ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

Evaluación del crecimiento de la microalga chlorella sorokiniana en diferentes medios de cultivo en condiciones autotroficas y mixotroficas

Evaluating microalgae Chlorella sorokiniana growth in different culture mediums in autotrophic and mixotrophic conditions

"Avaliação do crescimento da Chlorella sorokiniana em diferentes meios de cultura sob condições autotróficas e mixotróficas"

Martha L. Ortiz-Moreno¹, Caroll E. Cortés-Castillo², Julian Sánchez-Villarraga³, Jorge Padilla³, Angélica M. Otero-Paternina⁴

¹ Bióloga, Msc, Facultad de Ciencias Básicas e Ingenierías
² Química, Esp. MSc (C), Facultad de Ciencias Básicas e Ingenierías.
³ Estudiantes de Ingeniería Agronómica
⁴ Profesional en acuicultura, Msc (C) Grupo Gritox

Universidad de los Llanos. mlortizm@unillanos.edu.co

Recibido: noviembre 22 de 2010 Aceptado: diciembre 05 de 2011

Resumen

Chlorella sorokiniana es una microalga con alto potencial biotecnológico por su capacidad de sintetizar ácidos grasos de interés industrial, rápido crecimiento y capacidad de adaptación a diferentes fuentes de nutrientes tanto en regímenes autotróficos como mixotroficos e inclusive heterotróficos. El objetivo de este trabajo fue identificar el medio de cultivo que permitiera un máximo crecimiento de C. sorokiniana para su producción masiva. Se evaluaron los medios de cultivo Sueoka, Guillard y Remital (fertilizante NPK: 1, 2, 3, 4, 5g/L), que ofrecen nutrientes en condiciones autotróficas y lixiviado de gallinaza en concentraciones del 30, 50 y 80%, en régimen mixotrófico. Se registró una densidad celular máxima en medio Remital de 86,5±0,75 x 10⁷ células/ml y una velocidad específica de crecimiento media de 0,3 generaciones/día. Los test estadísticos de Tukey y Fisher indicaron que el Remital fue el mejor medio de cultivo y las condiciones autotróficas fueron ideales para el crecimiento de C. sorokiniana. El uso de altas concentraciones de Remital no mejoro significativamente el crecimiento de la microalga. Por tanto, se recomienda el uso de Remital en bajas concentraciones (1g/L) como la mejor opción para la producción masiva de biomasa de C. sorokiniana.

Palabras clave: Chlorella sorokiniana, densidad celular, lixiviado de gallinaza, mixotrofia, autotrofia.

Abstract

Chlorella sorokiniana is a microalgae having great biotechnological potential due to its ability to synthesise fatty acids having industrial interest, rapid growth and the ability to adapt to differing nutrient sources in both autotrophic and mixotrophic regimens, and even heterotrophic ones. This work was aimed at identifying the culture medium which would lead to maximum C. sorokiniana growth to enable its mass production. Sueoka, Guillard and Remital culture mediums (1, 2, 3, 4, 5g/L NPK fertiliser) were evaluated; they offer nutrients in autotrophic conditions and 30%, 50% and 80% concentration poultry manure leachate in a mixotrophic regimen. 86.5±0.75 x 10⁷ cells/ml maximum cell density and mean 0.3 generations/day specific growth rate were recorded in Remital medium. Tukey and Fisher statistical tests indicated that Remital was the best culture medium and that autotrophic conditions were ideal for C. sorokiniana growth. Using high concentrations of Remital did not significantly improve microalgae growth. Using low concentrations of Remital (1g/L) is thus recommended as the best option for mass production of C. sorokiniana biomass.

key words : Chlorella sorokiniana, cell density, poultry manure leachate, mixotrophy, autotrophy.

Resumo

Chlorella sorokiniana é uma microalga com alto potencial biotecnológico por sua capacidade de sintetizar ácidos graxos de interesse industrial, rápido crescimento e capacidade de adaptação a diferentes fontes de nutrientes em regimes autotróficos, mixotróficos assim como também heterotróficos. O objetivo deste trabalho foi identificar o meio de cultura que favorece-se um máximo crescimento da C. sorokiniana para sua produção massiva. Avaliaram-se os meios de cultura Sueoka, Guillard e Remital (fertilizante NPK: 1, 2, 3, 4, 5g/L), que oferecem nutrientes em condições autotróficas e lixiviado de galinhaça em concentrações de 30, 50 e 80%, em regime mixotrófico. Neste trabalho encontro-se uma densidade celular máxima em meio Remital de 86,5±0,75 x 10⁷ células/ml e uma velocidade específica de crescimento meia de 0,3 gerações/dia. Os testes estatísticos de Tukey e Fisher mostraram que o Remital foi o melhor meio de cultura e as condições autotróficas foram ideais para o crescimento da C. sorokiniana. O uso de altas concentrações do Remital não melhoro significativamente o crescimento da microalga. Para tanto, recomenda-se o uso do Remital em baixas concentrações (1g/L) como a melhor opção para a produção massiva de biomassa da C. sorokiniana.

Palavras chave: Chlorella sorokiniana, densidade celular, lixiviado de galinhaça, mixotrofia, autotrofia.

Introducción

Las microalgas tienen la capacidad de crecer y hacer fotosíntesis con diferentes fuentes de nutrientes como las sales minerales, en condiciones autotroficas y sustancias orgánicas (como estiércoles y aguas residuales), en condiciones mixotroficas (Chinnasamy, 2010). Adicionalmente, algunas microalgas pueden crecer en condiciones heterotróficas, usando carbono orgánico en ausencia de luz (Xu et al., 2006). Esta plasticidad metabólica les permite adaptarse a diferentes ecosistemas y procesos biotecnológicos, generando biomasa que puede ser usada en la producción de alimentos, concentrados, compuestos bioactivos, biocombustibles, en la biorremediación y la producción de biofertilizantes (Chisti, 2007).

Una de las microalgas con mayor potencial biotecnológico es Chlorella sorokiniana (clorofícea) que se caracteriza por tener células esféricas (5µm de diámetro), con un cloroplasto en forma de copa y un pirenoide. El género Chlorella es cosmopolita y por tanto se adapta a diversas condiciones ambientales y nutricionales (Wehr y Sheath, 2003), pudiendo ser encontrada en el fitoplancton de estanques y lagos, colonizando el suelo o como simbionte en protozoos ciliados. C. sorokiniana ha sido ampliamente estudiada con respecto a su fisiología, genética y por su producción de biomasa con alto contenido de lípidos, específicamente ácidos grasos insaturados omega 3, 6 y 9, empleados en la obtención de suplementos nutricionales, cosméticos, farmaceúticos y biocombustibles (Ugwu et al., 2005; Spolaore et al., 2006; Sing y Goyal, 2007; Chisti, 2007).

Una de las limitantes principales del cultivo a escala industrial de C. sorokiniana son los costos de los componentes del medio de cultivo, que generalmente contiene fertilizantes inorgánicos derivados del petróleo (Chisti, 2007). El creciente aumento en los precios de los fertilizantes inorgánicos y su impacto ambiental negativo, han tenido como consecuencia la búsqueda de fuentes alternativas de nutrientes para los organismos fotosintéticos como las microalgas (Sevrin-Reyssac, 1998; Camargo y Alonso, 2006). Por tanto, la atención mundial se ha vuelto hacia el uso de materiales orgánicos de diversos orígenes como fertilizantes (Benedetti et al., 1998).

Los desechos animales, en su forma líquida, tienen una larga historia de uso como fuente de fósforo, nitrógeno y carbono para el crecimiento microalgal siendo de particular interés los desechos de la avicultura y porcicultura por sus grandes volúmenes y constante producción (Knud-Hansen, 1998; Venglovsky et al., 2006). Por ejemplo, la gallinaza es un desecho avícola que se compone de eyecciones de las aves de corral y del material usado como cama, que por lo general es cascarilla de arroz mezclada con cal. La gallinaza es un apreciado fertilizante orgánico, relativamente concentrado, de rápida acción y posee un alto contenido de urea (Hernandez y Cruz, 1993; Lu et al., 2010). El Instituto Colombiano Agropecuario-ICA mediante resolución 150 de 2003 y la Norma Técnica Colombiana-NTC 5167 (ICONTEC, 2004), determina que todos los productores y comercializadores de gallinaza están obligados a estabilizar sanitariamente estos productos mediante compostaje y fermentación, dichos procesos pueden generar importantes cantidades de lixiviado, que sin un manejo adecuado se puede convertir en un problema ambiental generando contaminación en cuerpos de agua y malos olores. Una alternativa para el manejo del lixiviado de gallinaza es su uso como fuente de nutrientes para el crecimiento de microalgas (Rosales et al., 2007). Ya que las microalgas, en condiciones mixotróficas, pueden extraer fósforo y nitrógeno del lixiviado de la gallinaza disminuyendo su potencial eutrofizante de los cuerpos de agua y generando biomasa que puede ser utilizada en diferentes aplicaciones industriales (Pizarro et al., 2002; Chisti, 2007; Fernández y Benito, 2009).

El uso de estiércoles líquidos como fuente de nutrientes para el cultivo de algas ha sido evaluado ampliamente, pero la magnitud de sus efectos es variable, debido a que las propiedades fisicoquímicas de los estiércoles son heterogéneas y varían dependiendo de las condiciones fisiológicas de los animales fuente, de la calidad de su alimento y las condiciones climáticas (Cheeke et al., 1977; Groeneweg y Schluter, 1981; Travieso et al., 2006). Los estiércoles líquidos tienen como ventaja sus bajos costos y alta disponibilidad, pero requieren de un manejo adecuado para evitar procesos de descomposición bacteriana que generen productos tóxicos para las algas y riesgos sanitarios (Vásquez, 1994; Rosales et al., 2007; Kumar et al., 2010).

Una estrategia para el control de los productos tóxicos para las microalgas generados en la descomposición bacteriana de los estiércoles líquidos es su pretratamiento ("digestión") en condiciones anaeróbicas o aeróbicas. Estos pretratamientos permiten disminuir la demanda biológica de oxigeno (DBO) del estiércol líquido y su contenido de amonio, también estabilizan su pH, siendo estas condiciones indispensables para el desarrollado adecuado de las microalgas (Costa et al., 2000; Olguín et al., 2001; Jiménez-Pérez et al., 2004; Kebede-Westhead et al., 2004; Wang et al., 2010). Específicamente, Rosales et al., (2007) recomiendan pretratar aeróbicamente la fracción soluble de gallinaza o lixiviado para viabilizar su uso en el cultivo de la microalga Chlorella sorokiniana.

En este contexto, es de suma importancia la realización de estudios sobre el crecimiento de C. sorokiniana en diferentes medios de cultivo para identificar las mejores condiciones nutricionales aplicables en la producción de biomasa microalgas con potencial biotecnológico. Por tal motivo, el objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto del medio de cultivo en el crecimiento de la microalga C. sorokiniana en condiciones auto y mixotróficas.

Materiales y métodos

Microalga

Chlorella sorokiniana 211-32, donada por el Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis (IBVF) de la Universidad de Sevilla (España) mantenida en medio de cultivo Sueoka a 24±2°C con aireación y fotoperiodo de 12 horas con 2629±306 lux.

Medios de cultivo en condición mixotrófica: Preparación del lixiviado de gallinaza

La gallinaza procedente de la granja avícola Bonanza ubicada en zona rural de la ciudad de Villavicencio (4°04’36,18"N 73°35’04,65"O; 380 msnm) fue tamizada (0,5cm ojo de malla) y se lavó con agua corriente en una proporción de 300g/litro, el líquido resultante se dejó fermentar por 8 días en un recipiente abierto cubierto con una tela, esto se hizo para favorecer la degradación aeróbica de la gallinaza por parte de su microflora acompañante. El lixiviado obtenido se filtró con ayuda de una bomba de vacio con papel filtro Whatman #1 de 0,45µm. El filtrado se dispuso en dosis de 30, 50 y 80% en el medio de cultivo y se esterilizó en autoclave a 121°C por 20 minutos (Rosales et al., 2007).

Análisis bromatológico del lixiviado de gallinaza

Este análisis fue desarrollado en el laboratorio de nutrición animal de la Universidad de los Llanos, aplicando los siguientes procedimientos: la preparación de muestras según la NTC4647 (ICONTEC, 1999a); materia seca por secado a 60°C en horno de convección; cenizas según NTC4648 (ICONTEC, 2006), en la cual se toma 1g de muestra y se lleva a 600°C en una mufla por 3horas; proteína cruda (NTC 4657 (ICONTEC, 1999b) por Microkjeldahl; extracto etéreo (NTC4969 (ICONTEC, 2001) por Soxleht con éter de petróleo por 1 hora; fibra cruda según NTC5122 (ICONTEC, 2002).

Este análisis fue aplicado a una muestra de 1L del lixiviado de gallinaza para conocer su contenido de nutrientes.

Análisis fisicoquímico del lixiviado de gallinaza

Este análisis fue desarrollado en el laboratorio de aguas de la Universidad de los Llanos, evaluando los siguientes parámetros: pH, sólidos totales, demanda química de oxigeno (DQO), demanda biológica de oxigeno (DBO), ácidez, alcalinidad, turbidez, potasio, sodio, dureza cálcica y total, hierro, carbonatos, bicarbonatos y cloruros según las metodologías establecidas en la GTC2 (ICONTEC, 1994). Este análisis fue aplicado a una muestra de 1L del lixiviado de gallinaza para determinar sus propiedades fisicoquímicas.

Medios de cultivo en condición autrófica

El medio Suoeka se compone de los siguientes elementos: KH₂PO₄ 8,3Mm; K₂HPO₄ 5,3Mm; MgSO₄.7H₂O 0,25Mm; CaCL₂.2H₂O 0,133Mm; Trazas Hutner 1x; NH₄Cl 9,35Mm. Trazas Hutner 200x: 12,7g de EDTA-Na.2H₂0 en 250ml de agua, se disuelven uno a uno en su orden los siguientes reactivos en 500ml de agua a 100°C: 2,28g de H₃BO₃; 4,40g de ZnSO₄.7H₂O; 1,02g de MnCl₂.4H₂O; 1,00g de FeSO₄.7H₂O; 0,32g de CoCl₂.6H₂O; 0,32g de CuSO₄.5H₂O; 0,22g de (NH₄)MoO₂₄.4H₂O. Se mezclan las soluciones anteriores, se lleva a 100°C y se ajusta el pH a 6,8 con KOH al 20%.(a una temperatura inferior a 70°C) (IBVF, 2011).

El medio f/2 de Guillard contiene: 1ml de solución que contiene 0,08g de CoCl₂.6H₂O y 0,8g de CuSO₄.5H₂O en 100ml de agua destilada; que se agrega a una solución de 800ml con: 0,2g de FeCl₃.6H₂O, 0,06g de ZnSO₄.7H₂O, 0,12g de MnSO₄.H₂O, 0,03g de Na₂MoO₄.2H₂O; 1ml de solución de 1,2g de EDTA-Na en 900ml de agua destilada. Se ajusta el pH a 7,0 y añadir 10g KNO₃ y 1,4g de KH₂PO₄. Se lleva a volumen final de 1litro y se lleva a 100°C (IBVF, 2011).

El medio Remital se preparó con 1g/L de abono Remital-M de la empresa Abocol que contiene 17% de nitrógeno total, fósforo asimilable 6%, potasio soluble en agua 18%, magnesio 2%, azufre total 1,6%, boro 0,2% y 0,1% de zinc. Este medio de cultivo fue efectivo para la proliferación de Chlorella vulgaris (Muñoz, 2009). Durante el desarrollo del presente trabajo también se analizó el crecimiento de Chlorella sorokiniana en las siguientes concentraciones (1.0, 2.0, 3.0, 4.0 y 5.0 g/L), con el objetivo de encontrar aumentos en los parámetros de crecimiento de la microalga.

Los cultivos se realizaron por quintuplicado iniciando con una densidad celular de 1 x 10⁷cel/ml en erlenmeyers de 350ml con 200ml de medio de cultivo. Estos experimentos se realizaron con una intensidad luminosa de 2629±306 lux en fotoperiodo de 12 horas, aireación constante y temperatura de 24±2°C durante 15 días.

Análisis de densidad celular

La densidad celular fue determinada en todos los experimentos, por recuento en microscopio cada tres días hasta alcanzar la fase estacionaria, usando un hematocitómetro Neubauer. Los parámetros de cinética de crecimiento se calcularon a partir de los datos de densidad celular en fase exponencial, usando las formulas propuestas por Lobban et al., (1988).

Análisis estadístico

Los datos se analizaron mediante análisis de varianza (ANOVA) con un α=0,05, para la determinación de tratamientos significativamente diferentes. En todos los casos en que la prueba F resultó significativa, se emplearon análisis de comparaciones múltiples (Test de Tukey y Fisher, Hsu y Dunnett, según el caso) para identificar el mejor tratamiento, con un nivel de significancia del 95%, mediante el programa Minitab 14.

Resultados

Características del lixiviado de gallinaza

El análisis bromatológico del lixiviado de gallinaza mostró que esta fuente de nutrientes aporta 18% de nitrógeno en forma de proteína y 35% de minerales en la forma de cenizas (Tabla 1).

El análisis fisicoquímico del lixiviado de gallinaza mostró pH ligeramente ácido (6,7 unidades de pH), con un alto contenido de sólidos totales (1116 mg/L) y alta turbidez (5700 NTU). La demanda química de oxígeno-DQO fue de 6800mg/L y la demanda biológica de oxígeno-DBO de 340mg/L (Tabla 2). El lixiviado de gallinaza aporta 998mg/L de potasio con respecto a los 180 mg/L que aporta el abono Remital. El nivel de nitrógeno que aportan el lixiviado de gallinaza y Remital es muy similar, 17,97% y 17%, respectivamente. Estos datos indican que es un sustrato rico en nutrientes para el cultivo de microalgas

Comparación de medios de cultivo en condiciones auto y mixotróficas

Comparación entre los medios de cultivo Sueoka, Guillard y el lixiviado de gallinaza

En el primer ensayo se comparó los medios de cultivo Sueoka (medio de cultivo control), Guillard y el lixiviado de gallinaza en las diferentes concentraciones (30, 50 y 80%) encontrando diferencias significativas entre los medios de cultivo con un valor P=0,005 en el ANOVA. Las pruebas de comparaciones múltiples de Dunnet y Hsu indican que el medio Guillard superó ampliamente las demás fuentes de nutrientes (Figura 1).

La densidad celular máxima para el medio Guillard fue de 130±17,3 x 10⁷ células/ml con un tiempo de generación (g) de 1,5 días y una velocidad específica de crecimiento de 0,7 generaciones/día superando al medio Sueoka, al calcular los tiempos de generación para los medios de cultivo con lixiviado de gallinaza se encontró que fueron muy similares al medio de Guillard con valores que fluctuaron entre 1,3 a 1,8 días, siendo el menor tiempo para el lixiviado al 80%. Los datos indican que el crecimiento en lixiviado presenta una fase de latencia más prolongada que en los medios inorgánicos (Tabla 3).

Comparación entre los medios Remital, Guillard y lixiviado de gallinaza

Luego de identificar los medios de cultivos más promisorios, se contrastaron con el medio Remital que fue reportado por Muñoz (2009) como la mejor fuente de nutrientes para el crecimiento de Chlorella vulgaris.

Con el medio de cultivo Remital, C. sorokiniana alcanzó una densidad celular mayor (86,5±0,75 x 10⁷ células/ml) en comparación con los otros medios evaluados (Guillard y Lixiviado de gallinaza en sus diferentes concentraciones) (Figura 2).

El ANOVA indica que hay diferencias significativas entre los medios de cultivo con un valor P=0,000. Las pruebas de comparaciones múltiples de Tukey y Fisher indican que el mejor medio de cultivo es Remital, seguido por Guillard (grupo de significancia B) y los medios con lixiviado de gallinaza tienen un comportamiento muy similar entre sí y propiciaron una menor densidad celular de C. sorokiniana (Grupo de significancia C) (Figura 2) y Tabla 4).

Evaluación del efecto de la concentración del Remital en el crecimiento de C. sorokiniana