Obtenção dos botões florais

Os botões florais foram obtidos em supermercado da rede varejista de São Luís, iden tificados como (Syzygium aromaticum) e levados ao laboratório de Físico-Química de Alimentos do Pavilhão Tecnológico da Universidade Federal do Maranhão (UFMA), para extração do óleo essencial.

Extração do óleo essencial

Para a extração do óleo essencial do Syzygium aromaticum, 68,79 g desses botões florais foram triturados em um moinho elétrico de facas da marca Tecnal-modelo TE340.

Após esse procedimento, o material foi transferido para um balão de fundo redondo com capacidade de 1000 mL, onde efetuou-se a adição de 200 mL de água destilada e o acoplamento ao extrator de Clevenger.

Em seguida ligava-se a manta elétrica e mantinha-se a temperatura em 100 °C. Após 4 horas, encerrava-se a destilação recolhendo-se o óleo essencial. O óleo foi seco por meio de percolação em sulfato de sódio anidro (Na₂SO₄). Essas operações foram realizadas em triplicatas e as amostras armazenadas em ampolas de vidro âmbar sob refrigeração para evitar possíveis perdas de constituintes voláteis. Posteriormente esses óleos foram submetidos às análises.

O rendimento do óleo essencial foi expresso em porcentagem na relação massa/volume pela medida da densidade, observando o volume (mL) de óleo essencial obtido após a extração do óleo por massa (g) de material vegetal, conforme descrito pela Farmaco peia Brasileira ^[8] e Fabrowski ^[9].

Análise físico-química do óleo essencial

As propriedades físico-químicas do óleo essencial determinadas foram: densidade, solubilidade em etanol a 70% v/v, índice de refração, cor e aparência.

Análise química do óleo essencial

Para as análises químicas, utilizou-se a técnica cromatografia em fase gasosa acoplada ao espectrómetro de massas por impacto de elétrons e analisador íon trap (CG-EM-IE -Ion trap). O equipamento utilizado foi da marca Varian 2100, utilizando hélio como gás de arraste com fluxo na coluna de 1mL min^-1; temperatura do injetor de 280 °C, split 1:10; coluna capilar (15 m x 0,25 mm) com fase estacionária VF-1ms (100 % metilsiloxano 0,25 µm) e programação de temperatura do forno de 40 °C a 240 °C com taxa de aquecimento de 8° C min^-1. No Espectrómetro de Massas, as temperaturas do mainfold, ion trap e da linha de transferência foi de 280 °C. Foram injetadas alíquotas de 0,3 µL (injetor automático CP-8410) das amostras diluídas na proporção de 1mg da amostra em 1000 µL de diclorometano.

A determinação da concentração do eugenol e dos demais componentes do óleo essen cial por esse método foi obtida através da integração eletrónica das áreas dos picos cromatográficos, utilizando o programa AMDIS (Automated Mass Spectral Deconvolution Mass & Identification System): Programa utilizado para a interpretação dos espectros de massas quando havia diferenças significativas entre o espectro de massas obtido e o encontrado na biblioteca do CG/EM.

Bioensaio do óleo essencial frente a Artemia salina

A metodologia utilizada para os ensaios de citotoxicidade utilizando Artemia salina foi baseada em Meyer et al. ^{[ 10]} e em Nascimento et al. ^{[ 11]}.

Em um recipiente retangular, com uma divisória contendo furos de aproximadamente 0,02 cm de espessura espaçada por 0,5 cm e distribuídos uniformemente, foram adi cionados (60 g de sal marinho/ 1 L de água destilada) de solução salina artificial. O recipiente foi colocado dentro de uma incubadora iluminada por uma lâmpada fluo rescente, com aeração (figura 1). Em um dos lados desse recipiente, adicionou-se cerca e 64 mg de cistos de Artemia salina, tomando-se o cuidado para que os mesmos não ultrapassassem a divisória. A parte do sistema contendo os cistos de Artemia salina foi coberta com papel alumínio, para que os organismos ao nascerem, fossem atraídos pela luz do outro lado do sistema, forçando-os a atravessar à divisória. Tal procedimento visa uma homogeneização das condições físicas dos organismos-teste. A incubação foi feita por um período de 48 horas. Durante todo o ensaio a temperatura foi monitorada.

Figura 1 Esquema do bioensaio de citotoxicidade em Artemia salina. 

Após o período de incubação, os organismos-testes (náuplios de Artemia salina) foram expostos ao óleo essencial do cravo-da-índia por 24 horas, utilizando-se tubos de ensaio graduados, cada um contendo 10 náuplios de Artemia salina, previamente seleciona dos. Os testes foram feitos em triplicata para cada concentração de cada composto. Além disso, o óleo foi testado, no mínimo, três vezes, totalizando um mínimo de 9 ensaios por concentração do composto. Determinou-se a faixa de concentração a ser testada (correspondente à concentração de 1000, 100, 10 μg/mL), buscando sempre a maior concentração em que se observasse 0% de mortalidade e a menor concentração em que se deflagrasse 100 % de mortalidade, de modo a obter a DL₅₀; 24 h (dosagem letal para 50 % da população em 24 h) do composto testado. As soluções dos com postos a serem testadas foram preparadas em 1 a 3 % de DMSO (dimetilsulfóxido) e avolumadas com solução salina. Os testes para o controle também foram realizados em triplicata, utilizando-se uma solução de DMSO 1 a 3 % diluído em solução salina. Os controles foram utilizados também para se ter certeza de que a mortalidade obser vada nos náuplios de Artemia salina fosse resultante da toxicidade aos compostos e não devido à falta de alimentação ^[12].

Após 24 horas de exposição, foi feita a contagem de náuplios vivos e mortos, sendo con siderados vivos todos aqueles que apresentassem qualquer tipo de movimento quando observados próximos a uma fonte luminosa por 10 segundos. Só foram considerados válidos os testes nos quais o controle apresentou uma mortalidade igual ou inferior a 10 % da população. Os resultados foram submetidos a tratamento estatístico utilizando a regressão linear, o qual forneceu os valores de DL₅₀; 24 h.

Características físico-químicas

A qualidade dos óleos essenciais depende de vários parâmetros tais como índice de refração, solubilidade em diferentes solventes orgânicos, densidade, dentre outros, os quais são utilizados para a avaliação da qualidade da matéria prima vegetal, além do controle da identidade e da pureza do óleo. Segundo Mouchrek Filho ^[13] o tempo de extração do óleo essencial é um dos principais parâmetros físico-químicos da indústria de essências, no que se refere à qualidade e à natureza económica. Por isso, uma desti lação rápida pode conduzir a um produto contendo predominantemente constituintes mais voláteis, porém destituído das melhores características; ao contrário, uma extra ção prolongada encarece o produto e também pode sobrecarregá-lo de compostos de aromas indesejáveis ^[14].

Os resultados referentes aos parâmetros físico-químicos do óleo essencial do cravo-da-índia estão representados na tabela 1.

Tabela 1 Parametros fisico-quimicos do oleo essencial do Syzygium aromaticum (cravo-da-india). 

Os resultados mostraram valores de 1,526 e 0,973 g mL^-1 para o índice de refração e densidade do óleo essencial do cravo-da-índia respectivamente. No que se refere à solubilidade em etanol 90 %, o resultado demonstrou que o óleo essencial foi solúvel na proporção 1:2. A cor e aparência apresentada pelo óleo analisado foram consideradas sendo típica, ou seja, transparente e límpido como foi mostrado na tabela 1, afirmando que o óleo essencial estudado possui uma cinética de extração e qualidade muito eficaz, quando comparado a outros óleos, principalmente em relação à quantidade de óleo extraído (volume) e tempo de extração.

Reis ^[15] investigando os óleos essenciais extraídos dos talos e frutos secos do cra-vo-da-índia, relatou um índice de refração 1,5230 e 1,5252 respectivamente, valores semelhante ao encontrado nesta pesquisa. Valores esses, próximos ao índice de refração descrito para o eugenol, que é de 1,5410 ^[16]. A proximidade entre os valores do índice de refração descrito para o eugenol com os valores encontrados para os óleos essenciais dos talos e dos frutos evidenciam que o óleo em estudo é realmente rico em eugenol.

O rendimento da extração pode ser calculado a partir da quantidade de óleo que se obteve com uma determinada massa vegetal. Como nesse experimento, partiu-se de uma massa de 68,79 g dos botões florais secos e moídos do cravo-da-índia e obtiveram-se em média 2,5 mL de óleo essencial em cada extração o rendimento m/v foi de 3,63 %, um bom rendimento. Como a densidade do óleo foi determinada em 0,973 g.mL^-1, rendimento m/m foi calculado em 3,54 %.

Segundo Ozcan e Chalchat ^[17] o rendimento do óleo essencial de diferentes varie dades de plantas é dependente da variação sazonal e da localidade. Sendo assim, de acordo com Reis ^[15] que apresenta rendimentos de massa/volume do óleo essen cial dos talos e frutos secos do cravo-da-índia em torno de 15 %, o baixo rendimento quando comparado ao estudo acima do óleo essencial dos botões do cravo pode ser atribuído ao fato do período da coleta das amostras e estocagem, ou seja, do clima com altas temperaturas que podem ter favorecido a evaporação parcial de alguns consti tuintes do óleo.

Caracterização química (análise por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas)

Por meio da cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas foi possível separar e identificar cinco constituintes do óleo essencial, os quais são apresentados na figura 2, seguindo a ordem de eluição.

Figura 2 Cromatograma do oleo essencial do cravo-da-india. 

A tabela 2 mostra a identificação de cada pico apresentados na figura 2, assim como o seu tempo de retenção (T_r) na coluna e o respectivo teor na mistura de óleos essen ciais, sendo que a quantificação dos cinco picos cromatográficos foi determinada pelo método de normalização (integração da área do pico correspondente). Nota-se que o eugenol apareceu com 52,53 %, e o cariofileno com 37,25 %, o que caracteriza serem estes os principais componentes majoritários.

Tabela 2 Composicao quimica do oleo essencial. 

Tr: tempo de retencao.

Bioensaio da citotoxicidade frente à Artemia salina

Os ensaios de letalidade permitem a avaliação da toxicidade geral e é considerado como um bioensaio preliminar no estudo do potencial biológico de um composto ou pro duto ^[10]. Atualmente, um dos ensaios mais empregado é o teste com larvas de Artemia salina e vem sendo reportado na literatura, não só para avaliar a toxicidade de substân cias, óleos, produtos e extratos vegetais, como também para determinar grau de conta minações ambientais ^[18].

O critério de classificação do óleo do Syzygium aromaticum (cravo-da-índia) frente Artemia salina com base nos valores das DL₅₀ foi estabelecido por Dolabella ^[19] como DL₅₀ < 80 μg/mL, o produto é altamente tóxico; DL₅₀ entre 80 a 250 μg/mL, o pro duto é moderadamente tóxico e DL₅₀ > 250 μg/mL, o produto é levemente tóxico ou atóxico. ^[10] utilizam o critério de avaliação em que considera a amostra tóxica ou ativa as que apresentarem DL₅₀ < 1000 µg/mL e amostras atóxicas ou inativas as que apresen tarem DL₅₀ > 1000 μg/mL. (Cálculos de DL₅₀).

A importância deste ensaio de toxicidade deve-se ao fato de que vários autores buscam correlacionar a toxicidade sobre Artemia salina com atividades anticancerígena, anti-fúngica, inseticida e tripanossomicida ^{[3,10,20,21,22]}.

Na tabela 3 e na figura 3 estão expostos os resultados obtidos para o bioensaio frente à Artemia salina para o óleo essencial do cravo-da-índia.

Tabela 3 Porcentagem de mortalidade por doses analisadas e valores de DL50 obtidos no bioensaio com Artemia salina para o oleo essencial do cravo-da-india (Syzygium aromaticum). 

*CNm: media do controle negativo.

Figura 3 (A) Regressão linear do percentual de animais mortos do óleo essencial do cravo-da-índia (DL₅₀); (B) Regressão linear do percentual de animais mortos do padrão de eugenol (DL₅₀). 

A dose letal a 50 % (DL₅₀) do óleo essencial do cravo-da-índia (Sygygium aromaticum) a partir do teste de toxicidade (a atividade larvicida frente à Artemia salina, avaliando o grau de letalidade pelo produto) foi igual a 1 μg/mL, considerado altamente tóxico de acordo com ^[19].

Na tabela 4 estão expostos os valores encontrados para o bioensaio frente à Artemia salina com o componente majoritário do óleo, o eugenol.

Tabela 4 Porcentagem de mortalidade por doses analisadas e valores de DL50 obtidos no bioensaio com Artemia salina para o padrao de eugenol. 

*CNm: media do controle negativo.

A dose letal a 50 % (DL₅₀) do padrão de eugenol a partir do teste de toxicidade (a ativi dade larvicida frente à Artemia salina, avaliando o grau de letalidade pelo produto) foi igual a 18,53 μg/mL, considerado altamente tóxico, ou seja ativo, de acordo com ^[19].

Comparando os resultados tanto do óleo quanto somente do seu componente majori tário, o eugenol, observa-se que ambos são ativos, ou seja, tóxicos frente aos testes com Artemia salina, mostrando eficiência na sua citotoxicidade. Pode-se observar também que o óleo é bem mais tóxico quando comparado ao padrão de eugenol, mostrado nos gráficos de regressão linear para mortalidade do microcrustáceo frente ao óleo testado.

A alta toxicidade do óleo do Cravo-da-índia frente à Artemia salina pode ser apontada pela presença do eugenol que é um forte agente bactericida, fungicida, antimicrobiano, anti-séptico e antialérgico, mas também pela mistura de outros componentes presentes nesse óleo, como por exemplo, o cariofileno e o copaeno que possuem um ótimo poder cicatrizante, diurético, antiinflamatório, aumentando assim o poder de toxicidade do óleo essencial.

Alguns estudos reafirmam o poder do sesquiterpeno cariofileno. Quando isolado do óleo essencial de Cordia verbenacea, este componente mostrou atividade antiinflamatória em diferentes modelos experimentais, utilizando-se nesse caso ratos ^[23]. Esta atividade do cariofileno também foi demonstrada no estudo da espécie Bupleurum fruticescens, cujo óleo essencial mostrou forte ação antiinflamatória atribuída aos seus dois principais constituintes, α-pineno e cariofileno. A ação farmacológica desses compos tos quando administrados juntos tornou-se similar à do óleo essencial completo de B. fruticescens ^{[ 24]}. A administração oral de cariofileno em ratos inibiu significativamente a colite ulcerativa experimental induzida por dextran sulfato de sódio, abrindo cami nho para a prevenção e o tratamento da colite ^[25].

Também ^[26] relatou que a administração oral do cariofileno em ratos inibiu signifi cantemente a irritação da mucosa gástrica. Além disto, o composto mostrou atividade antiinflamatória sem nenhuma indicação de causar danos à mucosa gástrica, típicos de agentes antiinflamatórios não esteroidais. O composto óxido de cariofileno, tam bém encontrado em alta proporção no óleo essencial de P. neochilus (15,54 %), é um reconhecido conservante de alimentos e cosméticos. Este sesquiterpeno mostrou ati vidade antifúngica em modelo experimental "in vitro" contra três espécies Trichophyton que causam infestações micóticas nos pés ^[27]. Vários constituintes de Eugenia caryophyllata foram isolados, identificados e tiveram sua bioatividade analisada. Dentre estes, óxido de cariofileno, cariofileno e α-humuleno mostraram-se potentes agentes anticarcinogênicos ^[28].

Logo, como teste de triagem, os ensaios com Artemia salina estão se destacando na "indicação de atividade antitumoral". A literatura vem trazendo correlações entre a toxicidade geral com esse microcrustáceo e a citotoxicidade diante de linhagens de células humanas de tumores sólidos ^[29].

Segundo Mclaughlin ^[29], o fato de se trabalhar com organismos relativamente sim ples torna mais fácil a indução de um retardo ou paralisação do ciclo celular normal por provocar alteração do processo mitótico, observou uma ótima correlação entre o teste de toxicidade frente Artemia salina e o teste de citotoxicidade, usando células 9 K (car cinoma humano de nasofaringe) e a partir desses resultados, utilizam o teste de Artemia salina como pré-clinico para testes de citotoxicidade com seis linhagens de células tumorais sólidas humanas. Estes autores observaram que a ED₅₀ (dose eficiente 50 %) nos testes de citotoxicidade é geralmente em torno de um décimo da DL50 encontrada no teste com esse microcrustáceo.