Introducción
La producción acuícola va en aumento en las últimas décadas conjuntamente con la demanda de tecnologías que optimicen el sistema a nivel continental, pasando de extensivos a intensivos y que permitan obtener cultivos de calidad nutricional 1. Una de estas tecnologías es la tecnología biofloc (TBF), porque usa microrganismos como algunas bacterias, algas, meiobentos, entre otros, como alimento vivo, lo que permite la disminución, tanto de la administración de alimento balanceado 2, como del porcentaje de proteína bruta que puede pasar de 35% a 28% y 22%, sin tener diferencias significativas en la producción 3,4; además mejora la calidad del agua porque recircula nutrientes, razón por la que se puede ahorrar desde el 30% hasta un 50% el recambio de agua lo que evita la contaminación de los ríos y mares 5,6,7,8.
Al usar la tecnología biofloc se obtienen sistemas intensivos y superintensivos. Al respecto, Krummenauer et al. 9, evaluaron la densidad de siembra en 120 días de cultivo con TBF (Tecnología Biofloc) de L. vannamei, reportaron una supervivencia consistente en 92, 81 y 75% con mejoras en el rendimiento de 150, 300 y 450 camarones/m2, respectivamente. Al implementar esta tecnología se incrementa la demanda y aplicación de instrumentos para mejorar la aireación como es el uso de blowers y sistema de aireación con tubos PVC o mangueras difusoras que permitan mantener los niveles óptimos de OD para cada especie a menor inversión 10.
Por otra parte, un buen sistema de aireación debe contribuir a que los flóculos se mantengan en suspensión e influencia en el tamaño de los mismo, siendo lo ideal entre 3 a 5 milímetros. Además, permite que los microorganismos puedan transformar el alimento no consumido (heces, gases liberados, entre otros), en general toda la materia orgánica a proteína microbiana 11. Es probable que, más que el tamaño de partícula o la abundancia de flóculos, la ruptura de la estructura del flóculo afecte la distribución e interacción de las bacterias nitrificantes dejando consecuencias en el proceso de nitrificación 12. Además, la aireación puede causar la ruptura de los flóculos y, por lo tanto, disminuir los procesos de nitrificación 13.
Por lo anteriormente expuesto, se pretende determinar la eficiencia del uso de tubería PVC perforada a un extremo y de manguera difusora, como sistemas de aireación en cultivos con biofloc con diferentes niveles de PB.
Materiales y metodología
Localización
Los bioensayos se desarrollaron en la sala experimental de producción de organismos acuáticos de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Técnica de Manabí (UTM), ubicada a 1º 9’53.3’’ de latitud sur y 80º 23’28.7’’ de longitud Oeste en Portoviejo, Manabí, Ecuador.
Diseño experimental para montar el experimento
Se utilizó la metodología macrocosmos-microcosmos 14,15, que consistió en un tanque circular de PVC con 3.000 L (litros) de capacidad (macrocosmos) para la conformación del biofloc inicial y 15 tanques circulares de PVC de 300 L cada uno (microcosmos). Después de 20 días de incubación del biofloc, este se vertió a los tanques microcosmos a una proporción del 20% de su capacidad. Todos los tanques estuvieron conectados a un blower de 2,5 HP (Tipo RB-0225, Brasil) para garantizar la aireación del agua y la suspensión de las partículas en la misma.
Preparación del biofloc
El biofloc se preparó en el tanque macrocosmos, para lo cual se utilizaron 2.500 L de agua de mar filtrada (mangas de 10 µm). Se inoculó un cultivo de Thalassiosira spp. (2,6 x 104 células /mL, fertilizado con nitrato de sodio (0,03 g /L) y stimufolK (Nutriente especial complejo con nitrógeno, fósforo y potasio, con oligoelementos quelados de la casa comercial Syngenta, España), se aplicaron 0,01 g/L y 250 g de probiótico (Pondplus de Bayer e importado por Ecuaquímica) que contenía una mezcla de Bacillus subtilis, B. lincheniformis, B. amyloliquefaciens, B. megaterium, y B. pumilis, a una concentración de 109 ufc/g. Después de cuatro días se sembraron 62 camarones de 12,3 ± 1,1 g de peso promedio para que ayudaran a la formación del biofloc a través del movimiento y alimentación 14,15. Se les proporcionó diariamente alimento balanceado dos veces al día con 35% de PB al 4% de peso corporal/día de la biomasa de camarones en el tanque. Cuando el biofloc estuvo maduro (sólidos sedimentables mayor que5 mL/L en el cono Imhoff) y tuvieron los niveles bajos de nutrientes residuales (menos de I mg/L), el agua se transfirió a los microcosmos para la realización del bioensayo.
Adición de sustancias
Durante 15 días, para promover y estabilizar la comunidad heterotrófica del biofloc, se realizó diariamente la fertilización a una relación C/N= 20:1, mediante el aporte controlado de carbono con la adición de melaza de caña y el nitrógeno proveniente del alimento balanceado. Para la fase de mantenimiento, esta fertilización se efectuó después de determinar los niveles de amonio, nitrito y nitrato presentes en cada microcosmos 16.
Cálculo para determinar el nivel de carbono:
C = Cantidad de alimento x 0,9 (90% de materia seca) x 0,8 (80% de residuos que permanecen en el agua) / 2 (contenido de carbono en la alimentación aproximadamente del 50%).
Cálculo para determinar el nivel de nitrógeno:
N = Cantidad de alimento x 0,9 (90% de materia seca) x 0,7 (70% de residuos que permanecen en el agua) x 0,35 (nivel de proteína en el alimento) / 6,25.
Las sustancias y los cálculos se realizaron para cada uno de los tanques utilizados en el bioensayo.
Adaptación de las poslarvas de camarón para el bioensayo
En un tanque de 3000 L de capacidad, se produjo 3.500 ± 100 poslarvas provenientes de la Camaronera Manabita S.A. con un peso de 200 poslarvas en un gramo (peso promedio 5 mg, se añadió biofloc con el objetivo de acondicionar a las densidades de microorganismos y a la alimentación de 35% de PB.
Biometrías y alimentación de juveniles de camarón para el bioensayo
Se sembraron camarones de 3,03 ± 0,25 gramos. Para las biometrías se procedió a la medición de los camarones desde el rostro hasta el telson y se pesaron en una balanza analítica Ohaus. Se alimentaron dos veces por día (07:00 a.m. y 4:00 p.m.) a una tasa de alimentación de 6% del peso corporal/día durante 60 días, ajustando las raciones cada 15 días a través de muestreos de los animales.
Tanques del bioensayo
Para el bioensayo (microcosmos) se aplicaron dos sistemas de aireación: 1) salida de aire de un tubo de PVC de ½ pulgada con una abertura de 3 mm en el extremo (Figuras 1 y 2) manguera difusora (Figura 2). En cada tanque se vertió 20% de biofloc y un 80% de agua de mar filtrada.
Alimentación
Para los T1 y T3 se suministró alimento balanceado de 28% de PB, mientras que para los T2 y T4 se incluyó alimento balanceado de 22% de PB. Se alimentó al 2,02%; 2%; 1,95% y 1,9% del peso del camarón obtenido en cada biometría.
Parámetros ambientales
Se registraron diariamente (7:00 am y 4:00 pm) los valores de temperatura, oxígeno disuelto, el pH (multiparámetro digital YSI, EUA) y la salinidad (refractómetro Aquafauna-Master EUA).
Se utilizó el espectrofotómetro HACH para evaluar los niveles de NH4, NO2, NO3, PO4, TAN (Nitrógeno Amoniacal Total). Esta evaluación se realizó cada cuatro días.
Prueba de sedimentación
El volumen de sólidos sedimentables del biofloc se midió para conocer la cantidad de materia orgánica en suspensión. La medición se realizó dos veces/semana con conos Imhoff 17, los que se llenaron con un litro de agua del tanque de experimentación y al término de 10, 20 y 30 minutos se registró la cantidad de sólidos que sedimentaron en el cono.
Diseño experimental
Se evaluó la eficiencia para mantener los niveles óptimos de OD mediante dos materiales de aireación, el uno mediante tuvo PVC y el otro con manguera difusora.
Se realizó un experimento completamente al azar con tres réplicas: para el tratamiento uno (T1) se utilizó tubería PVC, y un alimento al 28% de PB; en el tratamiento dos (T2) se usó manguera difusora y un alimento del 22% de PB; el tratamiento tres (T3) se utilizó manguera difusora y un alimento con el 28% de PB; En el tratamiento cuatro (T4) se usó tubo PVC y un alimento del 22% de PB. Estos cuatro tratamientos se cultivaron con biofloc.
Análisis estadístico
ANOVA y Modelo Lineal General (MLG) del OD . Se realizó un análisis descriptivo de cada tanque y después de cada tratamiento para observar si se distribuía dentro de la normal mediante la prueba de Ryan-Joiner 18.
Se observó que las variables pH (mañana y tarde), NO2, NO3, NH4, sedimentación y supervivencia no se distribuyen normal.
Se transformaron las variables utilizando Box-Cox (W = Y^λ), para el valor de λ=0,5, lo que permitió trasformar las variables pH mañana y tarde, NO2, NO3 y NH4; para las otras variables se buscaron diferentes métodos de transformación, obteniendo resultados negativos.
Primero se realizó la técnica de ANOVA de un solo factor con α = 0,05 para cada etapa del día (mañana y tarde) de OD y peso. Se obtuvo un valor de p=0,054 para los dos casos, por lo tanto, se consideró que existe diferencia significativa entre los tratamientos de igual manera la ganancia de peso, con un p= 0,043.
De tal forma que se analizó la influencia de los factores y de las covariables, para lo cual se utilizó ANOVA del Modelo Lineal Generalizado (MLG) tanto para la mañana como la tarde y observar si existe interacción entre las variables. Se realizó la prueba de Tukey para saber que tratamiento aporta de mejor manera a las concentraciones de OD.
Se utilizó el método paso a paso para descartar los factores y variables que no influencian en el modelo. Los factores considerados fueron: temperatura, tratamiento y TAN; y como co-variables: peso, talla, alimentación, pH, PO4, UPS.
Análisis de variables que afectan de manera indirecta al OD
Se utilizó como covariables los valores del NH4, NO2, NO3 y PO4. Se usó el tratamiento como factor, para determinar la influencian en los valores del TAN.
Se realizó un primer ANOVA del MLG, se vieron los aportes significativos de cada una de las covariables y del factor, se retiraron las que no aportaban significativamente al modelo. Para trasformar estas variables se usó el método Box-Cox (W = Y^λ), para le valor de λ=0.5. Los datos se corroboraron con el método paso a paso.
Prueba de Kruskal-Wallis. Las variables que no se logró transformar a la normal son: pH mañana y tarde, supervivencia y sedimentación (10, 20, 30 min). Se analizaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis, además, como prueba complementaria se aplicó el test de medianas de Mood 19. Se plantearon las siguientes hipótesis: hipótesis nula, todas las medianas son iguales; hipótesis alterna, al menos una de las medianas es diferente. Se utilizó un nivel de significancia α=0,05.
Softwares estadísticos. Los datos se procesaron con la ayuda de los paquetes estadísticos InfoStad: 20-09-2018, Minitab versión 17 y SPSS versión 25.
Resultados
Análisis exploratorio de los datos
En la tabla 1, se muestran los estadísticos descriptivos como la media, coeficiente de variación y de asimetría, utilizados para visualizar el comportamiento de cada variable de los tratamientos. Nótese, que el coeficiente de asimetría en la mayoría de las variables se comportó simétricamente, donde el valor de g (verifica que μ4=3σ4) se acerca a cero, por lo tanto, se podría entender que se tuvo una distribución normal. Las variables como: pH en la mañana y la tarde, NO2, NH4, NO3 y supervivencia presentan valores altos positivos y negativos, esto se pudo observar en las variables que no se comportan normal. La media y el coeficiente de variación nos permitió identificar la variabilidad de cada tratamiento.
Resultados de ANOVA del MGL de la mañana
Se analizó la variable OD como variable dependiente; peso, talla, alimentación como covariables y como factores tratamiento y TAN. En la mañana el peso (p=0,03) y factor tratamiento (p=0,01) es el que aportó significativamente, lo que permitió evidenciar que estas variables influencian en la disminución en la concentración del OD, El resto de factores y variables no son significativos; el valor de R2 ajustado fue de 63,23%.
Prueba de Tukey del OD en la mañana de cada tratamiento
Como se observa en la tabla 1, el tratamiento T3 y T2 son significativamente diferentes. En los demás tratamientos no existió diferencia significativa.
Resultados de ANOVA del MGL de la tarde
Al igual que la mañana, se analizó el OD como variable dependiente; peso, talla, alimentación como covariables y como factor tratamiento y TAN. Las variables peso (p=0,031), talla (p=0,005), alimentación (p=0,007) y el factor tratamiento (p=0,002) son significativamente diferentes, lo que evidenció que estas variables influencian en la disminución del OD y que el tratamiento juega un papel importante en la disminución ya que este está compuesto por diferentes niveles de proteína y material de aireación; el R2 ajustado fue de 85,6%.
Prueba de Tukey de los valores del OD en de la tarde de cada tratamiento
Los tratamientos T1, T3 y T2 son significativamente diferentes, pero T3 y T4 son semejantes a T1; T4 y T2 son similares (Tabla 1).
ANOVA (MLG) del TAN
Se utilizó los valores del TAN como variables dependientes; como covariables el NH4, NO2, NO3, PO4 y como factor el tratamiento, Se observó que las variables que influenciaron significativamente al incremento del TAN, estas fueron: NO2 (p<0,001), NH4 (p<0,001) y el factor (tratamiento) no fue significativo, El valor de R2 ajustado del 99,43%.
Análisis del pH mediante el test de Kruskal-Wallis y de medianas de Mood
Se obtuvo un valor de p=0,04 en la prueba de Kruskal-Wallis, por ende, se acepta la hipótesis alterna, En el test de Mood se obtuvo el valor p = 0,051, se decidió aceptar la hipótesis alterna, es decir, que existió diferencias significativas entre T2 y T4 en las medianas del pH de la mañana y no hubo diferencia entre T1 y T3, además en T4 se observa un valor de pH alcalino (Tabla 2). Lo contrario se obtuvo en la tarde con un p= 0,09 en la prueba de Kruskal-Wallis por lo que se acepta la hipótesis nula.
Medianas altas están representadas por el número de mayor valor, tratamientos que presentan el mismo número no son significativos, se realiza comparaciones entre N para observar la diferencia existente entre estos, según la prueba de Mood, Las medianas se muestran con el límite de confianza al 95%.
Prueba de Kruskal-Wallis para la supervivencia
Se obtuvo un valor de p=0,329, por ende, se aceptó la hipótesis nula.
Prueba de Kruskal-Wallis y de la mediana de Mood para la sedimentación
En la prueba de Kruskal-Wallis a 10 min obtuvo un valor de p=0,043, por ende, se aceptó la hipótesis alterna, Y para la prueba de la mediana de Mood en el mismo tiempo se obtuvo un valor p = 0,04, se observa en la tabla 3 que T1 y T4 son diferentes, T1 presento un valor alto de sedimentación y T4 un valor bajo de sedimentación; a los 20 minutos se obtuvo un valor de p=0,021 en la prueba de Kruskal-Wallis, en la prueba de la mediana de Mood obtuvo un valor p= 0,047, además, se observó que T3 y T4 son diferentes y existió diferencia entre T1, T2 y T3, con un valor alto de sedimentación en T3 y el un valor bajo de sedimentación para T4; A los 30 minutos se obtuvo un valor de p=0,029 para Kruskal-Wallis y en la prueba de la mediana de Mood, se obtuvo el valor p=0,047 igual que los resultados de los 10 y 20 minutos, además se observó que T3 y T4 son diferentes: en T3 se observa mayor sedimentación y menor sedimentación en T4.
Medianas (Med) altas están representadas por el número de mayor valor, tratamientos que presentan el mismo número no son significativos, se realizan comparaciones entre N para observar la diferencia existente entre estos, según la prueba de Mood (α = 0,05), Las medianas se muestran con el límite de confianza al 95%.
Discusión
Los resultados obtenidos en este estudio indican algunas variables y parámetros que influyen en las concentraciones del OD (Tabla 1). Ibarra et al3, utilizaron en cultivos de Litopenaeus vannamei como tratamiento control, al 35% de PB sin biofloc y tres tratamientos con 22%, 28% y 35% de PB con biofloc, todos los tratamientos usaban como sistema de aireación manguera difusora, donde no existieron diferencias significativas entre los niveles de PB. Estos resultados son similares a los obtenidos, donde los tratamientos con PVC y manguera difusora con los niveles de 22 y 28% de PB no presentaron diferencias significativas en cada sistema de aireación, pero existen diferencias significativas entre los tratamientos que usan como sistema de aireación tubería PVC y manguera difusora, siendo los de PVC, los que registran mayor ganancia de peso.
En cuanto al OD reportan valores que van desde 5,55 - 6,76 mg/L, estos resultados son similares a los obtenidos en este estudio. Samocha T. 10, utiliza mangueras difusoras, piedras difusoras y difusores de microburbujas, lo que permite mantener buenos niveles en un rango de 4 mg/L hasta 8 mg/L de OD, en diferentes salinidades y temperaturas, siendo lo ideal que esté por encima de 5 mg/L, estos rangos son similares a los resultados registrados en este estudio donde se observó que los T2 y T3 con manguera difusora mantienen buenos niveles, pero T2, en la mañana, obtuvo el menor aporte de OD al comparar con todos los tratamientos.
Por otro lado, Quinteros et al. 20, reportan resultados diferentes a los obtenidos en este estudio al utilizar en un tratamiento tubería PVC dentro del sistema de aireación y otro con recambios de agua, no hubo diferencias significativas entre los tratamientos, pero si existen diferencias significativas al medir el OD en la mañana y la tarde en cultivos con Oreochromis sp, siendo similares a los resultados obtenidos en todos los tratamientos, con la diferencia que los tratamientos con PVC (T1 y T4) tienen mejores niveles de OD en la mañana al utilizar 28% PB y 22% PB, respectivamente, y en la tarde, el T3 que utiliza manguera difusora y 28% PB, al igual que T1, son los tratamientos que reportan los mejores niveles de OD y T4 el de menor nivel. Se debe incluir que las variables peso, talla y alimentación están influyendo significativamente en el OD.
Para las concentraciones de TAN, NH4, NO2, NO3 y PO4, Ibarra et al.3, no encontraron diferencias significativas entre los tratamientos 22%, 28% y 35% de PB cuando compararan los valores de TAN obteniendo valores entre 0,54 y 0,62, de igual manera sucede con los PO4, no obtienen diferencias significativas entre los tratamientos, obteniendo valores entre 0,86 mg/L y 1,36 mg/L al finalizar la investigación siendo estos valores menores a los reportados en este estudio donde T2 fue le tratamiento que menores niveles de TAN y PO4, pero si encontraron diferencias significativas al comparar NO2 y NO3, siendo los tratamientos de 22% y 35% de PB los que mayor NO2 presentan al finalizar la investigación con valores de 1,6 mg/L y 1,68 mg/L respectivamente, siendo estos valores superiores a los registrados en este estudio, sin embargo, no hubo diferencia significativa entre los tratamientos siendo el T4 el de menor nivel de NO2, además se comprobó que las variables NO2 y NH4 son las que están influenciando en los niveles del TAN ,a lo contrario de NO3 y PO4, sin embargo, los resultados que obtienen Quinteros et al., 20, son aún menores que los repostados en este estudio con valores de 0,05 mg/L de NO2. Morais et al21, compararon los procesos de nitrificación con tecnología biofloc vs biofilms y aireación versus sin aireación obteniendo valores menores de 1,70 mL de TAN (Tabla 1).
Malpartida 22, menciona que la cantidad de sólidos sedimentables pueden influenciar en el nivel de pH del medio, es decir, que cuando se tiene mayor cantidad de sólidos sedimentables se acidifica el medio, esto concuerda con los resultados presentados en este estudio, como se observa en la tabla 2 y 3 donde se evalúa la concentración de pH y sedimentación, respectivamente. En T3 donde se muestra un valor de 14,2 mL/L de sólidos sedimentables a los 30 min, con un valor de pH ligeramente alcalino, por otro lado, estos resultados son similares a los obtenidos por Ibarra et al.3, donde obtiene valores de pH entre 8,01 a 8,26 para el control y de 7,37 a 7,49 para los tratamientos con biofloc en los diferentes niveles de proteína. Por otro parte, Quinteros et al.20, al medir la concentración de pH, se encontraron diferencias estadísticas entre la mañana y la tarde, siendo los tratamientos con biofloc más alcalinos en comparación con el tratamiento sin biofloc. Estos resultados son similares a los obtenidos en este estudio, donde en la mañana existió diferencia significativa entre T1y T4, mientras que en la tarde no hubo diferencias entre los tratamientos.
Al analizar la tabla 3 se observa que T4 presenta menor cantidad de sólidos sedimentables y el pH de mayor alcalinidad en comparación con todos los tratamientos, lo que coincide con Malpartida 22, significando que a menor concentración de sólidos suspendidos el pH es más alcalino, lo que puede estar influenciado porque la taza de suministro de oxígeno es óptima como menciona Harun et al.23, y produce que los flóculos suspendidos se disgreguen adecuadamente, disminuyendo la concentración de sólidos sedimentables; además, concluye que el aerotubo proporciona un mejor movimiento y circulación del agua lo que ayudando a la formación de sedimento, lo que explicaría porque T3 es el tratamiento con mayor sedimentación.
En cuanto a registros de la supervivencia, no mostraron diferencias significativas entre los tratamientos, estos resultados son similares a los obtenidos por Ibarra et al.3 y Quinteros et al. 20, Xu y Pan 24.
Conclusiones
Los tratamientos con tubería PVC (T1 y T4) fueron los que mejor se comportaron en cuanto a la ganancia de peso y concentración de OD en la mañana, sin importar el porcentaje de proteína bruta suministrada, pero en la tarde, el tratamiento T4 es el que menor concentración de OD registra, aunque se encuentra dentro de los intervalos aceptables.
Los niveles de proteína repercuten en la sedimentación y el pH. T3 y T1 presentan los valores más altos de sedimentación con alimento balanceado de 28% de PB. En cuanto a los parámetros, en la tarde, el oxígeno disuelto está influenciado por las variables peso, talla, alimentación y el factor tratamiento. En la mañana repercute solo el peso; esto es muy similar a las variables NO2 y NH4 que influencian significativamente en el TAN, pero al analizar este, se encontró que no existen diferencias significativas entre los tratamientos; además, se comprobó que el TAN no influye en los niveles de OD.