Estudio preliminar de la estructura genetica de Triatoma venosa (Hemiptera: Reduviidae) mediantemarcadores moleculares RAPD

Preliminary study of the genetic structure of Triatoma venosa (Hemiptera: Reduviidae) using RAPD molecular markers

CLAUDIA ESPITIA¹, CARLOS JARAMILLO ², GERMAN AGUILERA ³, NESTOR PINTO⁴, FELIPE GUHL ⁵

¹ Microbiologa. Universidad de los Andes, Departamento de Ciencias Biologicas, CIMPAT. E-mail: cl-espit@uniandes.edu.co

² M. 5c. Universidad de los Andes, Departamento de Ciencias Biologicas, CIMPAT. E-mail: cjaramil@uniandes.edu.co

³ M. Sc. Universidad de los Andes, Departamento de Ciencias Biologicas, CIMPAT. E-mail: geragui25@hotmail.com

⁴ M. Sc. Universidad de los Andes, Departamento de Ciencias Biologicas, CIMPAT. E-mail: npinto@uniandes.edu.co

⁵ Autor para Correspondencia: M. Sc. Universidad de los Andes, Departamento de Ciencias Biologicas, Centro de Investigaciones en Microbiologia y Parasitologfa Tropical, CIMPAT. Carrera 1 no 18a 10 Bloque A. Fax: 3324540, Tel. 3394949 Ext. 2774. E-mail: fguhl@uniandes.edu.co

Resumen. Triatoma venosa es uno de los principales vectores secundarios de la enfermedad de Chagas en Colombia. Para estudiar su estructura genetica se colectaron 30 individuos adultos de T. venosa en los municipios de Somondoco (veredas de Cabrera y Barreras), Guateque (veredas de Llano Grande, Tincachoque, y Cantoras) y Sutatenza (veredas de Sisquique, Ovejeras, el Gaque y Piedra Larga), departamento de Boyaca, provenientes de dos habitats diferentes (peridomestico y domestico). El ADN genomico de cada individuo se amplified por RAPD utilizando 4 iniciadores, los productos se visualizaron mediante electroforesis en geles de poliacrilamida al 6% tenidos con plata. Al realizar un analisis mediante el programa SYNTAX 2000 y RAPDPLOT se obtuvo un dendrograma donde no se define un cluster para cada poblacion de insectos evaluada. Al analizar la matriz de datos con RAPDFST se obtuvo un Fst de Wright de 0,047 y de Weir & Cockerham de 0,056. La tasa efectiva de migracion en este analisis fue de 5,0 con la metodologia de Wright, y de 4,2 con la de Weir & Cockerham. Estos resultados preliminares indican una gran movilidad de los insectos entre los dos habitats y un elevado flujo genetico que no permite el establecimiento de diferenciacion genetica entre las poblaciones domesticas y peridomesticas analizadas.

Palabras clave: Enfermedad de Chagas. Triatomino. Insectos vectores. RAPD.

Summary. Triatoma venosa is one of the main secondary vectors of Chagas Disease in Colombia. To study its genetic structure, 30 adult individuals of T. venosa were collected in the municipalities of Somondoco (villages of Cabrera and Barreras), Guateque (villages of Llano Grande, Tincachoque, and Cantoras) and Sutatenza (villages of Sisquique, Ovejeras, el Gaque and Piedra Larga) department of Boyaca, from two different habitats (peridomestic and domestic). Genomic DNA of each individual was amplified by RAPD using 4 primers; the products were visualized after polyacrilamide gel electrophoresis followed by 6% silver staining. The dendrogram obtained after analysis with SYNTAX 2000 and RAPDPLOT software did not define a cluster for each insect population evaluated. When the binary matrix was analyzed with RAPDFST software, the Wright's Fst was 0,047 and Weir & Cockerham's Fst was 0,056. The effective migration rate in this analysis was 5,0 under Wright's methodology and 4,2 under Weir & Cockerham's methodology. These preliminary results indicate a high mobility of the insects between the two habitats and a high genetic flow, which do not allow the establishment of genetic differentiation between the domestic and peridomestic populations analyzed.

Key words: Chagas disease. Triatominae. Insect vectors. RAPD.

La enfermedad de Chagas fue descrita por primera vez por Carlos Chagas en 1909, es exclusiva del continente americano y es causada por Trypanosoma cruzi , un protozoo parasito flagelado trasmitido a humanos por insectos triatominos.La distribucion geografica de infecciones humanas por T. cruzi se extiende desde Mexico hasta el sur de Argentina, afectando entre 16 a 18 millones de personas, adicionalmente cerca del 25% de la poblacion latinoamericana se encuentra en riesgo de adquirir la enfermedad (WHO 2000). En Colombia se estima que alrededor del 5% de la poblacion esta infectada y cerca del 20% se encuentra bajo riesgo de adquirir la infeccion (Guhl 2000).

La transmision de T. cruzi se lleva a cabo principalmente por medio de insectos vectores que han mostrado una fuerte estructuracion geografica, la cual puede ser detectada por marcadores morfometricos, citogeneticos e isoenzimaticos (Guhl y Schofield 1996). Adicionalmente, se han empleado marcadores moleculares generados por amplificacion azarosa de polimorfismos de ADN que permiten detectar variabilidad genetica entre diferentes poblaciones de vectores (Welsh y McCleland 1990; Williams et al. 1990).

Harry et al. (1998) realizaron una revision sobre la utilizacion de RAPD (Random Amplified Polymorphic DMA) en entomologia y sugirieron que estos marcadores son utiles en estudios de genetica poblacional y pueden ser de gran utilidad en programas de control a traves de la localizacion de genes o de regiones importantes en el genoma.

En triatominos, se han realizado algunos estudios utilizando esta tecnica, Carlier et al. (1996) presentaron unos resultados preliminares sobre el uso de RAPD en la comparacion de vectores triatominos intra e interespecificos, los cuales permitieron una separacion facil entre Triatoma sordida y T. infestans, al igual que poblaciones silvestres y domesticas de T. infestans. De la misma manera, Jaramillo et al. (2001), usando esta misma tecnica molecular, establecieron que no se presentaba flujo genetico entre Rhodnius prolixus y R. colombiensis (domiciliados y silvestres, respectivamente), corroborando de esta manera las diferencias encontradas mediante metodos morfometricos y bioquimicos por Moreno et al. (1999). Otras especies de triatominos evaluadas de manera preliminar por esta tecnica han sido T. brasiliensis (Borges et al. 2000) donde se sugiere una heterogeneidad poblacional y Triatoma dimidiata (Jaramillo et al. 2003) donde se sugiere homogeneidad genetica entre las poblaciones domesticas, peridomesticas y silvestres de esta especie.

Estudios como los realizados para Rhodnius spp. y T. dimidiata evidencian la necesidad de evaluar la estructura genetica de otras especies vectores en Colombia, permitiendo entender el comportamiento de sus poblaciones y de esta manera, poder establecer estrategias de control vectorial mas eficaces.

En esta investigacion se muestran resultados preliminares de la estructura genetica de Triatoma uenosa (Stal), un vector secundario de importancia epidemiologica por su amplia distribucion geografica (Guhl et al. 2002) y cuyos habitos y hospederos son desconocidos. Hasta el momento, T. venosa ha sido registrado en forma silvestre en Ecuador (Azuay, Sucumbios, Napo) y en colonias domesticas en Colombia (Boyaca, Santander) (Abad-Franch y Aguilar 2003). Se empleo la tecnica RAPD (Williams et al. 1990), con el fin de analizar la estructura genetica y detectar variabilidad genetica de poblaciones domesticas y peridomesticas de esta especie capturadas en el departamento de Boyaca, Colombia, para poder estimar el riesgo epidemiologico que represents la poblacion peridomestica en la transmision de la enfermedad de Chagas en Colombia. Este estudio se llevo a cabo en el Centro de Investigaciones en Microbiologia y Parasitologia Tropical - CIMPAT. Universidad de los Andes, Bogota - Colombia, en el ano 2003.

Materiales y Metodos

Los insectos evaluados se capturaron en dos habitat diferentes: en gallineros localizados fuera de las viviendas habitadas o habitat peridomestico (15 individuos) y dentro de las viviendas o domicilio ( 15 individuos), para un total de 30 individuos adultos provenientes del departamento de Boyaca, en los municipios de Somondoco (veredas de Cabrera y Barreras), Guateque (veredas de llano grande, Tincachoque, y Cantoras) y Sutatenza (veredas de Sisquique, Ovejeras, el Gaque y Piedra Larga), localizados alrededor de los 1.700 msnm.

El procedimiento de extraccion de ADN genomico total se realizo mediante la maceracion de las seis patas de cada indivi duo, previamente lavadas con hipociorito para evitar contaminacion con ADM foraneo, seguida de una purificacion mediante el kit Aqua Pure para el aislamiento de ADW a partir de tejidos de BJO-RAD ®. El ADM se almaceno a -20°C hasta el momento de su analisis. Se empleo el kit Ready lb Go RAPD de Amersham Pharmacia®, rehidratando cada perla con 19 ul de agua destilada y agregando 25 pmol de iniciador (5 ul). Posteriormente, se dividio el contenido en cuatro tubos, a cada uno de los cuales se le agregaron 2 ul de ADN templado, para un volumen final de reaccion de 8 ul. El perfil termico utilizado consistio en: un paso inicial de denaturacion a 95°C por 5 minutos, seguido de 44 ciclos de 95°C por 1 min, 36°C por 1 min, 72°C por 2 min y un paso final de elongaciòn a 72°C por 7 min.

Se analizaron 15 individuos peridomesticos y 15 individuos domesticos con los iniciadores RTQ 2, 3, 4 y 5 de Pharmacia® (Tabla 1), que permitieron obtener un total de 70 marcadores.

La visualizacion de los productos de RAPD se realizo en genes de poliacrilamida al 6% con un tiempo de corrido electroforetico de 3 h a 80 V, los cuales fueron posteriormente tenidos con el kit Silver Stain Plus de Pharmacia® siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Se construyeron matrices binarias de datos de acuerdo con Welsh et al. (1992) en donde se representa la informacion genetica colectada para cada individuo. La matriz de datos se analizo con los programas RAPDPLOT (Kambhampati et al. 1992) y SYT1TAX2000 (Podani 1993), los cuales permiten crear una matriz de distancia empleando el indice de Disimilaridad de Jaccard. Posteriormente, esta matriz fue utilizada para construir un dendrograma mediante el algoritmo UPGMA (Unweighted Pair Group with Averaging).

Se empleo el programa de RAPDDIST para establecer las distancias geneticas de Nei (1973) entre poblaciones a partir de una matriz de datos y, posteriormente con la matriz de distancia se genero el dendrograma con 1000 repeticiones.

Resultados

Con los 4 inciadores empleados, no se observa un patron de bandeo definido para ninguna de las dos poblaciones estudiadas (Fig.1), similar a lo señalado en Triatoma dimidiata ( Jaramillo et al. 2003), como si se pudo establecer previamente para Rhodnius prolixus y R. colombiensis (Jaramillo et al. 2001;, donde claramente se definian patrones particulares de polimorfismos mediante la tecnica de RAPD para cada especie estudiada.

Para T.venenosa se observa una homogeneidad en los patrones de bandeo entre las dos poblaciones evaluadas (Fig. 1), lo que sugiere una poca diferenciacion genetica entre las dos poblaciones estudiadas de este insecto.

El analisis mediante los programas SYNTAX 2000 y RAPDPLOT genero un dendrograma donde no se define un cluster para cada poblacion de insectos, sino que se ve una distribucion mezclada de los individuos de las diferentes poblaciones (Figs. 2-3).

Al realizar el analisis con el programa RAPDFSTse calculo el Fst de Wright (1951) y de Weir & Cockerham (1984) (Tabla 2), para las dos poblaciones en conjunto. Con la metodologia de Wright y de Weir & Cockherman, el Nm fue suficiente para mantener homogeneidad genetica, debido a que al menos un individuo debe migrar por generacion. Estos resultados indican una gran movilidad de los insectos entre los dos ambientes y un elevado flujo genetico que no permite el establecimiento de diferenciacion genetica entre las dos poblaciones evaluadas.

El analisis de los datos con el programa RAFDDIST permitio generar un dendromiento de diferenciacion genetica entre las grama para las dos poblaciones evaluadas dos poblaciones evaluadas. (Fig.4). En este dendrograma no se observa una diferenciacion genetica entre la poblacion domestica y peridomestica con respecto a los individuos utilizados como grupo de exclusion, dado que el cluster que agrupa a las dos primeras presenta la misma distancia genetica, indicando de esta manera la poca diferenciacion genetica encontrada entre las poblaciones evaluadas de T. venosa en este estudio.

Discusion

Los resultados obtenidos a partir de los marcadores moleculares RAPD proveen una base molecular para evaluar las relaciones geneticas entre los triatominos (Garcia et al. 1998). Esta tecnica se ha utilizado ampliamente para analizar el genoma de otros insectos vectores como el vector de la malaria Anopheles gambiae (Favia et al. 1994), o para identificar poblaciones de Aedes albopictus (Kambhapati et al. 1992). Jaramillo et al. (2001), mediante RAPD, encontraron diferencias entre Rhodnius prolixus y R. colombiensis lo que llevo a proponer que el control de poblaciones domesticas de Rhodnius no se verian influenciadas de manera importante por invasiones silvestres (Guhl y Schofield 1996).

Con los resultados preliminares obtenidos entre las poblaciones de T. venosa se sugiere que ocurre un elevado flujo genetico entre las mismas, debido a que agrupan en la misma rama del dendrograma (Fig.4), diferente a lo observado para Rhodnius prolixus (de caracter domiciliado) y R. colombiensis utilizados como grupos de exclusion en este estudio (Fig.3), los cuales no presentan flujo genetico entre si (Jaramillo et al. 2001).

Adicionalmente, T. venosa, aparentemente presenta un flujo genetico mayor que el indicado para otras especies como Rhodnius (Jaramillo et al. 2001), T. dimidiata (Jaramillo et al. 2003), o para mariposas como Papilo glaucus en Ohio, Georgia y Florida donde se registro un Nm de -0,0032 (Bossart y Scriber 1995).

Los valores de rim obtenidos para T. venosa indican una migracion significativa de individuos por generacion o un potencial de dispersion suficiente para mantener homogeneidad genetica, debido a que son mayores a 1, lo que hace que las frecuencias alelicas permanezcan homogeneas en las poblaciones (Wright 1931). Con los resultados se observa que hay migracion de por lo menos 4,2 insectos por generacion entre las poblaciones (Tabla 2), lo que contribuiria a mantener homogeneidad genetica y a hacer mas dificil el control de este vector en la transmision de la enfermedad de Chagas, en el caso que T. venosa se encontrara como un vector eficiente de la transmision del parasito

Los valores de Fst obtenidos (Tabla 2), indican que hay poca diferenciacion entre las poblaciones de T. venosa; es decir, que hay un intercambio genetico entre las poblaciones evaluadas.

Estos hallazgos son similares a los encontrados para T. dimidiata (Jaramillo et al. 2003), debido a que las poblaciones no domiciliadas de T. venosa, al igual que las poblaciones no domiciliadas de T. dimidiata, estarian representando un riesgo epidemiologico en la transmision de la enfermedad de Chagas.

Dentro del marco del programa nacional de control y eliminacion de la enfermedad de Chagas en Colombia, estudios como este contribuyen en el entendimiento del comportamiento de especies de triatominos de importancia secundaria que pueden tener la capacidad de invadir viviendas rurales, siguiendo de esta manera las recomendaciones hechas por Schofield et al. (1999).

La relevancia de T. venosa en la transmision de la enfermedad de Chagas es desconocida hasta el momento, ya que no hay estudios que indiquen una tasa de infeccion por tripanosomas, pero, dado el elevado flujo genetico que sugieren los resultados de este estudio preliminar, podria ser un vector potencial de dificil control.

Conclusiones

- Con el numero de individuos evaluados, no se encuentra una divergencia genetica elevada entre las poblaciones de T. venosa.

-Mediante la tecnica de RAPD no se obtuvieron patrones de bandeo que permitieran diferenciar las poblaciones domestica y peridomestica de T. venosa.

-El indice de fijacion (Fst) y la tasa efectiva de migracion (Nim) estimados, sugieren un flujo genetico suficiente para mantener una homogeneidad genetica entre las poblaciones.

- Existe flujo de genes entre las poblaciones domiciliadas y peridomiciliadas estudiadas de T. venosa

-El movimiento de los insectos entre las poblaciones estudiadas hace necesario un mayor control del peridomicilio en los programas de eliminacion de insectos vectores de la enfermedad de Chagas.

- Aunque hasta el momento se desconoce la capacidad vectorial de T. venosa, el posible flujo genetico encontrado puede ser un factor determinante para el aumento de su capacidad vectorial.

Agradecimientos

Este proyecto se llevo a cabo gracias al apoyo financiero de Colciencias proyecto Cod: 1204-04-13018 y la Facultad de Ciencias de la Universidad de los Andes.

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