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INTRODUCCIÓN
Las plantas poseen una valiosa cantidad de componentes con propiedades cosméticas, por lo que los extractos u otros derivados de las plantas podrían ser prometedores para su uso en cosmetología. La calabaza pertenece al reino Planteae de la división Magnologiophyta, clase Magnolipsida, orden Cucurbitales, familia de las Cucurbitaceae y género Cucurbita. Esta familia comprende unas 850 especies de plantas, y protegidos por una corteza firme, con semillas elípticas, achatadas, blancas grisáceas, amarillentas o negruzcas, con un núcleo blanco, con sabor amigdalino en su extracto basal [1].
Los aceites vegetales son compuestos orgánicos que se obtienen a partir de semillas u otras partes de las plantas en cuyos tejidos se acumula como fuente de energía. Están formados básicamente por triglicéridos, diglicéridos, ácidos grasos (ácido esteárico, linoleico, oleico y linolénico) y otros constituyentes minoritarios como tocoferoles y esteroles [2]. Los ácidos grasos hidratan, suavizan, mejoran la flexibilidad de la piel, y además reparan la epidermis [3], por esta razón son ampliamente utilizados en cosmética y dermofarmacia. Cuando hay insuficiencia de ácidos grasos esenciales en el organismo, se observan síntomas de dermatitis como escamas y deshidratación de la piel, por lo que el suplemento de ácidos grasos a la misma puede curar o aliviar esos síntomas [4]. 160
Fitocosmético es el término que define al producto cosmético (de higiene o tocador) que incluye casi exclusivamente materias primas de origen vegetal (fitoingredientes) en su formulación con el objetivo de ejercer una acción determinada. De acuerdo con las convenciones actuales, podemos decir que los productos fitocosméticos incluyen a los denominados cosméticos naturales y a los cosméticos orgánicos [5].
Las semillas de zapallo descartadas como residuos vegetales contienen importantes cantidades de aceites vegetales; la recuperación de ellos es ahora una vía para la reutilización de diversos grupos de subproductos y en la última década el interés en alternativas de uso ha aumentado drásticamente. Se reporta que a nivel mundial el ingrediente con mayor demanda corresponde a los aceites vegetales, con el 88% de la participación del volumen total de importaciones mundiales, por tal motivo la producción de aceites vegetales de semillas presenta potencialidad de mercado para la industria cosmética mundial [6]. Además, la investigación de productos naturales es una temática cada vez de mayor interés mundial por sus posibilidades de aplicación en el mejoramiento de la calidad de vida. En este sentido, esta investigación tuvo como objetivo el desarrollo de fitocosmeticos usando aceite de semilla de Cucurbita spp, como principio activo y con características organolépticas y estabilidad aceptable.
METODOLOGÍA
Recolección y preparación de las muestras
Los frutos de la especie vegetal Cucurbita argyrosperma C. Huber (sin. Cucurbita mixta Pangalo) (figura 1), se recolectaron durante los meses de abril y mayo del 2018, dentro de la ciudad de Quitilipi, provincia del Chaco (Argentina). La localización por coordenadas para esta especie fue (sur) 26°52'19,2'' (oeste) 60°13'16,2''.
Método de extracción del aceite vegetal
La extracción del aceite de las semillas de Curcubita se realizó mediante un equipo tipo soxhlet (figura 2) de acuerdo con la norma AOAC [7]. Para ello, 10 g de semillas de calabaza molidas se extrajeron con 100 ml de n-hexano a 90 °C durante 6 h. Luego, el aceite fue concentrado en un rota evaporador (Buchi rotavapor R-114, Suiza*) y secado a 105 °C hasta obtener un peso constante.
Análisis fisicoquímicos
Índice de peróxido: se realizó por titulación yodométrica, según Anwar et al. [8].
Índice de yodo: se basó en la adición de halógenos a los dobles enlaces de los ácidos grasos insaturados [7].
Índice de saponificación: se hizo reaccionar una cierta cantidad de muestra de aceite con un exceso de solución de KOH 0,5 N y se determinó por diferencia los mg de KOH que reaccionan con la muestra, titulando con HCl 0,5 N [7].
Índice de refracción: se determinó con un refractómetro Abbe 2WAJ.
Viscosidad: se determinó con un viscosímetro de Ostwald.
Densidad del aceite: por picnometría [7].
Índice de acidez: se analizó de acuerdo con la norma UNE-55011 [9].
Cuantificación de ácidos grasos
Metilación y análisis de ácidos grasos: los aceites crudos (0,5 g) se trataron con 30 ml de solución de KOH 1 N en metanol a reflujo durante 45 min (saponificación). El material insaponificable se extrajo con n-hexano (3 x 20 ml). Seguidamente se llevó a cabo la esterificación de los ácidos grasos hidrolizados con 50 ml de solución de H2SO4 0,5 M en metanol, mediante reflujo durante 50 min. Los ésteres metílicos de los ácidos grasos se extrajeron con n-hexano (3 x 30 ml). La solución resultante se secó con Na2SO4 anhidro, se filtró y concentró en evaporador rotatorio. La mezcla de ésteres metílicos de ácidos grasos se analizó por Cromatografía gaseosa con detector de ionización de llama (GC-FID), se utilizó un equipo (Varian-3900®) con una columna factor Four VF-5 de 30 m de longitud, 0,32 mm diámetro interno y 0,25 fzm de espesor de fase; y gas portador nitrógeno con un flujo de 1 ml/min Relación de split: 15. Las condiciones cromatográficas fueron: temperatura del inyector y detector: 300 °C. Programa: temperatura inicial 180 °C (3 min), rampa: 3 °C/min hasta 200 °C (1 min), rampa: 12 °C/ min, temperatura final 280 °C (3 min). Vol. de inyección: µ [d.
Preparación de los productos cosméticos
Se propusieron dos formulaciones (F1 y F2 con el aceite de Cucurbita (5%) como fitoingrediente, cuya composición se indica en la tabla 1.
Tabla 1 Composición porcentual (p/p) de las formulaciones evaluadas.
| Función | Componente | F1 | F2 |
|---|---|---|---|
| Humectante | Aceite de cucurbita | 5 | 5 |
| Gelificante y emulgente | Sepigel 305® | 2 | - |
| Gelificante | Carbopol® 940 | 0,5 | - |
| Humectante y emulgente | Ceral PW | - | 10 |
| Humectante | Propilenglicol | 5 | 5 |
| Agentes conservantes | Metilparabeno | 0,18 | 0,18 |
| Propilparabeno | 0,02 | 0,02 | |
| Vehículo | Agua purificada | c.s. | c.s. |
| Agente neutralizante | Trietanolamina | c.s pH=6 |
c.s.: cantidad suficiente
Para F1 se añade la fase acuosa en pequeñas porciones sobre el Sepigel 305® agitando manualmente hasta la formación de un gel blanquecino opalescente. A continuación, se añade la fase oleosa en pequeñas porciones agitando mediante un agitador de hélice (Trevi Siemens®) para facilitar su emulsificación.
En F2 Por un lado se mezclaron los componentes acuosos y por otro lado los componentes oleosos. Se incorporó la fase acuosa a la fase oleosa agitando continuamente a 65 °C, cuidando que ambas se encuentren a la misma temperatura. Durante este proceso se debe aumentar la velocidad de agitación. A continuación, se retiró del baño caliente y se continuó mezclando a una velocidad inferior.
Caracterización de las formulaciones
De estos productos se valoraron las siguientes propiedades [10].
Propiedades organolépticas: (color, olor, aspecto) de acuerdo con cómo fueron percibidos por los sentidos.
Propiedades fisicoquímicas: (pH, conductividad) se dispersó una pequeña cantidad (1-2 g) en un vaso de precipitados conteniendo unos 30 ml de agua destilada, y se procedió a medir el pH y conductividad utilizando un pH-metro conductivimetro HANNA. Índice de acidez: se analizó de acuerdo con la norma UNE-55011 [9].
Determinación del signo de la emulsión: se emplea el método de la gota, se pesaron 1-2 g de emulsión y se sitúan mediante una varilla en un vaso de precipitados que contiene 30 ml de agua purificada. Si después de una ligera agitación la porción añadida se dispersa o difunde en el agua, la emulsión es de fase externa acuosa (O/A). Si la porción añadida no se dispersa ni se difunde en el agua, la emulsión es de fase externa oleosa (A/O).
Determinación de la extensibilidad: se puede definir como el incremento de superficie que experimenta una cierta cantidad de semisólido cuando se la somete a la acción de pesos crecientes, en intervalos fijos de tiempo. Se sitúa un portaobjetos, conteniendo 25 mg de muestra, encima de un papel milimetrado; sobre dicho portaobjetos se coloca otro suavemente y de peso conocido, se espera 1 min y se anota el diámetro del círculo formado. Se sigue el mismo procedimiento, siempre a intervalos de 1 min, utilizando una pesa de 2 g, dos pesas de 2 g y, finalmente dos pesas de 2 g y una pesa de 5 g. Con los diámetros obtenidos se calculan los radios y, con éstos, las superficies correspondientes.
Pruebas de estabilidad del producto
Estas pruebas nos indican la preservación de sus propiedades físicas y químicas a través del tiempo. Para ello se realizaron estudios de estrés térmico, de centrifugación y estabilidad acelerada [11].
Centrifugación: se centrifugaron 5 g de cada emulsión durante 20 min a 2000 rpm. Estrés térmico: que consiste en someter a las muestras a diferentes temperaturas por un período de 7 días; esto se logra tomando tres muestras, una se coloca a temperatura ambiente, otra a 4° C y la última en una estufa a 40 °C. Se determina, separación de las fases, diferencias en el peso.
Estabilidad acelerada: las muestras se almacenaron durante 6 meses a 40 ± 2 °C, luego se observó visualmente para detectar separación de fases.
Control higiénico
La contaminación microbiológica es un factor importante en la calidad de un producto farmacéutico; para evitarla es necesario mantener buenas prácticas en el laboratorio; materiales y ambientes cuidadosamente higienizados. El control higiénico se realizó de acuerdo con lo establecido por Farmacopea Argentina Séptima Edición [12] para productos no obligatoriamente estériles. Para ello, 1 g de cada formulación fue disperso en 10 ml de buffer fosfato pH 7,2, luego se tomó el volumen indicado de muestra para cada ensayo y se siguió el procedimiento indicado para cada caso. El control se realizó sobre aerobios viables, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, enterobacterias, hongos y levaduras.
RESULTADOS
El aceite de semillas de Cucurbita mixta Pangalo que se obtuvo presentó propiedades organolépticas óptimas, físicamente estables y no mostro signos de rancidez. Los resultados del análisis físico químico de este aceite muestran en la tabla 2.
Tabla 2 Propiedades fisicoquímicas del aceite de Cucurbita mixta Pangalo.
| Parámetros fisicoquímicos evaluados | ||
|---|---|---|
| Índice de peróxido (meq O2/Kg) | 7,44 ±0,52 | |
| Índice de yodo (centigramos I/g) | 26,64 ±1,79 | |
| Índice de saponificación | 212,52 ±3,33 | |
| Índice de esterificación | 210,01±3,69 | |
| Índice de refracción | 1,46 ±0,02 | |
| Viscosidad (cPs) | 74,12±0,51 | |
| Densidad del aceite (g/ml) | 0,92±0,01 | |
| Índice de acidez (mg KOH/g) | 1,68±1,55 | |
| pH | 5,5±0,01 | |
Los aceites extraídos fueron de color verde; el contenido de lípidos (n=3) fue de 37,8% ± 3,1 valor similar a los encontrado por Pranabendu et al. [13] que en genotipos de Cucurbita moschata fue 36,55%; sin embargo, son inferiores a los obtenidos por Petkova, et al. [14] en C. moschata con un contenido del 47,1% y por Rodríguez, et al. [15] en semillas de zapallo Cucurbita spp. con un contenido de 45%.
El índice de acidez medido (1,68 ± 0,06 KOH/g) indicó la presencia de ácidos grasos libres; la saponificación (212,52 ± 3,33 mg KOH/g) denotó un bajo contenido de ácidos grasos saturados, ambos valores de índices son mayores a los hallados por Ordóñez-Narváez et al. [16]. El índice de yodo (26,64 ± 1,79 cg I/g) reveló la presencia de ácidos grasos insaturados, que pueden clasificarse como semisecado, mientras que el de peróxidos (7,44 ± 0,52 mEqO2/Kg) confirmó que estos aceites tienen bajo grado de rancidez.
La composición de ácidos grasos saturados e insaturados presentes en el aceite se muestran en la tabla 2; la identificación de los picos principales se realizó por comparación de los tiempos de retención obtenidos contra testigos de ésteres metílicos de ácidos grasos. Cada muestra fue analizada cromatográficamente por triplicado.
La composición de ácidos grasos saturados e insaturados presentes en las semillas estudiadas muestran que dentro de estos últimos los predominantes fueron el ácido oleico (38,74%) y ácido linoleico (35,05%); estos valores son inferiores a los hallados (43%) por López et al., [17] en Cucurbita pepo; y similares a los encontrados por Rodríguez, et al. [15] en semillas de zapallo Cucurbita spp. El ácido araquídico fue significativamente inferior al 1% (0,42%), este bajo nivel de ácidos grasos saturados le otorga mejor calidad de aceite vegetal.
Los emulgeles probados, fueron de fase externa acuosa (O/A), de color amarillento con ligero olor ceroso, en las propiedades fisicoquímicas de ambas formulaciones cosméticas se observa que el pH obtenido está dentro del rango permitido, el cual debe estar entre 6 y 7,5; la elevada conductividad (F1: 30 µS/cm y F2: 40 [S/cm) indica el signo de emulsión acuosa; el índice de acidez para cremas indicado por Mujica, et al. [18] debe tener un máximo de 2%, el resultado obtenido fue en la formulación con Sepigel 305* al 2%, (1,85 %± 0,03) y en la con Ceral PW al 10% (1,85 %± 0,03) lo cual se encuentra por debajo del máximo recomendado.
Tabla 3 Composición de ácidos grasos de aceite de Cucurbita mixta Pangalo.
| Ácido grasos | TR (min) | % ácidos grasos |
|---|---|---|
| C 14:0 | 6,14 | 0,13 |
| C 16:1 | 9,16 | 0,11 |
| C 16:0 | 9,57 | 14,52 |
| C 17:1 | 11,22 | 0,05 |
| C 17:0 | 11,66 | 0,11 |
| C 18:2 | 12,82 | 35,05 |
| C 18:1 | 12,92 | 38,74 |
| C 18:0 | 12,97 | 2,62 |
| C 18:3 | 13,24 | 8,23 |
| C 21:0 | 15,55 | 0,42 |
Como se observa en la figura 3, la extensibilidad de F1 es ligeramente mayor que la extensibilidad de F2.
Luego de la centrifugación no hubo separación de las fases O/W, tampoco se observaron alteraciones en el color, olor y apariencia, y en ningún caso hubo exudado o segregación de agua luego de los ensayos de estrés térmico. Las muestras sometidas a bajas temperaturas tuvieron una disminución en el peso luego de los 7 días menor a 0,09 ± 0,01 g; además, los componentes no mostraron separación de fase, su consistencia, color y olor permanecieron idénticos. A temperatura ambiente la diferencia en el peso fue menor a 0,05 ± 0,01 g, y mantuvo todas sus propiedades fisicoquímicas. Por último, las muestras que fueron sometidas a 40 °C tuvieron una disminución de peso de 1,16 ± 0,07 g, probablemente debido a que parte del agua de la fase acuosa se evaporó, lo cual era de esperarse por las condiciones de temperatura a las que fueron sometidas.
En el estudio de estabilidad acelerada ambos emulgeles no mostraron separación de fases ni cambios en sus propiedades fisicoquímicas, lo que indica que pueden mantener sus condiciones en función del tiempo.
Las formulaciones se sometieron a ensayos microbiológicos para evaluar su calidad higiénica; los resultados para aerobios viables dieron valores ≤100 UFC/g para ambos productos; en el recuento de hongos y levaduras <10 UFC/g y ausencia de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, al igual que para enterobacterias en 1g de muestra en el ensayo.
Los factores que influyen en el desarrollo de microorganismos son básicamente los componentes, el pH, la disponibilidad de oxígeno, la estructura biológica, el poder conservante y la cantidad de agentes antimicrobianos, es lo que determina la formación de microorganismos en el producto cosmético Mujica et al. [18]. En los resultados arrojados se aprecia que las colonias bacterianas, así como el conteo total de hongos y levaduras se encuentran por debajo del máximo permisible por Farmacopea Argentina séptima edición [12] asegurando así los parámetros de calidad en cuanto a asepsia y cantidad adecuada de agente antimicrobiano en la elaboración del producto.
Los resultados demostraron que es posible formular fitocosmeticos a partir de una base con emulgente no iónico y la base autoemulsionable aniónica que contenga el aceite de origen vegetal de Cucurbita argyrosperma C. Huber como agente funcional, obteniéndose dos productos que demostraron características organolépticas y estabilidad aceptables.
