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1. Introducción
Por años, los cultivos in vitro de células vegetales en suspensión han sido considerados como una opción para la producción de sustancias de interés para las industrias química, farmacéutica, cosmética y de alimentos [1,2]. Debido a que las plantas son una fábrica natural de moléculas de alto valor, los cultivos de células vegetales inicialmente se perfilaron como una plataforma promisoria para producción a gran escala de metabolitos secundarios. Sin embargo, y pese a que se han logrado establecer con éxito algunos procesos industriales, problemas asociados principalmente a los bajos rendimientos en la producción de los metabolitos han limitado el uso de esta tecnología [3].
Las técnicas modernas de la biología molecular permiten la inserción foránea de genes que codifican para enzimas involucradas en la síntesis de metabolitos de interés. El uso de estos cultivos transformados puede eventualmente contribuir a aumentar los rendimientos en la producción de los metabolitos [4,5], pero el desconocimiento de la mayoría de las rutas metabólicas en las plantas restringe la implementación de esta estrategia [6].
Un enfoque más reciente contempla el uso de sistemas vegetales para la producción de proteínas recombinantes de aplicación industrial [7-9]. Bajo esta nueva perspectiva, en la que confluyen desarrollos alcanzados con las técnicas del ADN recombinante, el cultivo in vitro de tejidos vegetales, los métodos tradicionales de la agricultura y las fermentaciones industriales, se utilizan plantas o cultivos vegetales in vitro (células o tejidos) genéticamente modificados para expresar proteínas de alto valor agregado, especialmente aquellas que tienen aplicación terapéutica.
Actualmente, la mayoría de estas proteínas utilizadas como medicamentos biológicos son sintetizadas utilizando hospederos microbianos y células de mamífero [10]. Sin embargo, las plantas se han propuesto como alternativa de expresión debido a la capacidad que tienen de introducir patrones de plegamiento y modificaciones postraduccionales que los sistemas bacterianos son incapaces de proporcionar, los bajos costos de producción en comparación con las células de mamífero, y las garantías de bioseguridad que ofrecen al no ser blanco de contaminación con patógenos humanos [7-9,11-13].
Los cultivos de células vegetales en suspensión reúnen los beneficios que ofrecen los sistemas vegetales para la expresión de proteínas terapéuticas con aquellos proporcionados por las fermentaciones industriales. La posibilidad de utilizar biorreactores hace más simple el escalado de los procesos al permitir la manipulación de variables que garantizan la consistencia del producto y facilitar las etapas de separación y purificación. Adicionalmente, con el manejo de células en suspensión se eliminan los problemas asociados a la propiedad de tierras y las regulaciones que restringen el cultivo a campo abierto de plantas transgénicas [14-16]. Lo anterior ha propiciado la exploración de diferentes especies vegetales como plataforma de producción. Cultivos de células en suspensión de tabaco, arroz y maíz se han establecido para la expresión de anticuerpos, hormonas y enzimas terapéuticas [17-22]. Un sistema de producción basado en el cultivo de células de zanahoria consiguió en los últimos años alcanzar fases de comercialización, con la apertura de varias plantas de producción [23].
Los cultivos de papa (Solanum tuberosum L.) han sido ampliamente estudiados a nivel in vitro. La importancia agronómica de esta planta ha hecho que se haya acumulado gran cantidad de información sobre las técnicas de cultivo in vitro y de manipulación genética. Se ha reportado el crecimiento de las células en suspensión en diferentes medios y con composiciones hormonales que varían significativamente de una investigación a otra [24-26]. Además, se han desarrollado numerosos estudios de transformación para el mejoramiento genético de variedades silvestres, por lo que estos métodos son bien conocidos. De la misma forma, diferentes investigaciones reportan el uso de plantas de papa para la expresión de proteínas terapéuticas [20,27-30].
El objetivo del presente trabajo fue explorar el potencial del cultivo de células en suspensión de papa como plataforma de producción de proteínas recombinantes. Para tal fin, utilizamos la variedad androestéril Pastusa suprema y la proteína Cry 1Ac de Bacillus thuringiensis como proteína modelo. Se presenta una metodología rápida y sencilla para el establecimiento de las suspensiones a partir de las plantas transformadas y las cinéticas de crecimiento de biomasa y producción de la proteína bajo diferentes concentraciones de nitrato y amonio en el medio de cultivo.
2. Materiales y métodos
2.1. Material vegetal transformado
Se utilizaron plantas in vitro de papa (Solanum tuberosum subsp. andígena var. Pastusa suprema) transformadas con el gen cry 1Ac de B. thuringiensis. La información sobre los métodos, vectores de transformación y rutinas de mantenimiento y subcultivo utilizados para obtener y conservar las plantas transgénicas se presenta en un trabajo previo [31].
2.2. Inducción de callos y establecimiento de suspensiones
Se utilizaron segmentos jóvenes de nudos, entrenudos y hojas como explantes para la inducción de callos. Los explantes se cultivaron en medio Murashige and Skoog (MS) [32] 30 g L-1 de sacarosa, 2,0 g L-1 de fitagel, pH 5.8, suplementado con diferentes concentraciones hormonales de 2,4-D y quinetina. Los explantes se conservaron a 21 oC y en completa oscuridad durante 24 días. Después de este tiempo se registraron los porcentajes de formación de callo, organogénesis y fenolización. El tipo de explante y la concentración hormonal se consideraron como factores experimentales. Para cada uno de los tratamientos se sembraron 10 explantes en el medio de cultivo, y todos los tratamientos se corrieron por triplicado.
Para el establecimiento de las suspensiones celulares se transfirieron los explantes con mayor porcentaje de inducción de callos a matraces de 100 mL que contenían 20 mL de medio MS líquido con la misma composición utilizada en la etapa anterior. Los cultivos se mantuvieron a una velocidad de agitación de 110 rpm, a 19ºC y con tapón de papel aluminio. Luego de 7 días, una vez se observó suficiente crecimiento de células en forma de suspensión, los explantes se retiraron de los cultivos manualmente. Las suspensiones se subcultivaron en medio fresco cada 14 días hasta establecer cultivos en matraces de 100 y 200 mL.
2.3. Cinética de crecimiento y viabilidad celular
Para la determinación de las curvas de crecimiento de la biomasa se inocularon matraces de 100 mL con aproximadamente 0.2 g L-1 de biomasa seca, utilizando una suspensión madre de concentración conocida y en fase de crecimiento exponencial. Las condiciones de cultivo de las suspensiones se mantuvieron como se describieron anteriormente. El crecimiento celular se determinó registrando el peso seco cada 2 días durante 20 días. Para esto, se filtró el contenido de cada matraz utilizando papel filtro con tamaño de poro de 12-15 µm. La biomasa fresca se lavó tres veces con agua destilada y se secó a 60°C durante 48 h. El experimento se realizó por triplicado. Se calcularon la tasa máxima de crecimiento específico (µmax) y el índice de crecimiento (IC) de acuerdo con las ecuaciones 1 y 2:
(1)
(2)
En donde X es la concentración de biomasa (g L-1) para un tiempo t de cultivo en días (d), Xf y Xi son las concentraciones de biomasa en los días 20 y 0, y 
es la velocidad de crecimiento de la biomasa durante la fase de crecimiento exponencial (g L-1 d-1).
Para la determinación de la viabilidad celular se utilizó una adaptación del método de reducción del MTT [33]. Se tomaron entre 60 y 80 mg de biomasa fresca y se incubaron en tubos eppendorf durante cuatro horas con 500 µL de una solución de 5 mg L-1 de MTT. Los cristales de formazán se disolvieron agregando 750 µL de isopranol ácido (0,1 % HCL, 10 % Tween 20). Luego de 30 minutos, las muestras se centrifugaron a 5000 rpm durante 10 minutos. Se tomaron 300 µL y se transfirieron a micropozos de cultivo para registrar la absorbancia a 590 nm. La actividad metabólica se registró como la absorbancia específica obtenida para cada uno de los días de muestreo (Unidades de absorbancia/g de peso fresco).
2.4. Cinética de producción de la proteína recombinante Cry 1Ac
El perfil de producción de la proteína Cry 1Ac a lo largo del cultivo se determinó mediante inmunoensayo de ELISA, utilizando el kit comercial Bt-Cry 1Ab/1Ac® (PSP 06200, Agdia, Elkhart, IN, EEUU). Para la extracción de la proteína se tomaron 200 mg de biomasa fresca y se trataron con 200 µL del buffer de extracción proporcionado por el kit. Luego de una etapa de maceración mecánica, las muestras se llevaron a centrifugación por 10 minutos a 5000 rpm. Se siguieron las instrucciones del fabricante y finalmente se registraron las absorbancias a 650 nm, utilizando un lector de microplacas de ELISA (Bio-rad modelo 680, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EEUU). Se utilizó el control positivo suministrado por el fabricante, y como controles negativos se utilizaron plantas y callos de S. tuberosum no transformados. Se consideraron valores positivos aquellos que registraron absorbancias superiores a 0.100.
2.5. Efecto de la concentración de nitrato y amonio sobre el crecimiento celular y la producción de la proteína Cry 1 Ac
Se inocularon 0.2 g L-1 de células en 5 medios de cultivo a los que se les modificó la concentración de KNO3 y NH4NO3 con relación a la concentración en el medio MS original (18.8 mM y 20.6 mM, respectivamente). Se formularon medios con las siguientes relaciones de nitrato y amonio (NO3 -: NH4 +): MS1 (0: 39.4); MS2 (9.4:10.3); MS3 (9.8:29.5); MS4 (29.5:9.85); MS5 (37.6:41.2); MS6 (39.4:0). Se analizó el crecimiento de la biomasa y la producción de la proteína Cry 1Ac a los 20 días de cultivo mediante los métodos descritos anteriormente.
2.6. Análisis estadístico
Para el tratamiento estadístico de los datos se utilizó el programa SPSS. Se realizaron pruebas de análisis de varianza (ANOVA) para determinar si existían diferencias significativas entre las medias de los datos. Para la comparación de medias se utilizaron pruebas de Tukey con 5% de nivel de significancia. Las pruebas de normalidad y homocedasticidad se realizaron utilizando los estadísticos de Shapiro Wilk y Levene, respectivamente.
3. Resultados y discusión
3.1. Inducción de callos
En resultados previos se determinó que la adición de quinetina no tenía efectos favorables sobre la proliferación celular, y que la inducción de callos se favorecía únicamente con la adición de 2,4-D en el medio de cultivo (resultados no mostrados). El tratamiento consistente en entrenudos cultivados con 2.0 mg L-1 de 2,4-D presentó la mejor combinación en términos de porcentajes de formación de callo (90 %), fenolización (0 %) y organogénesis (6.6 %) (Tabla 1, Fig. 1 B), por lo que se utilizó posteriormente para establecer las suspensiones celulares.
Los mayores porcentajes de formación de callo se obtuvieron cuando se utilizaron nudos y entrenudos como explante. Sin embargo, los callos obtenidos con los nudos presentaron mayor grado de fenolización (Tabla 1). En general, para el establecimiento de suspensiones vegetales son deseables callos friables compuestos por células desdiferenciadas en activo crecimiento y con alta viabilidad. La composición hormonal y el tipo de explante utilizado determinan la cantidad, el tipo y la calidad de callo obtenido. Callos con elevado grado de fenolización dificultan el establecimiento de las suspensiones celulares porque inhiben el crecimiento celular. Así mismo, callos que contienen células embriogénicas o diferenciadas no son deseables para estos propósitos.
Los resultados obtenidos en este estudio coinciden con los de otros autores que también reportan las mayores eficiencias en la inducción de callo para diferentes variedades de S. tuberosum cuando se utilizan entrenudos como explante y 2,4-D como fuente hormonal [34], y que en general observan una respuesta pobre de las hojas en la promoción de la callogénesis [35] en comparación con la obtenida cuando se utilizan otros tipos de explante, como por ejemplo nudos [36]. Así mismo, se ha observado que las hojas tienden a formar callos que entran en organogésis luego de un periodo de cultivo en 2,4-D [37], tal como se obtuvo en este estudio (Tabla 1. Fig. 1.E).
Tabla 1 Efecto del tipo de explante y concentración de 2,4-D sobre la formación de callo, la fenolización y la organogénesis en cultivos de S. tuberosum.
Fuente: Los autores.
Fuente: Los autores.
Figura 1 Formación de callos en diferentes tipos de explantes y concentraciones hormonales de 2,4-D. Nudo + 2.5 mg L-1 2,4-D (A). Entrenudo + 2.0 mg L-1 2,4-D (B). Nudo + 3.5mg L-1 2,4-D (C). Hoja + 3.5 mg L-1 2,4-D (D). Hoja + 2.0 mg L-1 2,4-D (E). Todos los explantes se cultivaron en medio MS durante 24 días.
3.2. Establecimiento de suspensiones celulares
A pesar de que es una práctica común raspar los explantes para separar las células y transferirlas a medios de cultivo frescos para obtener grandes cantidades de callo que luego son cultivados en medio líquido [38], en este caso encontramos que es posible establecer las suspensiones sin pasar por una etapa de raspado. Debido a la friabilidad de los callos obtenidos, las células se liberan fácilmente al medio por la agitación del cultivo, lo que permite obtener células que, al no someterse al estrés mecánico asociado al raspado, poseen elevados niveles de viabilidad y división celular. La aplicación de esta estrategia permite reducir los tiempos y recursos necesarios para la obtención de los cultivos celulares.
3.3. Cinética de crecimiento y viabilidad celular
Como se muestra en la Fig. 2, las suspensiones presentaron una etapa de crecimiento exponencial que se extiende desde el inicio del cultivo hasta el día 10, seguida de una fase estacionaria hasta el día 20, en la que la biomasa permanece aproximadamente constante. La curva de crecimiento de la biomasa sugiere que las células consumen los nutrientes presentes en el medio y lo utilizan para la división, síntesis y mantenimiento de estructuras celulares. Aunque la presencia de fases de adaptación y de muerte celular son comunes en los cultivos de células vegetales [39], existen casos en los que éstas pueden estar ausentes. En ese caso, este comportamiento probablemente está asociado al estado fisiológico del inóculo, que provenía de una suspensión madre en fase de crecimiento exponencial. En este estado, las células están en su capacidad máxima de crecimiento, adaptándose fácilmente a las condiciones que impone el cambio a un medio de cultivo fresco más rico en nutrientes.
Fuente: Los autores.
Figura 2 Perfil de crecimiento de biomasa para cultivos transformados de S. tuberosum en suspensión
La evolución de la viabilidad celular obtenida por la reducción del MTT (Fig. 2) es consistente con el perfil de crecimiento. Se observa un aumento en la actividad metabólica desde el inicio del cultivo hasta el día 8. En el día 10, que coincide con la finalización de la fase de crecimiento exponencial, la actividad metabólica disminuye para luego estabilizarse hasta el último día de cultivo, un comportamiento estacionario similar al de la curva de crecimiento. La reducción del MTT tiene lugar en la mitocondria e involucra una oxidorreductasa dependiente de NADP(H) importante en la generación de ATP, por lo que es un buen estimador de la actividad y el estado metabólico de los cultivos [40,41].
Los parámetros µ max e IC calculados para las suspensiones fueron de 0.12 d-1 y 4.76, respectivamente. En la Tabla 2 se comparan estos parámetros con los reportados para el cultivo de células en suspensión de otras especies vegetales utilizadas tradicionalmente para la expresión de proteínas terapéuticas o metabolitos secundarios. Se observa que las suspensiones de S, tuberosum alcanzan, bajo las condiciones de cultivo empleadas en este estudio, velocidades máximas específicas e índices crecimiento comparables a los de plataformas modelo más estudiadas.
3.3. Producción de la proteína Cry 1Ac
La Fig. 3 muestra la evolución de la expresión de la proteína Cry 1Ac durante el tiempo de cultivo. Las absorbancias específicas obtenidas con el ensayo ELISA para las suspensiones en los días 6 y 12 (1,29 y 1,34 Uabs/g biomasa seca, respectivamente) fueron comparables a las obtenidas para la proteína pura proporcionada por el Kit (1,47 Uabs/g biomasa seca) (datos no mostrados), lo que sugiere una buena capacidad del sistema para expresar la proteína. La concentración de la proteína aumenta desde el día 0 hasta alcanzar su valor máximo en el día 12, tiempo después del cual se observa una disminución en la producción.
En términos generales, los niveles de expresión de proteínas heterólogas dependen de diversos factores, como lo son el tipo de promotor utilizado en el vector de transformación, el sitio y número de veces en el que se inserta la secuencia foránea en el genoma del hospedero, las condiciones de cultivo, entre otros [14]. Los resultados del ensayo ELISA comprueban que bajo las condiciones en las que se realizó este estudio, las células no pierden la capacidad de expresión de la proteína al pasar del estado de diferenciación en las plantas al estado desdiferenciado propio de las células en suspensión. Este fenómeno es recurrente en cultivos celulares que se utilizan para la expresión de metabolitos secundarios, en los que se requiere la presencia de tejidos especializados para la síntesis de determinados metabolitos [45].
Tabla 2 Tasas de crecimiento específico máxima reportadas para cultivos en suspensión de diferentes especies vegetales de importancia farmacéutica.
Fuente: Los autores
3.4. Efecto de la concentración de nitrato y amonio sobre el crecimiento celular y la producción de la proteína Cry 1 Ac
Los medios MS1, MS4 y M5 mostraron efectos significativos sobre la producción de la biomasa con relación al medio MS (Fig. 4). La concentración total de nitrógeno aportada por el KNO3 y el NH4NO3 en los medios MS1 y MS4 es la misma que en el MS (39.4 mM), mientras que en el medio M5 es del doble (78.8 Mm). Para el medio MS1 se registró una reducción del 43% en la producción de biomasa, en tanto que para los medios MS4 y MS5 se registraron aumentos del 66 y el 193%, respectivamente. La reducción en el crecimiento celular obtenido en el medio MS1 es el resultado de la ausencia de nitrato en este medio. Otros autores han reportado reducciones en la capacidad de crecimiento cuando se cultivan células en medios que no contienen este ion y en los que la única fuente de nitrógeno es el amonio [46-48].
No sólo la presencia de nitrato en el medio de cultivo es un factor importante para promover el crecimiento celular, sino que el suministro de concentraciones crecientes de este ion también puede provocar aumentos considerables de la biomasa. En los medios MS4 y MS5 las concentraciones de nitrato son 1.6 y 2.0 veces mayores que en la del MS, lo que explica los incrementos sustanciales en la biomasa en estos medios. Particularmente, el medio MS5 fue el medio en el que se obtuvo el mayor aumento en el crecimiento de la biomasa. El IC calculado para este medio fue de 17.6, en comparación con el obtenido para el MS, que presentó un IC de 4.76.
Los pesos de la biomasa seca obtenidos para los medios MS2, MS3 y MS6 no difieren estadísticamente de los del MS, pero sí de los obtenidos con el MS4 y el MS5, los cuales presentaron concentraciones mayores de biomasa (Fig. 4). Estos dos últimos medios contienen concentraciones mayores de NO3 -, lo que refuerza la hipótesis del efecto favorable de la adición de KNO3 a los medios de cultivo.
Fuente: Los autores.
Figura 4 Comparación del peso seco obtenido en 6 medios de cultivo con distintas concentraciones y relaciones (NO3 -:NH4 +): MS (20.6:18.8), MS1 (0:39.4), MS2 (9.4:10.3), MS3 (9.8:29.5), MS4 (29.5:9.85), MS5 (37.6:41.2) y MS6 (39.4:0). Las medidas corresponden a la biomasa en el día 20 de cultivo. Barras con letras distintas indican diferencias significativas entre las medias de los datos (p<0.05).
En resultados similares, Holland y colaboradores reportan aumentos en la concentración de biomasa en cultivos celulares transformados de tabaco al suplementar el medio MS con HNO3 [20], mientras que Zhang y colaboradores reportan aumentos en la biomasa al cultivar células de Panax notoginseng en medios con concentraciones crecientes de KNO3 [46].
Con relación al efecto de la concentración de la fuente de nitrógeno sobre los niveles de expresión de la proteína Cry1Ac, la Fig. 5 muestra que ninguno de los medios probado contribuyó al aumento de la producción de la proteína, al menos en el día 20 de cultivo. La cinética de producción presentada en la Fig. 3 muestra fluctuaciones en la expresión de la proteína a lo largo del cultivo, por lo que es posible que en días anteriores al día 20 se hayan presentado concentraciones mayores en algunos de los medios ensayados. Son necesarios perfiles de expresión completos o muestreos en días intermedios para establecer con mayor certeza si los medios empleados tienen o no efectos favorables sobre los niveles de producción en comparación al MS.
Concentraciones mayores de nitrógeno en el medio de cultivo suponen una mayor disponibilidad de sustrato para la síntesis de aminoácidos y otras moléculas importantes en la biosíntesis de proteínas, razón por la cual, el enriquecimiento de los medios con fuentes adicionales de nitrógeno ha probado ser una estrategia exitosa para aumentar los rendimientos en la producción de proteínas recombinantes en plantas y células vegetales [20,39]. Sin embargo, la respuesta a las diferentes condiciones de nitrato y otras fuentes de nitrógenos está regulada a nivel genético [36,51], por lo que éstas dependerán del hospedero utilizado, la naturaleza de la proteína heteróloga, el constructo utilizado y los eventos particulares de transcripción. En nuestro caso, en todos los medios ensayados se presentaron menores niveles de expresión en comparación con el medio MS en el día 20 de cultivo. La confirmación de la capacidad de las suspensiones aquí estudiadas para expresar la proteína recombinante abre la posibilidad para probar diferentes estrategias para la optimización de la expresión.
Fuente: Los autores.
Figura 5 Comparación de la expresión de la proteína recombinante Cry 1Ac en 6 medios de cultivo con distintas concentraciones y radios (NO3-: NH4+): MS (20.6:18.8), MS1 (0:39.4), MS2 (9.4:10.3), MS3 (9.8:29.5). MS4 (29.5:9.85), MS5 (37.6:41.2) y MS6 (39.4:0). Las medidas corresponden a la expresión de la proteína el día 20 de cultivo. Barras con letras distintas indican diferencias significativas entre las medias de los datos (p<0.05).
4. Conclusiones
En este trabajo se propone el uso de cultivos in vitro de células en suspensión de papa (S. tuberosum) como plataforma de expresión de proteínas recombinantes. Los resultados obtenidos indican que el tratamiento más efectivo para la inducción de callos fue aquél en el que se utilizaron
entrenudos cultivados en medio MS suplementado con 2.0 mg L-1 de 2,4-D. Con esta combinación se obtuvieron los mayores porcentajes de formación de callo friable (90%) y los menores niveles de organogénesis (0%) y fenolización (10%). Para el establecimiento de las suspensiones celulares se encontró que la supresión de la etapa del raspado de los callos es una buena estrategia para aumentar la eficiencia del proceso de obtención de los cultivos. Con el protocolo que se propone es posible obtener suspensiones en aproximadamente 40 días.
La cinética de crecimiento mostró una tasa máxima de crecimiento específico de 0.12 d-1, con una concentración máxima de biomasa de 1.41 g L-1 al final de la fase exponencial. Con la suplementación de nitrógeno, en especial con la adición de KNO3, fue posible aumentar la producción de biomasa hasta en un 193%.
Finalmente, la expresión de la proteína Cry 1 Ac se mantuvo a lo largo del tiempo de cultivo, demostrando que el sistema es capaz de expresar proteínas heterólogas. Los resultados anteriores constituyen los primeros pasos en la exploración de este sistema biológico como instrumento para la producción de proteínas recombinantes de interés industrial.
