el kilómetro 14 vía Mosquera. Se evaluaron 12 clones de Hevea sp.: FX 3864, RRIM 600, FDR 5788, CDC 312, FDR 5240, FDR 5597, FDR 4575, PMB 1, MDX 607, CDC 56, MDX 624 y CDC 1174 provenientes del Jardín Clonal de AGROSAVIA en La Libertad, Villavicencio y 25 clones del Jardín Clonal del Instituto Agronómico de Campinas (IAC-APTA) en Votuporanga - Brasil: IAC 424, IAC 500, IAC 501, PB 314, IRCA 18, IAC 502, IAC 503, IAC 505, IAC 511, PB 330, PB 312, FX 3864, PB 217, PB 235, IAN 873, RRIM 915, RRIM 901, IAC 302, RRIC 100, IRCA 331, IRCA 317, IRCA 230, PB 260, PB 254 y FX 2261.

De cada uno de los clones se tomaron 3 foliolos en estado de desarrollo juvenil que se conservaron con sílica gel dentro de bolsas de papel. Una vez extraído el ADN mediante el protocolo reportado por ^{Salavarrieta (2002)}, se procedió a la amplificación por PCR de las regiones microsatélites: Hmct5 y m574 (^{Barrera et al., 2015}); HV 15 y HV 30 (^{Regina et al., 2010}); 102 , 548, 416, 103 y 358 (^{García et al., 2011}).

Calidad y concentración de ADN: la integridad del ADN extraído fue visualizada en gel de agarosa al 1% y su concentración y calidad medida por NanoDrop (2000, Thermo Fischer Scientific^TM, Massachusetts). En virtud de que todas las muestras presentaban una concentración superior a 200 ng * (L^-1, estas se llevaron a una misma concentración de 75 ng * (L^-1 con el fin de permitir la amplificación de los marcadores seleccionados, mediante PCR punto final.

Amplificación de ADN: se usó un termociclador marca Bio-Rad (C 1000TM, California, USA) modificando la temperatura de anillamiento del protocolo para algunos de los primers utilizados (Tabla 1). Para el máster mix de la reacción se utilizó MgCl₂ a concentración de 2,5 mM, Buffer 0,6 X, dNTPs 0,3 mM, taq polimerasa 0,04 U* µL^-1, primer forward y reverse a 0,3 (M cada uno. Adicionalmente, se usó 2 µL de ADN a concentración de 75 ng* µL^-1. El volumen de reacción final fue de 15 µL cómo lo reporta el manual del kit. Así mismo, las condiciones de amplificación por PCR se describen en la (Tabla 2).

Visualización de alelos: La preparación de las muestras se realizó mezclando el producto de PCR de tres marcadores según la PLEX y el fluoróforo descrito en la (Tabla 1), a una relación de 1:15. Posteriormente, se tomó la mezcla de cada uno de los clones amplificados por grupo de marcadores y se le adicionó HI-DI formamida (Thermo Fischer Scientific^TM, Massachusetts) y marcador de peso molecular GeneScan 500 LIZ dye (Thermo Fischer Scientific^TM, Massachusetts). Las muestras fueron denaturadas y analizadas en el secuenciador ABI 3500 (Applied Biosystems, California). Finalmente, el perfil electroforético se analizó con el programa GeneMapper® (Thermo Fischer Scientific^TM, Massachusetts) y se determinaron los tamaños de los diferentes alelos para cada uno de los marcadores evaluados sobre los clones.

Es importante destacar que durante el proceso de visualización se tomó 1 (L de la mezcla de cada uno de los clones amplificados por el grupo de marcadores y se colocó en pozos independientes de una placa diseñada para 96 muestras. A este volumen se le adicionó 10 (L de Hi-DI formamida y 0,5 (L de liz 500. Posteriormente, las muestras se llevaron a 95 (C en el termociclador durante 5 minutos, con el fin de denaturar la doble hebra del ADN amplificado; seguidamente se llevó a 4 (C durante 5 minutos. Una vez concluido este proceso se corrieron en el quipo ABI 3500 (Applied Biosystems, California) y se visualizaron mediante el programa Gene Mapper reportando los datos obtenidos en la (Tabla 3).

Tabla 3 Peso de alelos de 12 clones provenientes de Colombia y 25 de Brasil para las regiones microsatelites Hmct5, 102, HV 30, 548, HV 15, 416, m574, 103 y 358. 

Análisis de polimorfismos: Con el fin de evaluar el nivel de polimorfismo de los marcadores utilizados se determinaron los contenidos de información polimórfica (PIC), Heterocigosidad esperada (He) y Heterocigosidad observada (Ho). La determinación del contenido de información polimórfica fue obtenido mediante la implementación de la formula PIC = 1 - ∑ fi₂ i = 1, donde fi₂ es la frecuencia del ith alelo (^{Garcia et al., 2011}).

La heterocigosidad esperada (He) se calculó como He = 1 - ∑ pi₂, donde “p” es la frecuencia del ith alelo en los genotipos evaluados. Por último, se estimó la heterocigosidad observada (Ho) a partir del resultado del cociente del número de individuos heterocigotos sobre el número total de individuos analizados.

Una vez determinados estos valores se calculó el coeficiente de similitud de Nei (1978), mediante procedimientos derivados de rutinas con el software estadístico R studio (R CORE TEAM, 2015) y se graficó un dendograma con base en el resultado de la aplicación del algoritmo de agrupamiento UPGMA (Unweighted Pair Group Method With Arithmetic Mean).

Observación: a pesar de que la metodología es clara y bien estructurada, se deben adicionar las referencias de las técnicas utilizadas en este estudio. Las técnicas no son con base a un protocolo de un articulo previamente descrito. La utilización del equipo se hace con base a las recomendaciones del fabricante Thermofischer scientific y del equipo ABI 3500, marcas que son referenciadas en la descripción del proceso.

RESULTADOS Y DISCUSION

Al determinar el contenido de información polimórfica (PIC), heterocigosidad esperada (He) y heterocigosidad observada (Ho) (Tabla 4) en la población analizada, se pudo concluir que todos los marcadores implementados mostraron un alto polimorfismo, el cual contenía clones de procedencia asiática y americana.

Con base en el contenido de información polimórfica (PIC) podemos afirmar que los marcadores más polimórficos sobre los clones evaluados en este estudio son los microsatélites HV30 y HV 15 con PIC = 0,92; microsatélite Hmct5 con PIC 0,91; microsatélites 102 y m574 con PIC 0,90; y microsatélites 548, 103 y 358 con PIC 0,89, en orden descendente.

El análisis de similitud permitió diferenciar 3 grandes grupos de clones, sin que necesariamente incluyan materiales procedentes de un mismo programa de fitomejoramiento en Asia o América (Figura 1). En el cluster I encontramos los clones PMB 1, RRIM 600, FX 3864ª, PB 314, IAC 500, IRCA 18, PB 217, FX 3864, IAC 302, RRIM 901, IAC 505, IAC 503, IAN 873, CDC 56, PB 312, FDR 5788, CDC 1174, CDC 312 y IAC 501. Algunos de estos clones, como es el caso de los materiales RRIM 600, PB 314 y RRIM 901, tienen en común los parentales PB 86 y Tijr 1(Gouvea et al., 2010). En el cluster II, encontramos los clones IRCA 230, IRCA 317, FX 2261, IRCA 331, PB 254, PB 260, FDR 5240, PB 330, FDR 5597, RRIM 915 y PB 235, en donde particularmente se evidencia una estrecha relación entre los materiales de origen asiático PB 330, PB 235, PB 260, PB 254 y RRIM 915. La mayoría de estos clones fueron obtenidos a partir de cruzamientos con materiales PB 5/51 (PB 56 * PB 24), entre sus parentales (^{Morini et al., 2012}). Finalmente, en el cluster III encontramos los materiales RRIC 100, IAC 502, FDR 4575, MDX 607, IAC 511, IAC 424 y MDX 624 (Figura 1).

Figura 1 Dendograma obtenido mediante el algoritmo de agrupamiento UPGMA a partir del coeficiente de similitud de Nei (1987). 

Con la aplicación de esta técnica se evidencian las diferencias genéticas entre los clones asiáticos y americanos. En tal sentido, por ejemplo, amplificaciones del locus Hmct5 había sido reportado con valores He = 0,74 y Ho = 0,75 para clones asiáticos únicamente (^{Saha et al., 2005}), mientras que en el presente estudio mostró un mayor valor para estas variables al ser aplicado sobre clones tanto asiáticos como americanos He = 0,88 y Ho = 0,95.

Con base en los marcadores evaluados no se pudo establecer diferencias entre los clones IRCA 317 e IRCA 230, los cuales expresaron un perfil electroforético idéntico para estos loci. Adicionalmente, de los STR’s evaluados, el único que permite discriminar entre el clon RRIM 600 y PB217 es el HV15 (PLEX 2). Entre tanto, el marcador 358 de la PLEX 3, se constituye en el único marcador que permite discriminar entre los clones PB 235 y PB 260. Entretanto, el único marcador que discrimina al clon FX 3864 de los clones RRIM 600 y PB 217 es el STR 358, en la PLEX 3.

De las muestras evaluadas del clon FX 3864, las procedentes del jardín clonal en Colombia proporcionaron perfiles electroforéticos distintos a las del FX 3864 proveniente de Brasil. Ello, particularmente, con los microsatélites Hmct 5, 102, HV 30, HV 15, m574 y 103. La información corrobora los resultados obtenidos por ^{Garcia et al. (2011)}, quienes sugirieron que el origen de las diferencias radica en el ingreso sin identificación confiable de origen de los clones de caucho a Colombia.

Con base en los resultados obtenidos es posible afirmar que el proceso de amplificación por PCR punto final y posterior electroforesis capilar con al menos un cebador fluoromarcado es una herramienta altamente sensible que permite aprovechar el carácter codominante de los marcadores moleculares microsatélites y el polimorfismo de las regiones evaluadas para la diferenciación por origen de clones de caucho. Además, es importante destacar que el método de visualización por electroforesis capilar permite determinar el valor exacto de las regiones amplificadas, aspecto por el cual, fue posible obtener valores PIC y He.

Observación: la discusión se debe ampliar, comparar con resultados obtenidos por otros autores con los mismos o diferentes marcadores moleculares y o técnicas utilizadas para caracterizar clones, de tal manera que quede patente la ventaja de la aplicación de esta metodología.

CONCLUSIONES

La herramienta permitió implementar una matriz de información que facilita el proceso de certificación de clones de H. brasiliensis provenientes de jardines de propagación clonal en Colombia. Su determinación y reproducibilidad, a partir de la evaluación sobre 37 clones procedentes de jardines de propagación clonal de Brasil y Colombia, garantiza la amplificación de material vegetal, a fin de cumplir con los requisitos establecidos por la resolución No. 001478/2006 ICA para la comercialización de material vegetal con destino a la ampliación y reposición de áreas con caucho. Por último, mas no menos importante, la metodología de visualización por electroforesis capilar en forma multiplexada, constituye una alternativa que permite evaluar varias regiones de forma simultanea, reduciendo costos.