Introducción

La hormiga arriera Atta cephalotes (Linnaeus, 1758), se encuentra distribuida desde el norte de Argentina hasta la zona central de Texas. En Colombia se reporta su presencia en la región Pacífica y Andina. Por su actividad defoliadora afecta cultivos como: algodón (Gossypium L.), cacao (Theobroma cacao L), yuca (Manihot esculenta Crantz), maíz (Zea mays L), caucho (Hevea brasiliensis Mull. Arg.), caña de azúcar (Saccharum officinarum L) y cítricos (Britto et al., 2016; ^{Fernández, Castro-Huertas, & Serna, 2015}) es considerada un especie plaga, estimándose que pueden consumir entre 50 y 150 kg de material vegetal por día. Adicionalmente se ha reportado el daño a edificaciones y carreteras por la desestabilización de los suelos a causa de la remoción de tierra en la construcción de hormigueros.(^{Zanetti et al., 2014})

Entre los métodos de control de la hormiga arriera, se encuentran los métodos mecánicos, químicos y biológicos. El control mecánico consiste en remoción de los hormigueros con la extracción de la hormiga reina y destrucción de las cámaras de cría, este método presenta una afectividad de aproximadamente 30% (^{Zanetti et al., 2014}). El control químico se fundamenta en la aplicación de insecticidas, que generalmente tienen como componentes activos sulflurami-da, fipronil, deltametrina, cloporifos y fenitrotión, los cuales pueden presentar riesgos para la salud humana (^{Dominah, McMinimy, Kallon, & Kwakye, 2017}; ^{Villar et al,, 2016}), por su bio-concentración, bio-acumulación y bio-magnificación en el ecosistema (Michel et al., 2016; ^{Qu, Ma, Liu, Gao, et al., 2016}; Qu, Ma, Liu, Jing, et al., 2016) o asociados al desarrollo de resistencia en plagas de impacto económico como las garrapatas (Rhipicephalus (Boophilus) microplus) (^{Villar et al., 2016}), ácaros (Phenacoccus solenopsiss (^{Ejaz et al., 2017}) y la hormiga de fuego (Solenopsis invicta) (^{Zhang et al., 2016}), en algunos casos su aplicación se realiza por nebulización térmica, lo cual incrementa la contaminación, trazas en el suelo y no logra afectar la totalidad de las hormigas presentes en el hormiguero. Entre los métodos biológicos se encuentran la aplicación de extractos vegetales (^{Diaz Napal et al., 2015}; ^{Morais et al., 2015}) y el empleo de cultivos trampa (^{Stenberg, Heil, Ahman, & Björkman, 2015}) los cuales reducen temporalmente la población del hormiguero sin acabarlo definitivamente; por lo que se recomienda el acompañamiento de otros mecanismos de control para garantizar la efectividad (^{Zanetti et al., 2014}). Por todo lo anteriormente mencionado el uso de controles biológicos en la agricultura ha ido creciendo continuamente, dentro de estos se ha utilizado cada vez más biocontroles compuestos por esporas de hongos filamentosos como es el caso de B. bassiana; cuyas esporas atacan al insecto plaga (hormiga arriera) y Trichoderma sp. que se caracteriza no solo por atacar el insecto sino también por parasitar otras especies 2901 fúngicas que afectan a cultivos agroindustrialmente importantes (^{Lacey, 2017}).

Debido al impacto negativo de la hormiga arriera en la seguridad alimentaria, así como el impacto en la economía de la región y el país, se hizo necesario desarrollar y evaluar la capacidad de un bioinsecticida compuesto por esporas de B. Bassiana (ATCC MYA-4886) y T lignorum (ATCC 8751), para el control de la hormiga arriera (Atta cephalotess en condiciones de laboratorio, y el potencial riesgo asociado a la exposición del bioinsecticida por los manipuladores y agricultores que lo utilizan.

Los bioinsecticidas desarrollados a partir de hongos filamentosos se convierten en una de las principales estrategias de control de insectos. En el caso aquí expuesto la utilización de los dos hongos filamentosos anteriormente mencionados en una formulación es un desarrollo que permite al agricultor utilizar productos eficaces contra las plagas agrícolas (hormiga arriera) de forma que no haya un impacto negativo sobre el medio ambiente y sobre la salud humana, minimizando al mismo tiempo el uso de agroquímicos que poseen un fuerte impacto negativo medioambiental y conlleva riesgos en la salud cuando se utiliza. Esta formulación recibió una patente de invención por la superintendencia de industria y comercio de la república de Colombia y se registró una nueva patente en la república de Argentina.

1. Metodología

En esta investigación se emplearon cepas de Beauveria bassiana (ATCC MYA-4886) y Trichoderma lignorum (ATCC 8751), crecidas en medio PDA (agar papa dextrosa) incubadas a 28 ± 1°C, durante 5 días. Las esporas se colectaron por raspado de la superficie y posterior filtrado, depositándolas en 500mL de YPD (extracto de levadura - peptona - dextrosa), y ajustando a 1x106 esporas/mL empleando un hemocitómetro Neubauer, (^{Greenfield et al., 2016}). En un fermentador (BIOSTAT® B) se colocó el inóculo en 4L de YPD, para su crecimiento durante 4 días, a 20 rpm de agitación, 30°C y pH 5.4 (^{Jirakkakul et al„ 2017}; Miranda-Hernández, Angel-Cuapio, & Loera-Corral, 20l7). Finalizado el crecimiento se prosiguió a la corroboración de las especies fúngicas crecidas y al posterior conteo de esporas.

Se desarrollaron cinco formulaciones con relaciones de 1:1, 6:4, 4:6, 3:7, 2:8 de Beauveria bassiana y Trichoderma lignorum respectivamente (Formulaciones A, B, C, D y E) donde la concentración inicial fue 1x10⁹ esporas/mL de cada uno de los hongos. Se evaluó la pureza, viabilidad, pH y patoge-nicidad de cada una de las formulaciones experimentales.

Pruebas de viabilidad y pureza de las formulaciones experimentales

Con la prueba de viabilidad se determinó el número de esporas viables, para esto se depositó en medio agar-agar (5 mL y 100 μL en caja petri y cubreobjetos respectivamente), diluciones de 1:4 y 1:20 de cada formulación y se incubaron a 30°C por 24 h, seguidamente se tiñó con azul de lactofenol, y se observó a 40X. La viabilidad se determinó como la relación entre las esporas germinadas por cada l00 esporas, cada conteo se realizó por triplicado (^{Faria, Lopes, Souza, & Wraight, 2015}).

Con la prueba de pureza se determinó y evaluó la existencia de organismos contaminantes en las formulaciones, estas se ajustaron a 1x102 esporas/μL, depositando 100 μL en cajas petri con PDA y AN (agar papa dextrosa y agar nutritivo) e incubaron por 10 días a 30°C, evaluando diariamente la presencia de colonias de organismos contaminantes. El porcentaje de pureza se determinó como la relación entre las unidades formadoras de colonias de los microorganismos contaminantes y las unidades formadoras de colonia de las especies fúngicas del insecticida por 100. En todas las formulaciones se determinó el pH, tomando 1mL de la formulación y se depositandole en 9 mL de agua ultrapura estéril y luego se prosiguió a cuantificar el valor de pH.

Para el desarrollo de la prueba de patogenicidad se colectaron 30 individuos de Atta cephalotes por cada formulación, en los hormigueros presentes en el campus universitario (3° 20' Norte, 75°32' Oeste); seguidamente se trasladaron al laboratorio donde cada individuo se desinfecto y fue sumergido por 30s en cada una de las formulaciones, retirando el exceso con papel absorbente, y depositándolos en frascos estériles a 28°C y humedad relativa del 80%. Se empleó como solución de inmersión negativa con agua estéril (Sun et al., 201 3). Se registró diariamente la muerte de individuos y el crecimiento fúngico.

Pruebas de colonización en murinos

Esta prueba se llevó a cabo en el bioterio de la Universidad ICESI-Cali, durante 32 días, donde 20 (4 por cada tratamiento) ratas Wistar (machos) de 12 semanas de edad, fueron sometidos a 5 tratamientos que correspondieron a: 1) esporas de T. lignorum (2x106 esporas/g); 2) esporas de B. bassiana; 3) esporas de T. lignorum (ATCC 8751), y B. bassiana (ATCC MYA-4886); 4) esporas de T. lignorum, y B. bassiana, aisladas de Mycobac y Mycontrol ® SE, cada tratamiento a una concentración de 2x106 esporas/mL y como control negativo agua estéril. La exposición se realizó durante 6 horas, los días 1 y 16, monitoreando el comportamiento y peso cada 72 h, manteniéndose a 16.5°C y 55% de humedad relativa, hasta el sacrificio (día 32).

El sacrificio se efectuó mediante la aplicación de 1,5 mL de Euthanex vía intraperitoneal, según protocolo del bioterio. El diagnóstico veterinario se realizó mediante disección y observación macroscópica. Los pulmones de biomodelos fueron almacenados en solución salina 0.89%, y procesados en el laboratorio de investigaciones de la Universidad de San Buenaventura- Cali. La colonización de estos tejidos se evaluó mediante la homogenización por 15s (homogenizador de tejidos, Omni International Kennesaw, GA) y siembra de 10 uL por triplicado en medio YPDA (DifcoTM ), incubando a 28°C (Thermo Scientific, Heratherm IGSI80) durante 7 días, (^{Bandh, Kamili, Ganai, & Lone, 2016}) se identificaron las especies fúngicas morfológicamente hasta el nivel de género.

Aspectos éticos

Para la ejecución de la investigación se contó con el aval ético Ing7115, otorgado por el comité de ética de la investigación de la Universidad de San buenaventura-Cali. Aval del comité de ética animal CIECUAE de la universidad ICESI no 0023 del 2017.

2. Resultados

La prueba de viabilidad en caja de Petri mostró crecimiento a 24 y 48 horas de la totalidad de las formulaciones, en sus diferentes diluciones 1:20, 1:4 y formulación pura. No se observó crecimiento en la caja designada como control (Figura 1)

Fuente: Los autores, 2018.

Figura 1 Prueba de viabilidad de las formulaciones de bioinsecticidas evaluadas. 

En la Figura 1, las formulaciones se designan con las letras de la A hasta la E, en éstas se observa el crecimiento de las diluciones 1:20 (flecha roja), 1:4 (flecha azul), y formulación pura (flecha blanca) a 24 y 48 horas; adicionalmente se observa la placa control (los puntos negros corresponden a los lugares de siembra) y la viabilidad de las esporas a 40X, donde se puede identificar la germinación de la espora y el crecimiento de la hifa.

Las esporas contenidas en la formulación presentaron viabilidad de 90 a 92%, donde la mayor viabilidad se observó en las esporas contenidas en la formulación B. No se registró crecimiento de organismos diferentes a B. bassiana y T. lignorum, en las pruebas de pureza de las soluciones de esporas individuales, a partir de las cuales se realizaron las diferentes formulaciones. Resultados similares fueron observados al evaluar la pureza de cada una de las formulaciones. Según la relación de los hongos se observó el crecimiento mayor o menor de una especie en particular, un caso es la formulación B, en la cual se observa la dominancia de la especie T. lignorum y pequeños bordes asociados a B. bassiana, los cuales se redujeron proporcionalmente a la relación de T. Lignorum en las formulaciones. Las formulaciones que presentaron mayor patogenicidad, medida como la muerte de la totalidad de los individuos en menor tiempo fueron las formulaciones Ay B, seguidas en el orden por la formulación E, D y C, donde se observó la muerte de la totalidad de las hormigas a los días 8, 9, y 10 respectivamente (Figura 2).

Fuente: Los autores, 2018

Figura 2 Prueba de patogenicidad en laboratorio. 

En la Figura 2, las letras corresponden a las formulaciones evaluadas. Las formulaciones A-E mostraron crecimiento fúngico del I00%, el control empleado no registró crecimiento.

Todos los individuos se dejaron en medio humedecido hasta observar el crecimiento fúngico (Figura 3), este se presentó en la totalidad de las hormigas expuestas a las diferentes formulaciones.

Fuente: Los autores, 2018

Figura 3 Prueba de patogenicidad de las formulaciones. 

En la Figura 3, se observa el crecimiento fúngico (flechas azules), en hormigas tras la exposición a cada una de las formulaciones (letras en recuadro).

En cuanto a la evaluación del bioinsecticida en ratas Wistar, no se evidenciaron alteraciones en comportamiento, y en el peso (g) de los individuos en los grupos evaluados (Figura 4).

Fuente: Los autores, 2018

Figura 4 Comportamiento de peso promedio de los biomodelos durante la experimentación. 

A nivel fisiológico se observó que el 75% y 50% de los sujetos expuestos a los tratamientos 2 y 4, presentaron alteraciones, a nivel de pulmón y uno de ellos en hígado (4). En pulmón se observó coloración blanca puntiforme, y presencia de focos hemorrágicos en un individuo, en el hígado se identificó necrosis (Figura 5).

Fuente: Los autores, 2018

Figura 5 Diagnóstico veterinario 

En la Figura 5, las letras A, B, C corresponden a lóbulos pulmonares de los individuos número 6, 5, 13 en los cuales las flechas señalan marcas puntiformes de color blanco, como diagnóstico macroscópico una posible infección micótica o bacteriana; las letras D, E y F, señala adicionalmente lesiones hemorragias en lóbulos pulmonares y posible lesión necrótica en hígado en los individuos 16 y 7, respectivamente.

Los análisis de microbiología mostraron la presencia de levaduras en las muestras de todos los grupos, bacterias en el 25% de biomodelos de tratamiento 2, y hongos en el 25% de los individuos del grupo 2,4 y 5, respectivamente (Tabla 1).

Tabla 1 Evaluación de colonización fúngica en biomodelos (ratas Wistar). 

Nota: Uno de los biomodelos de este grupo fue eliminado del análisis, por presentar muerte repentina, no asociada a la exposición. En la tabla T= tratamiento, in= individuos, Dx Vet= diagnóstico veterinario, S=sano, E=enferemo, + = presencia y - =ausencia.

Fuente: Elaboración propia

3. Discusión y conclusiones

En el presente estudio de laboratorio, se demostró que el tratamiento con una formulación que contiene conidias de B. bassiana y T. lignorum, presenta actividad insecticida en A. cephalotes, con la capacidad de ser considerado como una herramienta de control para esta plaga agrícola. Las diferentes formulaciones evaluadas presentaron letalidad en los individuos, encontrándose diferencias en el tiempo de muerte de los individuos, donde el menor tiempo correspondió a la relación de 1:1 de las conidias de ambos hongos filamentosos, incrementándose el tiempo de eliminación del insecto a mayor relación de esporas de B. bassiana respecto a T. lignorum. A pesar de esto es este hongo entomopatógeno (ß. bassiana) el que a partir de la literatura especializada aparece relacionado y probado como agente control de diferentes artrópodos considerados plaga (^{Andreadis et al., 2016}; ^{Ullah & Lim, 2017}) y donde la infección en esta especie está mediada por la adhesión de la conidia al exoesqueleto, seguido por la formación de túbulo germinal, la degradación de la cutícula, la colonización del hemocele evadiendo el sistema inmune, donde segrega toxinas y se alimenta de la hemolinfa hasta finalmente producir la muerte del anfitrión, del cual emerge (Valero-Jiménez et al., 2016). Esto difiere considerablemente de la acción de T. lignorum el cual produce toxinas que en general propenden por la destrucción de los esclerocios produciendo la muerte de hongos, por lo cual ha sido empleado como control de hongos patógenos (Al-Hazmi & TariqJaveed, 2016). Estas diferencias permitirán esperar la infección y muerte de los individuos en rangos de tiempo más cortos. Si bien la infección de artrópodos por T. lignorum no se encuentra reportada, existen casos de infección por Trichoderma longibrachiatum (^{Ghosh & Pal, 2016}), por lo cual es posible que otras especies pertenecientes a este género puedan parasitar insectos, como se observó en el presente estudio.

La reducción en el periodo de muerte de los individuos y su relación inversa con la concentración de B. bassiana, se puede explicar por un efecto aditivo durante la infección fúngica, donde la colonización por B. bassiana permitirá la exposición del hemocele y la entrada de T. lignorum, que incrementaría la concentración de toxinas, o la pérdida de nutrientes en el huésped y conduciría a una muerte más temprana. Otra posible explicación se encontraría explicada por la infección inicial del huésped por B. bassiana, al establecerse esta infección, la especie puede ser empleada como sustrato por T. lignorum, el cual la parasitaria, de esta forma puede ingresar al hemocele del insecto y así continuar con la infección en el individuo. Ambas hipótesis requieren de estudios más precisos. A pesar de esto, se puede resaltar la obtención de ambas especies a partir de los individuos infectados, adicionalmente al cultivar las formulaciones en medio PDA se observó un crecimiento inicial de la especie B. bassiana seguido por la colonización de T. lignorum, donde este último, después de 15 días, se convertía en la única especie fúngica presente, lo cual siguiere una infección secuencial en los individuos.

La característica dual de las formulaciones evaluadas se fundamenta en el control de la A. cephalotes, empleando una reducción en el número de individuos, la cual está mediada por la actividad de B. bassiana, así mismo la reducción en la fuente alimenticia mediante la infección del hongo simbionte. Los resultados observados en laboratorio sugieren que estas formulaciones pueden ser empleadas en el control de A. cephalotes. A pesar de esto se requieren estudios de campo, donde las condiciones ambientales permitan establecer la efectividad de estas.

Los análisis fisiológicos y el cultivo microbiológico, mostraron que la exposición aérea de los manipuladores del bioinsecticida sin contacto no permite la introducción de esporas al organismo, así mismo no se afecta el comportamiento y ganancia de peso de los biomodelos; estudios similares concuerdan en que la inoculación de esporas de B. bassiana por vía respiratoria en animales sanos, no genera aparición de patologías (^{Perfetti, Quintero, & Moreno, 2015}), por lo cual los resultados del estudio confirmarían estas observaciones. A pesar de esto hasta la fecha se conoce de 10 reportes de infecciones en humanos, donde en algunos casos se comporta como patógeno oportunista (^{Lara Oya et al., 2016}; ^{Ogawa, Matsumoto, Yaguchi, Shimmura, & Tsubota, 2016}) respecto a Tlignorum. En esta investigación no se observaron alteraciones patológicas en los biomodelos de experimentación, y no se aislaron los hongos entomopatogenos a partir de los cultivos de los tejidos, esto confirma la incapacidad de infección por estas esporas a pesar de presentarse en prestación liquida y en polvo sin inoculación directa. En los caso de infección la literatura especializada reporta que se caracterizan por lesiones en hígado, sin afectaciones pulmonares y recuperación del hongo mediante el cultivo (^{Vargas & Dussan, 2002}), aspectos negativos en este estudio, así mismo la infección de cepas de este género se observa en individuos inmunocomprometidos (^{Tascini et al., 2016}; ^{Vargas & Dussan, 2002}).