Todos los hongos probados producen esporas asexuales o conidios. Para realizar el ensayo se prepararon suspensiones acuosas de conidios, los cuales se cosecharon mediante el raspado de la superficie del medio papa-dextrosa- agar donde los hongos se sembraron previamente.

Actividad depredadora in vitro. Cajas Petri de 9 cm de diámetro conteniendo agaragua (AA) fueron inoculadas con 9000 - 11000 conidios, se establecieron 13 repeticiones por cepa. Las cajas se incubaron por tres días a temperatura ambiente (23-26°C) y luz artificial (luz del laboratorio). Pasado este tiempo se depositó en cada caja 0,5 ml de una suspensión conteniendo aproximadamente 100 larvas de NG. Las cajas se incubaron por cuatro días más en las condiciones antes descritas. Posteriormente se contó en cada caja el número de larvas libres y atrapadas en las redes pegajosas con la ayuda de estereoscopio. Es importante aclarar que con esta metodología no es posible diferenciar los géneros o especies de los nemátodos libres y atrapados en las trampas; por lo tanto, a pesar de que inicialmente se determinó la composición de la población larvaria, para efectos de análisis y discusión se considera únicamente el número total de larvas aisladas de cabras y ovejas, expresando algunas inferencias.

Se establecieron los siguientes testigos: 1) tres cajas Petri con AA conteniendo sólo larvas de NG, 2) cajas con AA conteniendo únicamente a los hongos (una caja por hongo).

El procedimiento antes descrito se realizó dos veces, uno con larvas de NG procedentes de ovejas y otro con larvas de NG procedentes de cabras.

Evaluación. Con los datos obtenidos se calculó la actividad depredadora en porcentaje por cada caja de la siguiente manera:

A= (x/x + y)/100
Donde:
A = actividad depredadora (%)
X = número de larvas atrapadas
Y = número de larvas libres

Análisis estadístico. El diseño del ensayo fue irrestricto y con los datos obtenidos se realizó un análisis de varianza (ANDEVA) y prueba de separación de medias de Tukey para determinar la presencia de diferencias significativas en la actividad depredadora desarrollada por las 16 cepas. Se realizó el mismo procedimiento para observar diferencias significativas entre cepas de la misma especie. Debido a que la actividad depredadora de los hongos nematófagos sigue una distribución binomial (3), se aplicó la transformación arcosen o angular a los datos con el fin de normalizarlos previamente al análisis estadístico.

RESULTADOS

Actividad depredadora de Dactylella sp. Dactylella sp. presentó una actividad depredadora promedio de 59.8% con larvas de NG provenientes de ovejas y 67.2% con larvas de NG provenientes de cabras. Como sólo se aisló una cepa de este género, (cepa FDJ1) no fue posible realizar alguna comparación o análisis estadístico.

Los testigos conteniendo únicamente larvas presentaron un bajo índice de mortalidad; 0.8% en larvas de NG provenientes de ovejas y 6.2% en larvas de NG provenientes de cabras. Los testigos conteniendo los hongos presentaron el crecimiento característico en AA, es decir un crecimiento muy pobre presentándose solo micelio vegetativo

DISCUSIÓN

Origen de las cepas. Teóricamente, los hongos aislados de muestras de estiércol, abonos orgánicos elaborados a partir de estiércol o de suelo que hayan estado en contacto con dicho material, ya sea directamente o abonado con fertilizantes cuya base sea estiércol, deberían presentar una mayor probabilidad de desempeñarse más eficientemente debido al contacto previo entre éstos y los nemátodos gastrointestinales (lo que se traduce en un mayor reconocimiento presa-depredador y a mayor reconocimiento mayor depredación). Este supuesto puede ser avalado por los resultados obtenidos ya que tanto en el ensayo con larvas de NG provenientes de ovejas como en el ensayo con larvas de NG provenientes de cabras, los hongos que presentaron la actividad depredadora más alta fueron precisamente los que se aislaron de muestras que estuvieron en contacto con estiércol o aislados directamente del mismo. Por ejemplo, la cepa de C. musiformis que presentó la mayor actividad depredadora con larvas de NG provenientes de ovejas (cepa PFC con 70.3%) fue aislada de suelo de potrero de pastoreo de cabras productoras de leche (Coronado, San José), donde las cabras depositan constantemente heces, existiendo un contacto directo entre este material y la biota del suelo.

El mismo caso se da para la cepa DAP de A. oligospora, cepa que registró la mayor actividad depredadora con larvas de NG provenientes de ovejas (96.8%), y que fue aislada de suelo de potrero de pastoreo de bovinos productores de leche (Moravia, San José). La misma situación se presenta en el ensayo con larvas provenientes de cabras; las cepas que presentaron mayor actividad depredadora fueron G3 (C. musiformis) con un 95.6%, aislada de estiércol de bovino de un sistema de doble propósito (Guápiles, Limón) y la cepa UCR1a (A. oligospora) con un 99.6% que también fue aislada de estiércol de bovinos (Sede del Atlántico de la Universidad de Costa Rica en Turrialba, Cartago).

En general las cepas que presentaron un mejor desempeño fueron: G3, UCR1b, UCR1a, C4 y G1 aisladas directamente de estiércol; PFSL1, PFC y DAP, aisladas de suelo de potreros y BBP2, aislada de abono orgánico elaborado a partir de estiércol de bovino y suelo de potrero.

Por otra parte, para el ensayo también se seleccionaron algunas cepas las cuales es muy probable nunca hayan estado en contacto con estiércol y mucho menos con larvas de nemátodos gastrointestinales, por ejemplo la cepa LS de C. musiformis aislada a partir de suelo de bosque secundario de la Estación Biológica "La Selva" (Sarapiquí, Heredia), la cual presentó una actividad depredadora baja (17.4 % con larvas de NG de ovejas y 21.0% con larvas de NG de cabras). Dicha ineficiencia puede deberse a la falta de reconocimiento entre el hongo y nemátodos de este tipo; sin embargo, no es posible hacer generalizaciones ya que cepas que probablemente tampoco han estado en contacto con nemátodos gastrointestinales como FDJ1 (Dactylella sp.), aislada de una finca ecológica (Talamanca) y FDH1 (C. musiformis), aislada de un sistema agroforestal de cacao (Talamanca) presentaron actividades de depredación intermedias (59.8% y 67.2% respectivamente).

Un último aspecto que es importante mencionar es que se cuenta con al menos una cepa con actividad depredadora elevada (más de 80%) por zonas específicas en cada una de las cinco provincias de estudio (Alajuela, Cartago, Heredia, Limón y San José). Uno de los aspectos a considerar en el control biológico en general, es el desempeño de antagonistas ajenos a la zona a la que se están aplicando, los cuales no siempre resultan efectivos en su función debido al estrés producido por las condiciones ambientales del lugar, a las que no están adaptados. La situación anterior podría sortearse si se aislan antagonistas autóctonos específicos de cada zona. En este caso se puede establecer que en cada una de las cinco provincias se cuenta con al menos un antagonista autóctono para ser utilizado como controlador biológico de nemátodos gastrointestinales; sin embargo, las condiciones ambientales dentro de una provincia varían, por lo que es recomendable probar en un futuro el o los hongos correspondientes en diferentes puntos de la provincia y observar si existe una eficiencia similar en la captura de larvas de NG.

Cepas. Las cepas de C. musiformis presentaron un rango bastante amplio de actividad depredadora; algunas fueron muy buenas capturando larvas, otras tuvieron un mediano desempeño y otras fueron deficientes. Por otra parte, las cepas de dicha especie parecieran capturar preferentemente larvas de NG provenientes de cabras, cuya población consistió de Haemonchus contortus en su totalidad, lo que indica que algunas cepas de C. musiformis presentan gran afinidad por dicho nemátodo, lo cual resulta beneficioso ya que este parásito es uno de los más problemáticos en pequeños rumiantes.

A pesar de que C. musiformis ha sido utilizado en ensayos de actividad depredadora contra nemátodos gastrointestinales, no existen datos concretos de su desempeño en la literatura consultada, por lo que no es posible realizar algún tipo de comparación. Por el contrario, existen algunos ensayos en los cuales se ha probado este hongo contra nemátodos fitoparásitos como Aphelenchus avenae, Neotylenchus linfordi, Meloidogyne sp., Radopholus citrophilus, Helycotylenchus sp., Pratylenchus sp., entre otros, obteniendo actividades depredadoras intermedias (13-15). Las cepas de C. musiformis utilizadas en este ensayo también desarrollaron una actividad depredadora intermedia, pero menor a la desarrollada por A. oligospora.

Las cepas de A. oligospora presentaron un rango estrecho de actividad de captura, donde la mayoría resultaron ser buenas depredadoras de larvas de NG (alrededor del 80% de actividad depredadora). Las cepas de esta especie presentaron una ligera preferencia por las larvas de NG provenientes de ovejas sobre las de cabras. Debido a que la totalidad de la población de larvas de NG provenientes de cabras era de Haemonchus contortus y que un 50% de las larvas de NG provenientes de ovejas correspondían a dicha especie, puede decirse que este hongo también es eficiente capturando este nemátodo.

Es importante señalar que las cepas costarricenses de A. oligospora presentaron actividades depredadoras más altas a las establecidas en la literatura, por ejemplo Mendoza de Gives et al (16) establecen una actividad depredadora de 35.9%; Wolstrup et al (17) indican un intervalo de 50.0% a 86.0%; Flores et al (18) un 50.1% y Flores et al (19) indica un rango de 40.2% a 64.0% para este hongo. A. oligospora es la especie aislada con más frecuencia en todo el mundo, por lo tanto en cada lugar el hongo estaría adaptado a las condiciones ambientales particulares de la zona, lo cual ejercería una influencia directa sobre su desempeño atrapando nemátodos, por lo que es de esperarse que cepas aisladas en diferentes lugares a pesar de ser la misma especie presenten actividades de captura diferentes frente a nemátodos gastrointestinales.

No se cuenta con información sobre la actividad depredadora de Dactylella sp., frente a larvas de NG; sin embargo, la actividad de depredación desarrollada por este hongo se puede considerar intermedia, similar a la indicada para A. oligospora en otras partes del mundo, por lo que puede establecerse que este hongo presenta una actividad depredadora aceptable.

Tipo de larvas. La mayoría de las cepas probadas de C. musiformis, A. oligospora y Dactylella sp., presentaron actividades de depredación mayores en presencia de la población de larvas de Haemonchus contortus provenientes de cabras en comparación con la población de larvas de NG provenientes de ovejas donde las actividades de depredación de los hongos fue menor en la mayoría de los casos.

Lo anterior indica una alta afinidad de los hongos por Haemonchus contortus. La población larvaria proveniente de ovejas consistió en un 50% de este nemátodo, por lo que pudiera establecerse que una buena parte de las larvas atrapadas en este caso pertenecían a dicha especie. Desgraciadamente la metodología empleada no permite realizar esta diferenciación; es decir, no es posible reconocer qué tipo de larvas se encuentran atrapadas en las trampas cuando se realizan las observaciones.

Existen diferencias en la eficiencia de depredación con la cual los hongos nematófagos capturan diferentes especies de nemátodos, pero en general estos hongos presentan un rango amplio de hospederos (6, 14). La interacción entre nemátodos y hongos nematófagos es un proceso complejo que envuelve polímeros superficiales, actividades enzimáticas y reconocimiento lectinas-carbohidratos entre las trampas pegajosas y los nemátodos. Las diferencias en la actividad depredadora de los hongos nematófagos están relacionadas directamente con la composición de la cutícula, que varía entre las especies de nemátodos (3, 16, 20). Otros estudios establecen que específicamente es la variación de los patrones de proteína de la cubierta antigénica la responsable del reconocimiento hongo-nemátodo (16, 19). Lo anterior determinaría la especificidad de los hongos nematófagos por sus hospederos (20).

Los resultados obtenidos muestran que existe una gran variabilidad en la actividad depredadora de las cepas de los diferentes hongos probados y que existen tendencias y no reglas que puedan generalizarse, ya que la actividad depredadora está influenciada por la especie y procedencia de los hongos nematófagos y especie de larvas a la que se los enfrenta.

En conclusión, el análisis estadístico indicó diferencias altamente significativas en la actividad de los hongos; sin embargo, las cepas de A. oligospora mostraron un mejor desempeño en la captura de nemátodos comparado con las cepas de C. musiformis y Dactylella sp. La heterogeneidad encontrada responde a factores como: origen de las cepas, características intrínsecas de las mismas y especies de larvas utilizadas.