2.1 Obtención de biomasa y condiciones de cultivo

La microalga utilizada en este estudio fue suministrada por el Laboratorio de Microorganismos Fotosintéticos de la Universidad del Zulia, Maracaibo (Venezuela). Se cultivó en recipientes de vidrio de 3,0 L con un volumen efectivo de 2,5 L, empleando agua potable previamente esterilizada y, como medio de cultivo el fertilizante comercial "Nutrifoliar", el cual suministra los macronutrientes K, Mg, S, P, Cl y los micronutrientes Fe, Cu, Zn, Mn, B y Mo, necesarios para un normal crecimiento celular. Los bioreactores se mantuvieron bajo iluminación superficial mediante tubos fluorescentes de 125 µEnr²s^-1 (Philips TL 65W 25, luz blanca) sometidos a un ciclo de 12h luz/12h oscuridad y con aireación permanente con el objeto de proporcionarles suficiente oxígeno disuelto. El crecimiento de la microalga se evaluó midiendo la absorbancia de la clorofila a una longitud de onda (λ) igual a 647 nm. La temperatura promedio de los bioensayos fue de 25°C.

Diariamente se tomó una alícuota del cultivo y se realizó la medición del crecimiento con un espectrofotómetro UV-vis (Genesis 20 Thermo Spectronic), en donde se midió la absorbancia que es proporcional a la concentración de las microalgas en el cultivo.

2.2 Muestra del agua residual

La muestra de agua residual fue colectada en un punto localizado antes del vertimiento final de una empresa textil ubicada en el municipio de Juan de Acosta, departamento del Atlántico, dedicada al teñido de prendas de vestir tipo jean. Se tomó una muestra representativa y se guardó en un envase plástico para la realización de los bioensayos y las respectivas caracterizaciones sin ningún tipo de tratamiento preliminar. La muestra de agua residual, se caracterizó antes y después del tratamiento con microalga Chlorella sp., determinando los parámetros DBO₅, DQO, nitrógeno total, fosfatos y concentración del colorante.

2.3 Colorante

El colorante precursor del utilizado en esta investigación es el color índigo (CI Vat Blue I) o índigo tina, con fórmula química C₁₂H₁₀O₂N₂, (figura 1), que es un polvo cristalino azul oscuro. La estructura del color producido es un sistema conjugado o grupo H-cromóforos que consiste de un enlace doble entre carbonos sustituidos por dos donadores NH y dos aceptores CO. Su principal aplicación es en la industria de los blue jeans y otros productos del Denim azul ⁸. El colorante índigo fue suministrado por la empresa textil cuyo nombre se mantendrá en reserva.

Figura 1 Estructura química del colorante índigo. 

2.4 Curva de calibración del colorante

Para la elaboración de la curva de calibración, se preparó por duplicado soluciones del colorante a diferentes concentraciones (1, 10 y 100 mg.dm^-3), a cada una de ellas se le midió la absorbancia a la longitud de onda (λ) de máxima absorción, previamente determinada por un barrido completo en el espectrofotómetro UV-vis.

2.5 Bioensayos de decoloración del agua residual con la microalga Chlorella sp.

Para los bioensayos de crecimiento biológico de la microalga viva y en suspensión se trabajó con el cultivo "stock" adaptado de la Chlorella sp. Bajo el sistema de estudio en "batch" se colocaron en diferentes frascos de vidrio previamente esterilizados 250 cm³ de agua residual y biomasa algal a 0,10, 0,20 y 0,30 de absorbancia medidos a una A igual a 647 nm, en presencia de nutrientes a la temperatura del laboratorio de 25 ± 1°C, con agitación constante a través de bombas de aire y fotoperiodos de luz día/ noche de 12 h. Simultáneamente se realizó un control de crecimiento con un cultivo de Chlorella sp. en un medio estéril a los mismos valores de absorbancia de los bioensayos. El seguimiento de la evolución del proceso de bioremoción consistió en tomar alícuotas de los biorreactores, luego se centrifugaron a 3.000 rpm por 10 segundos. Al líquido sobrenadante se le midió su absorbancia por espectrofotometría y se calculó el porcentaje de colorante removido, reemplazando los valores correspondientes en la ecuación 1^14,15.

Donde A_o es la absorbancia inicial del medio y A_e es la absorbancia del medio decolorizado.

Todos los bioensayos se realizaron por triplicado y se trabajaron a las mismas condiciones de laboratorio.

3.1 Curva de crecimiento

La curva de crecimiento de la microalga Chlorella sp. se muestra en la figura 2. Teniendo en cuenta las fases de una curva típica de crecimiento no se observa la fase de latencia, esto es posible porque la microalga que se tomó para el estudio se encontraba en fase de crecimiento exponencial y al colocarse en un medio de cultivo similar en presencia de nutrientes como el nitrógeno y el carbono que influyen en la composición bioquímica, permitió que su adaptación fuera más fácil. Posteriormente entre los días 13, 14 y 15 se presenta la fase estacionaria, alcanzando su máximo crecimiento el día 15. En esta fase se muestra un desarrollo pausado atribuido al agotamiento de nutrientes por el aumento de la población algal. Finalmente el crecimiento disminuye apreciablemente entre los días 17 y 18, lo cual se conoce como la fase de muerte.

Figura 2 Curva de crecimiento de la microalga Chlorella sp. 

3.2 Curva de calibración del colorante

A una solución patrón del colorante se le realizó un barrido entre 400 y 700 nm alcanzando su máxima absorción a los 493 nm, tomándose este valor para medir la absorbancia del colorante en los bioensayos posteriores. La figura 3 muestra el ajuste de los datos experimentales a una línea recta. El factor de correlación (R²) de 1, muestra la relación directa entre la concentración del colorante y su absorbancia.

Figura 3 Curva de calibración del colorante. 

3.3 Análisis del crecimiento de la microalga Chlorella sp. en el agua residual coloreada

La figura 4 muestra las diferentes curvas de crecimiento de la microalga Chlorella sp. a diferentes absorbancias iniciales y sus respectivos controles. Al comparar las curvas de crecimiento se observa una notoria inhibición de la Chlorella sp. en el agua residual debido a los niveles de toxicidad y contaminación a los cuales se ven sometidas. Mientras los bioensayos de 0,1, 0,2 y 0,3 de absorbancia inicial llegan a alcanzar valores de 0,84, 1,16 y 1,54 de absorbancia máxima respectivamente, para los mismos días las lecturas de los controles fueron de 1,73, 2,03 y 2,37. Estos resultados muestran la importancia del efecto de la luz en la productividad del cultivo.

Figura 4 Curvas de crecimiento de la microalga Chlorella sp. en el agua residual y sus respectivos controles. 

Los colorantes disueltos en el agua actúan como compuestos xenobióticos que interfieren en el metabolismo de la microalga, reduciendo notablemente la penetración de la luz al medio y en consecuencia, se disminuye la actividad fotosintética y la velocidad de crecimiento¹⁶. Además, se ha reportado que esta inhibición puede ser causada por la interacción de los colorantes con las paredes de la célula de la Chlorella sp. interfiriendo en su actividad enzimática y celular¹⁷.

3.4 Remoción del color en el agua residual por la microalga Chlorella sp.

La figura 5 muestra los resultados de los bioensayos para remover el color del agua residual, comparando la variación de la concentración del colorante en el tiempo. De la figura se observa que en los primeros días de los bioensayos la microalga en su fase de latencia elimina gran parte del color, es así como al tercer día se había removido el 19,5, 35,6 y 48,3% de la concentración inicial de colorante (87 mgdm^-3), para las absorbancias de 0,1, 0,2 y 0,3 respectivamente. A partir del día 18 no se registraron modificaciones en la concentración de colorante alcanzando valores finales de 8,67, 5,14 y 2,4 mgdm^-3, para cada una de las absorbancias estudiadas. El bioensayo con absorbancia inicial de 0,3 logró remover el mayor porcentaje de colorante del agua residual correspondiente al 97,2%. Sin embargo, las absorbancias de 0,1 y 0,2 lograron remover el 90,0 y 93,1% del colorante respectivamente.

Figura 5 Variación de la concentración del colorante en el agua residual en presencia de la microalga Chlorella sp. D1, D2 y D3 representan los bioensayos a 0,1, 0,2 y 0,3 de absorbancia inicial y, Cc es el bioensayo de control. 

A pesar que la presencia del colorante inhibe el crecimiento normal de la microalga, se observa en los bioreactores la disminución paulatina del color.

Se sugiere que la degradación del colorante índigo se debe al proceso oxidativo realizado por la enzima lacasa¹⁸. La oxidación implica la transferencia de electrones hasta obtener isatina que luego por descarboxilación produce el ácido antranílico como producto estable final de la oxidación (figura 6). La degradación procede por vía deshidroíndigo como una reacción intermedia donde la función de la lacasa consiste en incrementar la susceptibilidad del colorante hacia el ataque hidrolítico del agua^8,18. Posteriormente es posible realizar la mineralización del colorante a CO₂ y H₂O por medio de la degradación del anillo bencénico obteniendo intermediarios como benceno dihidrodiol, catecol, hasta obtener acetaldehído y piruvato entrando al ciclo de Krebs¹⁹.

Figura 6 Posible mecanismo de degradación del colorante índigo por la enzima lacasa. Tomado y adaptado de la referencia¹⁸. 

Por otro lado, es posible que en los últimos días de la fase de declinamiento en la microalga Chlorella sp. se establecieran procesos de remoción mediante la adsorción y absorción de los colorantes por la pared celular. La figura 5 en su curva de control muestra que el colorante no sufre proceso de fotodegradación al mantenerse constante la absorbancia durante los días que duró el experimento.

3.5 Evaluación de los parámetros DBO, DQO ₅ , nitrógeno total y fosfatos

En la tabla 1, se resumen los datos obtenidos en la evaluación de algunos parámetros fisicoquímicos del agua residual de la empresa textil. Los resultados muestran una disminución de los parámetros analizados a todas las absorbancias estudiadas, pero el comportamiento indica que entre mayor es la concentración de Chlorella sp. en el medio, mayor es el porcentaje de remoción.

Los tratamientos biológicos son reconocidos para el tratamiento de efluentes por su capacidad de reducir DBC y DQO^20,21, muestra de esto son los buenos resultados obtenidos en este estudio, alcanzado valores del 95,4% y 94,6% para la DBC₅ y DQO respectivamente para los experimentos con absorbancia 0,3. En el agua residual se encuentran presentes nutrientes que bien pueden estar en forma sencilla como CC₂, nitratos, etc., o como estructuras más complejas como los colorantes, que al ser degradados forman compuestos simples que suministran carbono y nitrógeno fundamentales para el crecimiento de la microalga, esto indica que la misma carga orgánica y mineral presente en el agua residual se convierte en fuente de alimento para las microalgas.

Los porcentajes de remoción de nitrógeno y fosfatos por la microalga en el agua residual fueron significativos, alcanzando valores superiores al 98% para el nitrógeno y del 65% para los fosfatos, teniendo en cuenta que normalmente para la remoción de estos nutrientes es preciso aplicar tratamientos terciarios.. Esto se debe a que son nutrientes esenciales en la formación de biomasa²², por lo que incorporan el amonio, nitrato y fósforo por absorción directa²³.