Origen de la HN

La HN es un péptido de 24 aminoácidos originalmente aislado de una biblioteca de ADNc mientras se buscaban factores de supervivencia en un área del cerebro no afectada de un paciente con enfermedad de Alzheimer ¹. La HN es transcripta a partir de una porción del gen mitocondrial policistrónico MT-RNR2, que codifica al gran ARN ribosomal (ARNr) mitocondrial 16S ². El ADNc de la HN está poliadenilado, por lo que puede estar involucrado en la exportación del transcripto de la HN desde la mitocondria hacia el citoplasma para su posterior traducción. Curiosamente, cuando el ARNm de la HN es traducido dentro de la mitocondria, origina un péptido de 21 aminoácidos. Sin embargo, cuando el mismo se traduce en el citoplasma, resulta en un péptido de 24 aminoácidos. De todas formas, ambos péptidos son funcionales y pueden inhibir la vía apoptótica mitocondrial ³. La HN ha sido detectada tanto en tejidos como en plasma ^4-6. Sus niveles circulantes fluctúan acorde a la edad y han sido propuestos como biomarcadores para varias condiciones patológicas.

El marco abierto de lectura (ORF) de 75 bases del ARNr mitocondrial 16S codifica la secuencia aminoacídica Nt-MA-PRGFSCLLLLTSEIDLPVKRRA-Ct (Nt-Met-Ala-Pro-Arg-Gly-Phe-Ser-Cys-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Ser-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Ala-Ct), donde GFSCLLLLTSEIDL es la región nuclear hidrofóbica ^3,7. Uno de los mecanismos por los cuales actúa la HN es a través de la unión a su receptor trimérico de membrana ^8), por lo que debe ser secretada fuera de la célula después de la traducción para ejercer su función citoprotectora autócrina/ parácrina. La secuencia primaria completa de la HN actúa como una secuencia señal en sí misma, sin necesidad de ser escindida para poder liberarse. La liberación de la HN depende del transporte entre el retículo endoplasmático (RE) y el aparato de Golgi ¹. Algunos aminoácidos específicos tienen un papel esencial para la correcta secreción y función de la HN. Estudios de mutagénesis del grupo de Hashimoto et al.⁷ revelaron que la HN tiene una región de 17 aminoácidos que sería la mínima región con máxima actividad citoprotectora, donde Pro, Cys, dos Leu consecutivas, Thr, Ser y Pro son aminoácidos esenciales en las posiciones 3, 8, 9, 12, 13,14 and 19, respectivamente. La Cys de la posición 8 ha demostrado ser necesaria para la inhibición de la apoptosis pero puede substituirse alternativamente por Lys o Arg ¹. Bodzioch y colaboradores postularon que la Pro de la posición 19 permitiría la secreción de la HN, mientras que la unión al receptor sería determinada por Pro, Thr y Ser en las posiciones 3, 13 y 14, respectivamente ⁹. La estructura secundaria de la HN también depende de ciertos aminoácidos como la Leu y la Ser en las posiciones 9 y 7, respectivamente, aminoácidos claves si se tiene en cuenta que la inhibición de la formación de dímeros u oligómeros del polipéptido de HN impide su función neuroprotectora ^3,10. Asimismo, la D-Ser en la posición 14 estaría involucrada en la isomerización de la HN ¹⁰. También se ha señalado que la HN adquiere una conformación helicoidal que resulta necesaria para interacciones específicas y su pasaje a través de las membranas ¹¹.

Interesantemente, ORFs adicionales fueron detectados para seis péptidos pequeños similares a la HN, llamados SHLPs (del inglés small HN-like peptides), en la región mitocondrial del ADN que codifica para la HN ¹². SHLP2 y SHLP3, de 26 y 28 aminoácidos respectivamente, inhiben la vía apoptótica intrínseca y mejoran el metabolismo mitocondrial ¹². No obstante, aún hay controversia respecto a la fuente celular de los péptidos pertenecientes a la familia de la HN, ya que hay evidencia que sugiere que la HN podría también ser codificada desde el ADN genómico, dado que se encontró una homología del 92-95% con el gen de la HN en los cromosomas humanos 5, 11 y X ¹. Además, se encontraron 12 loci nucleares similares a MT-RNR2 que codifican para 15 péptidos similares a la HN ⁹. Si bien análisis bioinformáticos detectaron la expresión de 10 genes similares a MT-RNR2 en varios tejidos, incluyendo testículos, riñón, músculo y cerebro, la expresión del gen mitocondrial es considerablemente más alta que la de sus isoformas nucleares en todos los tejidos estudiados ⁹.

Regulación de la expresión de la HN

La concentración en plasma de la HN en humanos y ratón, así como en el hipotálamo de rata, va disminuyendo con la edad ^13,14. Además, las ratas presentan una pérdida significativa de HN en el músculo esquelético durante el envejecimiento ¹⁴. Debido a estos resultados, se planteó que la HN podría ser un péptido inhibidor del envejecimiento. De hecho, altos niveles de HN en plasma humano se encuentran asociados a longevidad, como puede observarse en personas centenarias ¹⁵. En contraste, la expresión de la HN aumenta en los testículos de rata con el paso del tiempo ¹⁶. Ciertas proteínas pueden interactuar con la HN e inhibir sus efectos neuroprotectores. VSTM2L (V-set and transmembrane domain containing 2 like) puede antagonizar a la HN tanto en suero como en el sistema nervioso central (SNC) ¹⁷ así como los niveles de HN circulante pueden controlarse por su interacción con el factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) y proteínas de unión a IGF (IGFBP). IGFBP-3 es una proteína transportadora de IGF-I y HN que se une con alta afinidad a la HN, lo cual conlleva a la inhibición de la muerte celular mediada por IGFBP-3 ¹⁰ mientras también regula los niveles circulantes de HN. Aparentemente, IGFBP-3 también podría regular la distribución específica de la HN en los tejidos, así como su acción ¹⁸. Por ejemplo, la HN generada en tejidos periféricos puede trasportarse por IGFBP-3 al SNC ¹⁹. Por otro lado, modelos de ratones transgénicos que expresan hormona de crecimiento (GH) tienen altos niveles de IGF-I y, a su vez, bajos niveles de HN en plasma ²⁰. Por el contrario, ratones enanos Ames (Prop-1DF) con mutaciones en el gen Prop-1 tienen niveles plasmáticos elevados de HN, mientras que los niveles de GH y IGF-I son indetectables ²⁰.

Los mecanismos de regulación de la biosíntesis de la HN aún no han sido esclarecidos por completo. Resultados previos de nuestro grupo indican que la expresión de la HN en la glándula pituitaria anterior presenta dimorfismo sexual, siendo más baja en células pituitarias de hembras que de machos, y es directamente inhibida por estrógenos ²¹. Ha sido observado que la expresión de HN es regulada positivamente por inductores de estrés mitocondrial, tales como la deprivación de suero y drogas quimioterapéuticas ^9,22,23, mientras que es regulada negativamente por factores antiapoptóticos como el β-caroteno ⁹. Respecto a la degradación y el reciclaje de la HN, TRIM11 (motivo tripartito 11) es una de las proteínas propuestas como reguladora de los niveles intracelulares de HN, dirigiendo su degradación por el proteasoma ¹⁹.

Mecanismos de acción de la HN

La HN puede ejercer su acción citoprotectora por medio de la regulación de la vía apoptótica intrínseca o mitocondrial, modulando la expresión y localización intracelular de las proteínas de la familia Bcl-2. Un trabajo reciente de nuestro grupo muestra que el silenciamiento de la HN, utilizando vectores baculovirales que codifican ARNsh específicos, regula positivamente la expresión de Bax ²⁴. Esto sugiere que, en condiciones basales, la HN mantiene inhibida la expresión de Bax ²⁴. La HN puede interactuar con las proteínas proapoptóticas Bax, Bid y su isoforma truncada tBid en el citosol, evitando su translocación a la mitocondria e inhibiendo la liberación del citocromo c, la formación del apoptosoma y la activación de la caspasa 3 ^22,25. La HN no puede eliminar la unión de Bax y tBid a la membrana mitocondrial, pero su interacción dificulta el reclutamiento del Bax citosólico y su oligomerización en la membrana, lo cual inhibe la formación de poros y los eventos subsiguientes que desencadenan la vía apoptótica intrínseca ²⁶. Además, la HN y sus análogos reducen la expresión de Bax mientras incrementan la de Bcl-2 en células endoteliales ²⁷. Recientemente, pudimos demostrar que la HN exógena regula positivamente la expresión de Bcl-2 en células pituitarias, disminuyendo el radio Bax/Bcl-2 e impidiendo, una vez más, la translocación de Bax a la mitocondria ²⁸. También fue observado que la HN exógena puede ser incorporada por células del epitelio pigmentario de la retina (RPE) y relocalizarse en la mitocondria, impidiendo de esta manera la formación de especies reactivas de oxígeno, restaurando la bioenergética mitocondrial e inhibiendo la senescencia y muerte celular ²⁹.

La HN también puede liberarse de la célula, unirse a receptores de membrana y tener efectos autócrinos, parácrinos o endócrinos. Uno de los receptores de membrana para HN está compuesto por tres subunidades: CNTFR, WSX-1 y gp130 de 130 kDa ^8,30. La unión de la HN induce heterodimerización de los dominios intracelulares de WSX-1 y gp130 ³¹. Luego de unirse al receptor, la HN puede activar muchas cascadas de señalización, tales como RAS/MAPKs, PI3K, JNK y STAT3 ^32,33. La trimerización del receptor induce la activación de JAK2 quinasa, seguida de la activación de STAT3 ³³. Los STATs dime-rizados se trasladan al núcleo y regulan la transcripción génica. Además, las tirosina quinasas AKT y p38 han sido involucradas en la actividad neuroprotectora de la HN ^33,34. Otro mecanismo involucrado en la acción de la HN es la activación del receptor péptido formil símil (FPRL-1), que induce la activación de ERK1/2 (30, 35). La HN también ejerce su función citoprotectora por medio de la activación de la vía AMPK-eNOS ⁵. Nuestro grupo demostró recientemente que la vía de NF-KB está también involucrada en la acción an-tiapoptótica de la HN ²⁸. Llamativamente, la translocación nuclear de NF-KB-p65 inducida por HN sólo se observó en células pituitarias tumorales pero no en células pituitarias normales ²⁸. Otro mecanismo neuroprotector de la HN comprende a la familia de proteínas inhibidoras apoptóti-cas (IAPs) tras la activación de la vía JAK/ STAT3. La HN regula positivamente la expresión de Apollon/Bruce, que se une a Smac/Diablo y la caspasa 9, lo que conlleva a la degradación de estas proteínas y la inhibición de la apoptosis ³⁶.

La autofagia es otro de los mecanismos que dispara la HN. Ésta aumenta la expresión de LC3-II, un marcador del autofagosoma, y el número de autofagosomas y autolisosomas ³⁷. Adicionalmente, la HN se localiza en la membrana lisosomal, donde coopera para mejorar la eficiencia de la autofagia mediada por chaperonas ³⁷. La HN puede también estabilizar la unión de la chaperona HSP90 a sus sustratos en la cara citosólica de la membrana lisosomal ³⁷.

HN y neurodegeneración

La enfermedad de Alzheimer (EA) es la principal causa de demencia. Los eventos moleculares patogénicos que causan esta enfermedad tienen la participación del péptido β-amiloide (Aβ) y la proteína tau, los componentes más importantes de placas y ovillos neurofibrilares, respectivamente ³⁸. Desde que Nishimito y su grupo descubrieron la HN en el lóbulo occipital de pacientes con EA, este péptido ha demostrado tener un gran potencial para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, dado que puede proteger a las neuronas de los agravios ocasionados por genes relacionados a la EA y la toxicidad por Aβ ³⁹. La primera evidencia in vivo de este efecto neuroprotector fue informada por Mamiya et al., quienes administraron un análogo potente de la HN, S14G-HN (HNG), que mejoró notablemente los déficits en aprendizaje y memoria ocasionados por la escopolamina en ratones ⁴⁰. Más tarde, la administración del análogo HNG a ratones triple transgénicos con mutaciones en APPswe, tauP310L y PS-1M146V, asemejándose al cuadro de la EA, pudo reducir la acumulación de Aβ y mejorar la función cognitiva en la etapa temprana de acumulación de placas ⁴¹. Asimismo, la eficacia de HNG ha sido evaluada en modelos preclínicos con placas amiloides preexistentes bien establecidas, usando un modelo doble transgénico de EA (ratones portadores de los genes humanos mutantes APPswe y PS1-dE9). En concordancia con el trabajo previo, el tratamiento mejoró el déficit cognitivo y permitió la recuperación de la función de memoria espacial. En este estudio también se sugiere que HNG podría reducir la neuroinflamación asociada a Aβ ⁴². Otros trabajos demuestran que la administración de HN puede disminuir la producción de citoquinas proinflamatorias, tales como IL-6, IL-1β y TNF-α, inducida en astrocitos por LPS ⁴³ y en un modelo murino de hemorragia cerebral ⁴⁴. En otro estudio, se observó que la inyección intra-hipocampo de HNG protege a ratas de los déficits inducidos por Aβ en la memoria espacial a largo plazo, por un mecanismo que comprende el bloqueo de la activación de la caspasa 3 inducida por Aβ y la supresión de STAT3 ⁴⁵.

Chiba et al. desarrollaron un péptido híbrido, colivelin, que está compuesto por el factor neurotrófico dependiente de actividad (ADNF) fusionado a un análogo de la HN, AGA-(C8R)HNG17. Este péptido demostró su efecto neuroprotector al ser inyectado en muy bajas dosis por vía intracerebro-ventricular en modelos de EA ⁴⁶. Esto se debió tanto a la activación de la proteína quinasa IV dependiente de Ca²⁺/calmodulina por ADNF, como a la activación de STAT3 por HNG17 ⁴⁶, que resultaban en un efecto citoprotector aún más fuerte que el ocasionado por la administración simultánea de HNG17 y ADNF ⁴⁷.

La EA no es la única patología neurológica que podría beneficiarse del potencial efecto terapéutico de la HN. La excitotoxicidad del receptor N-metil-D-aspartato (NMDA) se encontró tanto en la EA como en la enfermedad de Parkinson. Nuevos estudios muestran que la exposición a NMDA disminuye la viabilidad de las neuronas corticales de rata y que, a su vez, la incubación de estas células con HN atenúa la disfunción mitocondrial generada ⁴⁸. Estos resultados han fomentado el desarrollo de un péptido mimético que se une a gp130 en los mismos sitios de unión, imitando los efectos citoprotectores de la HN en neuronas ⁴⁹.

Estrategias terapéuticas similares podrían aplicarse para el tratamiento de isquemia/ reperfusión en derrames cerebrales. Utilizando un modelo in vitro de deprivación de oxígeno y glucosa alternada con reoxigenación en una línea celular humana derivada de un neuroblastoma, llamada SH-SY5Y, la HN demostró ser un buen inhibidor de la apoptosis, tras la reactivación de la señalización JAK2/STAT3 ⁵⁰. Un trabajo reciente muestra un nuevo papel de la HN en un modelo murino de oclusión de arteria media, donde HNG pudo atenuar el infarto cerebral, así como proteger a las células endoteliales cerebrales de la deprivación de oxígeno, posiblemente por un mecanismo que incluye a gp130, PI3K/AKT y la vía de NF-KB ⁴⁴. No obstante, aún se desconoce si la HN cruza la barrera hemato-encefálica por medio de transportadores o por receptores de HN en la superficie de las células endoteliales.

Otra condición progresiva es la degeneración macular asociada a la edad (AMD), que causa la pérdida irreversible de la visión central y carece de tratamiento en el 90% de los pacientes ⁵¹. Esta patología se caracteriza por una etapa temprana en la que agregados extracelulares insolubles se acumulan en la retina, seguida de una etapa tardía en la que se producen áreas de degeneración células RPE, que sirven de apoyo para los fotorreceptores de la retina ⁵¹. El grupo de Hinton demostró que las células RPE pueden expresar HN, así como también tomar HN exógena del medio, lo cual sugiere que la HN podría proteger a estas células del estrés oxidativo provocado por H₂O₂, efecto mediado por el incremento de la bioenergética y biogénesis mitocondrial ²⁹. Luego observaron que durante el desarrollo de AMD, estresores del RE pueden inducir la muerte de células RPE aumentando la producción mitocondrial de superóxido. De acuerdo con los resultados anteriores, la HN protegió eficientemente a las células RPE de la apoptosis, restaurando el glutatión mitocondrial ⁵².

HN y cáncer

El equilibrio entre la proliferación y la apoptosis mantiene la homeostasis de los tejidos. Las células tumorales generalmente mantienen su supervivencia suprimiendo la apoptosis, por lo que alteraciones en la tasa apoptótica tienen consecuencias en el desarrollo del tumor. El efecto antiapoptótico de la HN aumenta la probabilidad de que este péptido posea un papel en la patogénesis del cáncer. Si bien la HN fue propuesta como un posible oncopéptido en el 2002 ⁵³, continúa siendo escaso el número de trabajos que involucran a la HN en el desarrollo tumoral. Su expresión fue detectada en cáncer gástrico, por lo que fue propuesto que la sobreexpresión de este péptido podría constituir un evento molecular importante de la tumorigénesis y la quimiorresistencia del tumor ⁵⁴. Más recientemente, también se informó su sobreexpresión en células tumorales de vejiga, por lo que se sugirió a la HN circulante en sangre como un potencial biomarcador para el diagnóstico de este tipo de cáncer ⁵⁵.

La mayoría de las drogas quimioterapéuticas actúan disminuyendo la tasa de proliferación y/o aumentando la de apoptosis. Aunque el papel de la HN en la respuesta tumoral a las drogas citotóxicas es controvertido, este péptido mostraría un efecto citoprotector en células normales expuestas a quimioterapéuticos ^56,57. El análogo HNG revirtió el arresto del ciclo celular en hueso inducido por la quimioterapia con bortezomib, un inhibidor del proteasoma, sin interferir en el efecto anticancerígeno de la droga, tanto en xenoinjertos de meduloblastoma y neuroblastoma, como en líneas celulares humanas ⁵⁸. Asimismo, en un modelo murino de melanoma metastásico de pulmón se observó que HNG protegía contra la pérdida de leucocitos y células germinales masculinas inducida por ciclofosfamida y, a su vez, incrementaba la supresión de formación de metástasis generada por la ciclofosfamida ^56,57. Es por ello que fue propuesto que análogos de la HN podrían ser buenos adyuvantes para la quimioterapia, al reducir la inducción de leucopenia y el bajo conteo de espermatozoides ^56,57,59. De hecho, los análogos de HN podrían incrementar la respuesta tumoral al bortezomib ⁵⁸ y la ciclofosfamida ⁵⁶. Sin embargo, resultados recientes de nuestro laboratorio contradicen los hallazgos antes mencionados. La inhibición de la HN endógena por inyección intratumoral de un vector baculoviral que codifica un ARNsh específico de HN, reguló positivamente la expresión de Bax, incrementó la tasa apoptótica tumoral, inhibió el crecimiento tumoral y aumentó la supervivencia de modelos con xenoinjertos de prolactinoma ²⁴. Además, nuestros resultados preliminares indican que la administración sistémica de HN favorece la progresión tumoral y la quimiorresistencia en modelos murinos de cáncer de mama ⁶⁰, lo cual cuestiona la seguridad de la administración sistémica de HN o sus análogos para el tratamiento del cáncer.

Hemos mostramos previamente que la expresión de HN es más elevada en células de prolactinoma que en células pituitarias normales, en las cuales los estrógenos inhiben la expresión de HN, una vía regulatoria que se encuentra suprimida en células tumorales ^21,28. Como se describió anteriormente, la unión de la HN a su receptor trimérico CNTFR/gp130/WSX-1 activa la señalización de ERK1/2, AKT y STAT3 ³⁴. NF-KB y STAT3 son fundamentales para el desarrollo de muchos tipos de tumores tales como el glioblastoma o el cáncer de mama triple negativo, en los cuales estos mediadores están sobreexpresados e hiperactivados ^61-63. De hecho, nuestro grupo demostró que el efecto citoprotector de la HN en células tumorales pituitarias involucra a las vías de NF-KB y STAT3 ^21,28. En concordancia, en un estudio se observó que la inhibición de la señalización de gp130 y de la fosforilación de AKT, ERK y STAT3, mejoró la actividad antitumoral de un agente quimioterapéutico para cáncer de colon ⁶⁴. Además, dosis elevadas de HN disminuyeron la apoptosis inducida por el ER en células de glioma incubadas con tunicamicina, un inhibidor de la glicosilación ⁵².

También fue demostrado que los péptidos Bax y tBid están involucrados en el efecto antiapoptótico de HN en células tumorales, pituitarias ²⁸ o de glioblastoma, en las cuales la inhibición de la HN endógena mediado por ARNsi, sensibilizó a las células a la apoptosis causada por estaurosporina y deprivación de suero ²², sugiriendo que la inhibición de la vía apoptótica mitocondrial a través de la regulación positiva de HN podría contribuir a la patogénesis tumoral. También fue observado un efecto protector de SHLP2 y SHLP3 en células de cáncer prostático, en las cuales inhibieron la apoptosis por deprivación de suero y restauraron el metabolismo mitocondrial ¹². Los niveles circulantes de SHLP2 resultaron estar negativamente correlacionados con el riesgo de aparición de cáncer de próstata, un hecho que fue asociado a la disfunción mitocondrial durante la carcinogénesis ⁶⁵. Esto podría reflejarse en cambios en los patrones de secreción de péptidos mitocondriales en células cancerosas.

La senescencia celular tendría tanto efectos benéficos como perjudiciales dependiendo del contexto ⁶⁶, teniendo un papel controvertido en el desarrollo del cáncer ⁶⁷. Entre las desventajas, el fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP) puede perturbar el microambiente, alterar la estructura y el funcionamiento de los tejidos normales, y promover fenotipos malignos en células cercanas. Por lo tanto, la respuesta inflamatoria de la senescencia favorecería la proliferación e invasión tumoral ^68,69. Cuando las células senescentes no son eliminadas por el sistema inmune, el SASP puede generar inflamación crónica e incrementar el riesgo de incidencia de cáncer ⁷⁰. Muy recientemente, fue demostrado que en fibroblastos dérmicos humanos que presentaban senescencia inducida por doxorrubicina aumentó la expresión de HN, que a su vez incrementó la respiración mitocondrial y la producción de factores de SASP ⁶⁶. Estos resultados sugieren que el bloqueo de esta respuesta podría ser una buena estrategia terapéutica para el tratamiento del cáncer.