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Introducción
Los cultivos de plátano y banano son importantes en Colombia debido principalmente a su aporte a la seguridad alimentaria, y alto valor económico y nutricional (FAO, 2004; CIAT, 2013; MADR, 2017; Cenibanano, 2018).
Para el año 2020, en Colombia se sembraron 426.904 ha de plátano y 99.612 ha de banano, con rendimientos de 10 y 24 t/ha, respectivamente; siendo el departamento de Caldas el séptimo productor de plátano con 23.333 ha sembradas y un rendimiento de 11,9 t/ha; y el décimo cuarto productor de banano con 686 ha sembradas y un rendimiento de 11 t/ha (Agronet, 2022).
En Colombia, los cultivos de musáceas son afectados por numerosos e importantes problemas fitosanitarios que limitan su producción; dentro de los cuales se destaca el nematodo barrenador, Radopholus similis (Cobb) Thorne, (Múnera, 2008; Jaraba y Lozano, 2008; Múnera et al., 2009; Guzmán, 2011; Guzmán y Castaño, 2020). Este nematodo se caracteriza por ser un endoparásito migratorio del sistema radical y el cormo de las musáceas donde ocasiona síntomas primarios como lesiones de color rojo oscuro en el córtex de la raíz, no así en el cilindro vascular, las cuales pueden coalescer y tornarse de color negro, y síntomas secundarios como disminución en la capacidad de absorción de agua y nutrientes por deterioro del sistema radical, lo cual se ve reflejado en la prolongación del ciclo vegetativo del cultivo, reducción del peso del racimo y se genera volcamiento de las plantas (Sarah et al., 1996; Gowen et al., 2005; Guzmán, 2011).
Fogain (2000) reportó pérdidas en el rendimiento de Musa AAB ‘French Sombre’ durante la primera y segunda cosecha en 60 y 52%, respectivamente. Sarah et al. (1996) y Araya (1995) manifestaron que las reducciones en el rendimiento de banano pueden alcanzar entre 75% y 80%, dependiendo de las condiciones agroecológicas. Guzmán (2011) afirmó haber observado en Caldas, pérdidas del 70% en el primer ciclo de producción en plantas Musa AAB ‘Dominico Hartón’, principalmente debido a su volcamiento.
En Colombia, los estudios relacionados con R. similis se han enfocado principalmente en su prevalencia, densidad poblacional y en estrategias de manejo bajo condiciones in vitro e in vivo (Guzmán y Castaño, 2004; González et al., 2007; Arboleda et al., 2012; Castillo-Russi et al., 2010; Guzmán, 2011; Valencia et al., 2014). Sin embargo, los estudios relacionados con la variabilidad intraespecífica del nematodo han sido escasos. Múnera et al. (2010) realizaron aportes a la taxonomía del nematodo desde el punto de vista morfométrico, morfológico y filogenético.
Siddiqi (2000) menciona que, al estudiar la variabilidad intraespecífica, o al efectuar la descripción de una nueva especie de nematodo, resulta importante conocer la variabilidad de un carácter morfométrico, morfológico o alométrico en particular, debido a que estos caracteres tienden a variar bajo la influencia de condiciones ecológicas y geográficas; lo cual origina poblaciones ecotípicas y específicas a un hospedante. Sin embargo, se recomienda complementar los estudios morfométricos y morfológicos con estudios moleculares mediante técnicas como polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP, por su sigla en inglés), amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD, por su sigla en inglés) o secuenciación. Al respecto, Mgonja et al. (2020) realizaron una identificación molecular, morfológica y morfométrica de cuatro poblaciones de R. similis de Tanzania, encontrando que las mediciones de todos los caracteres morfométricos se ajustaron a los valores estándares de diagnóstico (Ryss y Wouts, 1997; Elbadri et al., 1999), excepto la medición del estilete, posiblemente a variaciones en condiciones ambientales que conducen a adaptaciones morfológicas; y con respecto al estudio filogenético, mediante el uso de los genes 28S, 18S y de la región ITS1 e ITS2 del ARN ribosomal demostraron que los iniciadores usados fueron útiles para separar a R. similis de otras especies (Mgonja et al., 2020). Por tales motivos, Gowen et al. (2005), Plowright et al. (2013) y Sikora et al. (2018), mencionan que diferencias en agresividad, preferencia de hospedante, capacidad reproductiva y morfología de R. similis sugieren la existencia de razas o biotipos.
Teniendo en cuenta la relevancia de los cultivos de plátano y banano en los ámbitos nacional e internacional, la importancia económica de R. similis, y la escasez de estudios relacionados con su diversidad, se hace necesario ampliar el conocimiento de la variabilidad intraespecífica de este nematodo en Colombia. La presente investigación se realizó con el objetivo de aportar a la caracterización morfométrica y molecular de R. similis, con el fin de determinar si existe variabilidad intraespecífica, y así contribuir al desarrollo de nuevas estrategias que faciliten su manejo en condiciones de campo.
Materiales y métodos
Obtención y extracción de nematodos
Las muestras de siete poblaciones de R. similis se recolectaron de raíces de plantas de Musa AAB (subgrupo plátano) ‘Dominico Hartón’ y ‘Dominico’ y de Musa AA (Subgrupo Sucrier) ‘Bananito’ atacadas por este nematodo, provenientes de cinco municipios de Caldas (Tabla 1). De manera complementaria, se obtuvieron muestras de raíces de Musa AAB ‘Dominico Hartón’ y de Musa AAA (subgrupo Cavendish) ‘Gran enano’ de los departamentos de Antioquia y Quindío (Tabla 1). Posteriormente, las muestras de raíces se introdujeron en bolsas plásticas debidamente rotuladas, y luego se trasladaron al Laboratorio de Nematología de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad de Caldas para su procesamiento y análisis. La extracción de los nematodos se realizó con base en el principio de flotación en azúcar, con algunas modificaciones, según Jenkins (1964) y Meredith (1973).
Tabla 1 Poblaciones de Radopholus similis (Rs) recolectadas en diferentes materiales de musáceas en los departamentos de Caldas, Antioquia y Quindío, Colombia, y su ubicación geográfica.
| Ubicación | geográfica | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Departamento | Municipio | Población | Coordenadas | T(°C)* | PP(mm)* | Altitud (m.s.n.m) | Hospedante |
| Caldas | Palestina (P) | RsP | 5°04’22,29”N75°40’21,38”O | 24,2 | 1.792,4 | 1024 | Musa AA ‘Bananito’ |
| San José (S) | RsS | 5°03’50,9”N75°48’44,3” O | 19 | 3.017 | 1494 | (Musa AAB) ‘Dominico’ | |
| Risaralda (R) | RsR | 5°08’12.1”N75°46’44,9”O | 22 | 3.586 | 1735 | Musa AAB ‘Dominico Hartón’ | |
| Belalcázar (B) | RsB | 5°00’32.9”N75°49’13,1”O | 21 | 2.279 | 1244 | ||
| Anserma (A) | RsA | 5°11’14,1”N75°47’02,8”O | 20 | 2.022 | 1489 | ||
| Quindío | Quimbaya (Q) | RsQ | 4°38’15,32” N75°44’33,21” O | 20 | 2323 | 1329 | |
| Antioquia | Carepa (C) | RsC | 7°46’47,1”N 76°40’24,2”O | 26,8 | 2892 | 27 | Musa AAA ‘Gran enano’ |
Abreviaturas: T= Temperatura; PP= Precipitación. m.s.n.m: metros sobre el nivel del mar.
Fuente: Cenicafé (2016).
Observación morfológica y caracterización morfométrica
Las poblaciones de hembras y machos de R. similis se identificaron utilizando un microscopio óptico LEICA DM500-ICC50 HD® (LEICA Microsystem, Wetzlar, Alemania), y posteriormente comparadas con las claves taxonómicas de Thorne (1961), Sher (1968) y Ryss y Wouts (1997). Se realizaron mediciones de 19 caracteres morfométricos y alométricos sugeridos por Thorne (1961), Siddiqi (2000) y Perry y Moens (2013), mediante el uso del software Leica Application Suite (LAS) EZ 2.0®.
Los códigos asignados a los caracteres evaluados de R. similis fueron los siguientes: L= Longitud del cuerpo; E= Longitud del estilete; DCE= Diámetro del cuerpo en la base del estilete; DMC= Diámetro máximo del cuerpo; LES= Longitud del esófago; LGE= Longitud desde la región anterior (cabeza) hasta la región posterior de la glándula esofágica; LC= Longitud de la cola; DCA= Diámetro del cuerpo en el ano; DEGO= Orificio de la glándula esofágica dorsal; V= (Distancia desde la región anterior (cabeza) hasta la vulva/Longitud del cuerpo) x 100; PE= Distancia desde la región anterior (cabeza) hasta el poro excretor; H= Longitud de la región hialina de la cola; a= L/DMC; b= L/LES; b’= L/LGE; c= L/LC; c’= LC/DCA. En la evaluación de estos caracteres se tomaron 30 hembras y 20 machos de R. similis por cada población estudiada, y los valores resultantes se compararon con las descripciones realizadas por Sher (1968), Taylor (1969), Ryss y Wouts (1997) y Múnera (2008).
Análisis estadístico
A los valores de los caracteres obtenidos de las poblaciones de R. similis se les calculó el promedio, desviación estándar, valores mínimos y máximos. Adicionalmente, se realizó un análisis de componentes principales (ACP) para reducir la dimensionalidad de los datos, y para identificar las variables de mayor importancia en las siete poblaciones de hembras del nematodo, teniendo en cuenta la matriz de correlaciones e identificando los autovalores y autovectores. Posteriormente, se realizó un análisis de conglomerados jerárquicos (ACJ) aplicando el método de Ward (1963) a los resultados del ACP. Los análisis se realizaron con el programa estadístico SPAD® versión 8.0.
Caracterización molecular
Diseño de iniciadores
Se seleccionaron secuencias nucleotídicas asociadas a la región ITS1-5.8S-ITS2 (ITS), y al gen 18S (18S) ambos del ARN ribosomal de la especie R. similis, disponibles en la base de datos del banco de genes del NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Por cada gen o región se realizaron los alineamientos correspondientes usando el programa Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalo), con el fin de identificar regiones conservadas. Posteriormente, se diseñaron iniciadores (cebadores) utilizando el programa Oligoperfect Designer Program (https://www.themofisher.com) (Tabla 2).
Tabla 2 Iniciadores diseñados para amplificar la región parcial ITS1-5.8S-ITS2 y gen 18S del ARNr de Radopholus similis (Rs).
| Iniciador | Gen/Región | Secuencia(5’→ 3’) | Amplicón (pb) | Temperatura de anillamiento (°C) |
|---|---|---|---|---|
| RsITS4F | ITS1-5.8S-ITS2 | ATTGGCGAAACCCATCAAA | 525 | 52,8 |
| RsITS4F | ITS1-5.8S-ITS2 | TGCACAATGAACATACGTGAATT | 525 | 53,4 |
| Rs18S3F | 18S | ACCGTAAACGATGCCAACTC | 606 | 55,5 |
| Rs18S3R | 18S | GGGCAGGGACGTAATCAAC | 606 | 55,9 |
Extracción de ADN
Un total de 20 individuos de cada una de las siete poblaciones de R. similis, descritas en la Tabla 1, fueron depositados dentro de tubos Eppendorf de 2mL, conteniendo 20 μL de solución amortiguadora de lisis, componente del kit de extracción de ADN, PureLink® Genomic DNA Mini Kit (Thermo Fisher, Austin, TX); con ayuda de un pistilo, los nematodos fueron macerados y sometidos a temperatura de ebullición por 5 min en baño maría. El extracto con el ADN del nematodo se utilizó inmediatamente para realizar PCR directa.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y secuenciación
La PCR se realizó en un volumen final de 30 μL, conteniendo 3 μL de agua libre de nucleasas, 24 μL de PCR SuperMix 1X (Thermo Fisher, Austin, TX), 0,75 μL de cada iniciador (10 μM), y 1,5 μL del extracto de ADN preparado previamente. La amplificación se realizó usando un termociclador C1000 Touch (Bio-Rad, Hercules, CA), con la siguiente programación: una desnaturalización inicial a 95°C por 5 min; 40 ciclos de 95°C por 30 s, 53°C por 40 s para ITS1-5.8S-ITS2 y 56°C por 30 s para 18S, 72°C por 1 min; y un paso final de extensión a 72°C por 10 min. El producto de amplificación resultante se separó en un gel de agarosa al 1% mediante electroforesis horizontal a 110 voltios por 45 min. Los geles fueron teñidos usando una solución de GelRed y las bandas se visualizaron empleando un foto-documentador (Geldoc Imager, Bio-Rad, Hercules, CA). Los productos de PCR se purificaron utilizando el kit PureLink Quick PCR Purification kit (Thermofisher, Austin, TX), y posteriormente enviados a secuenciación unidireccional a Macrogen, Inc. (Corea del Sur).
BLASTn
Las secuencias estudiadas de ADN de las poblaciones de R. similis fueron visualizadas y ajustadas usando el programa Sequencher 5.4 (Genes code corp., Ann Arbor, MI). Posteriormente, dichas secuencias se compararon con las del NCBI usando la herramienta BLASTn. Las secuencias nucleotídicas de la base de datos con similitud más alta a las secuencias sometidas a evaluación (ITS y 18S) fueron las que se tuvieron en cuenta para confirmar el género y especie de cada población, previamente identificada morfológicamente.
Alineamiento de secuencias
Se seleccionaron secuencias nucleotídicas del NCBI de la especie R. similis asociadas a Musa. El alineamiento se realizó usando el programa Muscle v3.8.425 (Edgar, 2004) y un bloque conservado se seleccionó utilizando el programa Gblocks v0.91b (Castresana, 2000). El alineamiento final se visualizó mediante el programa AliView (Larsson et al., 2014).
Variabilidad genética de R. similis
La identificación de haplotipos en el alineamiento de secuencias nucleotídicas se realizó con el programa DNAsp v5.10.1 (Rozas et al., 2010). Igualmente, se hizo una matriz de distancias genéticas con el modelo Kimura 2-parametros (Kimura, 1980) usando el programa MEGA X (Kumar et al., 2018), y finalmente se construyó una red haplotípica con el método de uniones promediadas (MJ, por sus siglas en inglés) utilizando el programa PopART (Leigh et al., 2015).
Resultados y discusión
Observación morfológica y morfométrica
Las características morfológicas de las siete poblaciones de R. similis estudiadas concuerdan con la descripción para esta especie, según Thorne (1961), Sher (1969), Ryss y Wouts (1997) y Múnera et al. (2010) (Figura 1).
Fuente: Autores.
Figura 1 Hembra (A) y macho (B) de Radopholus similis. Dentro de la figura, la escala de barra=50 μm.
Los valores promedio de todos los caracteres morfométricos y alométricos de las hembras de R. similis estudiadas, en las siete poblaciones, se ajustaron a los rangos de los promedios reportados por Sher (1968), Taylor (1969), Ryss y Wouts (1997), Elbadri et al. (1999) y Múnera (2010), para la especie R. similis (Tabla 3). Adicionalmente, debido a que no se encontraron diferencias en los datos obtenidos de los machos estudiados, estos no se muestran.
Sin embargo, en las hembras de R. similis se encontró una diferencia entre las poblaciones estudiadas, específicamente en la longitud del esófago; cuyo valor máximo superó los valores obtenidos por Elbadri et al. (1999) y Múnera et al. (2010) (Tabla 3).
Tabla 3 Comparación de caracteres morfométricos y alométricos de diferentes poblaciones de hembras de Radopholus similis (mediciones en μm).
Abreviaciones. Pm=Valor mínimo de promedio; Pmx= Valor máximo de promedio; N= Número de poblaciones evaluadas; L= Longitud del cuerpo; E= Estilete; DCE= Diámetro del cuerpo en la base del estilete; DMC= Diámetro máximo del cuerpo; LES= Longitud del esófago; LGE= Longitud desde la región anterior de la cabeza hasta la región posterior de la glándula esofágica; LC= Longitud de la cola; DCA= Diámetro del cuerpo en el ano; DEGO= Orificio de la glándula esofágica dorsal; V= (Distancia desde la región anterior de la cabeza hasta la vulva / Longitud del cuerpo) x 100; PE= Distancia desde la región anterior de la cabeza hasta el poro excretor; H= Longitud de la región hialina de la cola; a= L/DMC; b= L/LES; b’= L/LGE; c= L/LC; c’= LC/DCA.
Fuente: Autores.
De acuerdo con Ryss (2003), el desarrollo de las glándulas esofágicas en el género Radopholus está relacionado con la alimentación parasítica sobre las células de las raíces de la planta, destacándose un mayor tamaño de las glándulas en parásitos especializados; por lo tanto, el tamaño del esófago podría relacionarse con la agresividad encontrada en la población de Belalcázar.
Análisis de componentes principales (ACP) y conglomerados jerárquicos (ACJ)
El ACP realizado con los caracteres de las hembras de R. similis permitió evidenciar dos componentes principales (CP) indicados como CP1 y CP2, los cuales presentaron las varianzas más altas en comparación con el resto de los componentes, representando un 48,8% de la varianza acumulada (Tabla 4).
Se presentaron correlaciones positivas fuertes en CP1 para los caracteres L (r= 0,858), DCE (r=0,728), DMC (0,886) y DCA (r=0,838); y en CP2 para los caracteres LES (r=0,873) y LGE (r=0,867). También, se presentaron correlaciones negativas fuertes en el CP2 con los caracteres b y b’ (Tabla 4).
De los 17 caracteres evaluados solamente sobresalieron ocho; los cuales brindaron una mejor información morfométrica, debido a que estaban mejor representados en los componentes y a que mostraron una alta correlación con CP1 o CP2. En este sentido, CP1 se caracterizó por incluir variables relacionadas con el largo y diámetro del cuerpo, mientras que CP2 se caracterizó por incluir variables relacionadas con el esófago (Tabla 4).
Tabla 4 Auto-vectores y correlación entre caracteres y componentes principales (CP1 y CP2), y autovalores de CP1 y CP2, derivados de los caracteres evaluados en hembras de siete poblaciones de Radopholus similis.
* Autovectores derivados de los 19 caracteres evaluados en las 210 hembras (30 hembras por cada población) de Radopholus similis; los valores de los caracteres que sobresalen en cada componente están resaltados en rojo.
** Valores de coeficientes de correlación; los valores con una buena correlación con un componente principal están resaltados en rojo. Abreviaciones= L= Longitud del cuerpo; E= Estilete; DCE= Diámetro del cuerpo en la base del estilete; DMC= Diámetro máximo del cuerpo; LES= Longitud del esófago; LGE= Longitud desde la región anterior de la cabeza hasta la región posterior de la glándula esofágica; LC= Longitud de la cola; DCA= Diámetro del cuerpo en el ano; DEGO= Orificio de la glándula esofágica dorsal; V= (Distancia desde la región anterior de la cabeza hasta la vulva / Longitud del cuerpo) x 100; PE= Distancia desde la región anterior de la cabeza hasta el poro excretor; H=Longitud de la región hialina de la cola; a= L/DMC; b= L/LES; b’= L/LGE; c= L/LC; c’= LC/DCA.
Fuente: Autores.
Con el fin de conformar grupos más homogéneos, pero más heterogéneos entre sí con base en los caracteres morfométricos y alométricos de las hembras de las siete poblaciones de R. similis, se realizó el ACJ con los resultados del ACP, mostrando la conformación de tres grupos (Tabla 5 y Figura 2).
Tabla 5 Caracteres morfométricos y alométricos que distinguen a las hembras adultas de las poblaciones de Radopholus similis, conglomerados en los grupos 1, 2 y 3.
* Caracteres menos variables (CV < 12%), caracteres moderadamente variables (CV = 12-20%), caracteres altamente variables (CV = >20%) (Kaur y Attri, 2013). Caracteres resaltados en rojo están bien representados en los componentes principales y tienen un CV bajo. Abreviaciones: DS= desviación estándar; CV= coeficiente de variación; L= Longitud del cuerpo; E= Estilete; DCE= Diámetro del cuerpo en la base del estilete; DMC= Diámetro máximo del cuerpo; LES= Longitud del esófago; LGE= Longitud desde la región anterior de la cabeza hasta la región posterior de la glándula esofágica; LC= Longitud de la cola; DCA= Diámetro del cuerpo en el ano; DEGO= Orificio de la glándula esofágica dorsal; PE= Distancia desde la región anterior de la cabeza hasta el poro excretor; H= Longitud de la región hialina de la cola; GB= Longitud del gobernáculo; ESP= Longitud de la espícula; a= L/DMC; b= L/ LES; b’= L/LGE; c= L/LC; c’= LC/DCA.
Fuente: Autores.
Fuente: Autores.
Figura 2 Plano factorial y agrupamiento de individuos (hembras) de las poblaciones de Radopholus similis (Rs) (izquierda), y acercamiento de los vectores (derecha). Abreviaciones= RsB de Belalcázar, RsB de Anserma, RsAt de Antioquia (Carepa), RsP de Palestina.
El grupo 1 se conformó por las poblaciones de Belalcázar (RsB) y Anserma (RsA) (Caldas), las cuales sobresalieron por los valores promedios más altos en los caracteres c’, a, %V y LES, mientras que el grupo 2 solamente se conformó por la población de Carepa (RsC) (Antioquia), con valores promedios más altos en los caracteres b’ y b; y finalmente el grupo 3 se conformó por la población de Palestina (RsP) (Caldas), por los valores promedios más altos en los caracteres: DMC, DCA, L DCE, LES, LGE, LC, PE, c, DEGO y LE (Tabla 5 y Figura 2).
Por otro lado, las hembras de R. similis de los municipios de Quimbaya (Quindío), al igual que San José y Risaralda (Caldas) no se conglomeraron en ningún grupo, dado que no sobresalieron en ningún carácter morfométrico o alométrico.
Según Bird et al. (2012), muchos caracteres morfométricos no siempre son útiles como caracteres taxonómicos; por lo tanto, una manera para determinar la idoneidad de estos es mediante el análisis de las medidas de dispersión; las cuales permiten analizar el grado de variabilidad de un carácter de un taxón específico, teniendo en cuenta que, entre mayor grado de variación del carácter, menos útil es. Al respecto, Kaur y Attri (2013) mencionan que un carácter con un coeficiente de variación menor de 12% es poco variable, si se encuentra entre 12 y 20% es moderadamente variable, y si es mayor a 20% es altamente variable.
De acuerdo con los resultados del ACP y del ACJ se seleccionaron aquellos caracteres morfométricos o alométricos que más distinguían a cada grupo con base en la varianza, el grado de correlación del carácter con el componente principal (r > ± 0,8), y el coeficiente de variación del carácter evaluado (C.V < 13), lo cual indicó que el carácter morfométrico, además de estar bien representado en el plano de componentes principales, es poco a moderadamente variable.
En este sentido, las hembras de R. similis recolectadas de Belalcázar y Anserma (Caldas), las cuales conforman el grupo 1, se caracterizaron solamente por el carácter morfométrico longitud del esófago (LES), debido a que el valor promedio de este carácter en el grupo fue mayor al valor promedio general, el cual además de tener una alta correlación con el CP2 es un carácter moderadamente variable (Tablas 4 y 5). Lambert y Bekal (2002) mencionan que los músculos del esófago le permiten al nematodo extraer alimento a través del estilete y también expulsar secreciones de las glándulas hacia el interior de las células de las raíces de la planta. Por otro lado, Ryss (2003) menciona que el tamaño de las glándulas esofágicas en el género Radopholus está relacionado con la alimentación del nematodo en las raíces de las plantas, en especial teniendo en cuenta que el tamaño de las glándulas es mayor en parásitos especializados. En este sentido, es posible que exista una relación entre el tamaño del esófago del nematodo y el grado de parasitismo.
En las hembras de R. similis de Carepa (Antioquia), las cuales conforman el grupo 2, se encontró que sobresalen por los caracteres alométricos b y b’, debido a que los valores promedio de estos fueron superiores a los valores generales promedio, que además de estar altamente correlacionados con CP2, son caracteres poco variables (Tablas 4 y 5). Según Ryss (2003), en nematodos pertenecientes a la familia Pratylenchidae, el valor del carácter alométrico b se incrementa durante el crecimiento postembrionario, debido a la elongación del cuerpo. En este sentido, Roy et al. (2018) encontraron variabilidad en el carácter alométrico b en diferentes poblaciones de R. similis de la India, lo cual contrasta con los altos valores en estos caracteres para la población de Carepa, posiblemente debido a las condiciones específicas de ambiente y hospedante en esta región; los cuales pueden influir en el fenotipo resultante para esta población.
Finalmente, las hembras de R. similis de Palestina, las cuales conforman el grupo 3, sobresalieron por los caracteres morfométricos: longitud del cuerpo (L), diámetro del cuerpo en la base del estilete (DCE), longitud del esófago (LES) y longitud desde la región anterior (cabeza) hasta la región posterior de la glándula esofágica (LGE); debido a que los valores promedio de estos fueron superiores a los valores promedio generales, los cuales además de estar altamente correlacionados con CP1 o CP2 son caracteres poco variables (Tablas 4 y 5). En el mismo sentido, Koshy et al. (1991), al estudiar la variabilidad morfométrica de diferentes poblaciones de hembras de R. similis, consideraron a los caracteres morfométricos L y LES poco estables debido a que estos oscilaron entre 4 y 10%, resultados que concuerdan con los obtenidos en este estudio (Tabla 5).
Variabilidad genética de R. similis
Para la secuenciación se seleccionaron los productos de PCR obtenidos con las parejas de iniciadores: RsITS4F / RsITS4R para la región ITS y las parejas Rs18S3F / Rs183R para la región 18S, correspondientes a las siete poblaciones de R. similis, para un total de14 secuencias nucleotídicas (siete secuencias por cada región conservada). Sin embargo, solamente se analizaron 11 secuencias, debido a que tres de éstas, correspondientes a la región ITS de las poblaciones de Anserma y Belalcázar (Caldas) y Carepa (Antioquia) al analizarlas con el programa Sequencher 5.4 (Genes code corp., Ann Arbor, MI) resultaron con baja calidad de secuenciación, motivo por el cual se eliminaron del estudio.
Región ITS1-5.8S-ITS2
El producto de PCR obtenido en las amplificaciones de la región ITS, para las siete poblaciones de R. similis, fue del tamaño esperado (Tabla 2). Al comparar las secuencias obtenidas en este estudio con las secuencias del banco de genes del NCBI, utilizando la herramienta BLASTn, se obtuvo un porcentaje de similitud del 99,7% con la secuencia nucleotídica de la especie R. similis, proveniente de Costa Rica, código de acceso: HM212650.
El análisis conjunto de las secuencias nucleotídicas (cuatro secuencias generadas en este estudio y 61 secuencias obtenidas del NCBI de la región ITS) mostró variabilidad intraespecífica en la especie R. similis. La construcción de la red haplotípica de la región ITS1-5.8S-ITS2 permitió identificar 17 haplotipos con una diversidad de Hd= 0,8202. La matriz de distancias entre haplotipos permitió establecer los porcentajes de diferenciación entre ellos, donde el valor más alto alcanzó 4,2% entre los haplotipos H10 y H11 (Figura 3).
Este resultado fue similar a reportado por Tan et al. (2010), el cual fue de 4,6% usando la misma región genómica. De igual manera, Múnera et al. (2010) al estudiar la relación filogenética de R. similis con las especies R. arabocoffeae y R. duriophilus, también encontraron variabilidad intraespecífica de R. similis, con un porcentaje máximo de diferenciación de 5,6% en secuencias nucleotídicas pertenecientes a la región ITS1 de diferentes poblaciones del nematodo, provenientes de varias regiones alrededor del mundo. En el mismo sentido, Elbadri et al. (2002) al estudiar la variabilidad de R. similis de aislamientos provenientes de Centroamérica, el Caribe, África y Europa, usando la región ITS, reportaron una diferencia genética máxima de 4%. Igualmente, Costa et al. (2008) también encontraron variabilidad intraespecífica de diferentes poblaciones de R. similis provenientes de Brasil, Australia, Cuba y Costa Rica, reportando una distancia genética máxima de 4,5%.
En la red haplotípica obtenida en esta investigación se detectó que H1 fue el haplotipo más común de la especie R. similis, debido a que se encontró en la mayoría de los países (Sudán, Malasia, Costa Rica, Guinea, Australia, Sudáfrica, Ghana, Uganda, Panamá, Cuba y México) (Figura 3), lo cual coincide con lo reportado por Tan et al. (2010).
La alta variabilidad genética de R. similis solo se observó en Sudán (África) y Malasia (Asia) debido a que, en estos países, además de hallarse el haplotipo ancestral (H1), también se encontró un mayor número de haplotipos, 10 en Sudán y seis en Malasia (Figura 3). Estos resultados coinciden con los de Tan et al. (2010), quienes también encontraron variabilidad genética en África con 20 haplotipos y Asia con 10 haplotipos, en el cual se incluyeron poblaciones de R. similis provenientes tanto de musáceas como de especies ornamentales. En el caso de África, Tan et al. (2010) proponen que esta situación probablemente se debe a que en este continente se introdujeron varias poblaciones del nematodo desde el Sudeste Asiático aún no identificadas; hipótesis con la que han coincidido otros autores como Fallas et al. (1995) y Plowright et al. (2013).
Fuente: Autores.
Figura 3 Red haplotípica con 17 haplotipos detectados para la región parcial ITS1-5.8S-ITS2 de Radopholus similis. Los círculos representan un único haplotipo, y su tamaño es proporcional al número de secuencias que comparten un mismo haplotipo. Las líneas transversales indican eventos mutacionales y los nodos negros representan a haplotipos no muestreados (H1 - H17= Haplotipo 1 - 17).
En el caso de Centro América y el Caribe, se sabe que la variabilidad genética de R. similis es baja (Tan et al., 2010). De acuerdo con los resultados de la red haplotípica realizada en este estudio, se puede establecer que las poblaciones de R. similis provenientes de países como Panamá, Cuba, Costa Rica y México comparten el haplotipo ancestral (H1), pero dos poblaciones de Costa Rica (códigos de acceso= HM212650 - HM212651) también comparten el haplotipo (H2), el cual se caracteriza por estar distribuido también en varias regiones de Colombia (Antioquia, Arauca, Caldas) (Figura 3).
En el caso específico de Colombia, los resultados demuestran que la variabilidad genética de R. similis en el país es baja, probablemente porque al contrario de lo ocurrido en África, solo una población del nematodo se introdujo a Centroamérica y el Caribe y a partir de esta se derivó el haplotipo colombiano (H2) (Figura 3). Las poblaciones de R. similis recolectadas en Caldas, Quindío y Antioquia del presente estudio, compartieron el mismo haplotipo (H2) junto con las poblaciones colombianas de Múnera et al. (2010), excepto la población “Uraba4” proveniente de Carepa, Antioquia (Código de acceso: GQ281456) (Múnera et al., 2010), el cual corresponde a un único haplotipo (H3) derivado del haplotipo H2 en donde la diferenciación entre ellos solamente está marcada por un evento mutacional (sustitución) (Figura 3); resultado que también encontraron Tan et al. (2010).
Adicionalmente, la poca variabilidad genética encontrada en las poblaciones de R. similis de Colombia posiblemente se deba a que una sola población del nematodo se introdujo a este país, lo cual se puede explicar históricamente con el establecimiento de las plantaciones bananeras en el continente americano a finales del siglo XIX y siglo XX, época en la cual países como Colombia y Costa Rica importaron de Jamaica y Panamá material de siembra de Musa AAA ‘Gros Michel’ y ‘Gros Michel Coco’; los cuales posiblemente ya estaban contaminados con R. similis. En los años 60, al remplazar estos materiales por Musa AAA del subgrupo Cavendish ‘Gran enano’ y ‘Valery’, susceptibles a R. similis, los daños provocados por el nematodo comenzaron a ser notorios (Marin et al., 1998).
Sin embargo, la situación anterior no es la misma para todo el continente americano, debido a que Costa et al. (2008) mencionan que en Brasil la variabilidad genética encontrada en diferentes poblaciones de R. similis se debió posiblemente a que fueron introducidas desde África, donde se ha encontrado gran variabilidad genética del nematodo (Fallas et al., 1995; Plowright et al., 2013).
Gen 18S del ARNr
El producto de PCR obtenido en las amplificaciones de la región parcial del gen 18S del ARNr para las siete poblaciones de R. similis fue del tamaño esperado (Tabla 2).
Al comparar las secuencias obtenidas con las secuencias del banco de genes del NCBI utilizando la herramienta BLASTn, se obtuvo un porcentaje de similitud que osciló entre 99,8 y 100% con la secuencia nucleotídica de la especie R. similis.
De la base de datos del banco de genes del NCBI se seleccionaron siete secuencias nucleotídicas correspondientes al gen 18S de la especie R. similis; las cuales estaban asociadas a un origen y hospedante de Musa conocido. Posteriormente, se realizó el alineamiento de las siete secuencias con las secuencias obtenidas en este estudio (siete secuencias); para un total de 14 secuencias analizadas; obteniendo un fragmento de alineamiento de 398 pb.
Debido a que las secuencias del gen 18S de R. similis registradas en la base de datos del NCBI son escasas, solamente se logró analizar un total de 14 secuencias de Colombia, siete obtenidas en este estudio y siete disponibles en el banco de genes del NCBI, depositadas por Múnera et al. (2010). Mediante alineamiento múltiple de las secuencias se determinó que no había variabilidad intraespecífica entre las poblaciones de R. similis de Caldas, Antioquia, Arauca y Quindío, puesto que todas las secuencias fueron idénticas entre sí, excepto la secuencia “Uraba4” obtenida por Múnera et al. (2010) proveniente de Carepa, Antioquia (Código de acceso: GQ281456), la cual solamente mostró discrepancia en un nucleótido con respecto a las 13 secuencias restantes, resultado que también se obtuvo al analizar la región parcial ITS.
En conclusión, los caracteres morfométricos mostraron la existencia de variabilidad intraespecífica entre las poblaciones de R. similis; lo cual permitió distinguir a las de las poblaciones de Anserma y Belalcázar por tener esófagos más largos, las de Carepa por sus mayores valores alométricos b y b’, y las de Palestina por tener mayor longitud del cuerpo y diámetro en la región anterior en la base del estilete y con esófagos alargados. De igual manera, se demostró que no hubo variabilidad genética entre las poblaciones de R. similis de este estudio. Sin embargo, la red de haplotipos mostró variabilidad genética de las poblaciones colombianas de R. similis con respecto a las asiáticas y africanas.
