ARTÍCULO CORTO

Detección de Ca Liberibacter solanacearum y fitoplasmas en cultivo de papa (Solanum tuberosum L.) en el Valle de Toluca

Título corto: Detección de Ca Liberibacter solanacearum y fitoplasmas

Detection of Ca Liberibacter solanacearum and phytoplasma in potato crop (Solanum tuberosum L.) in Toluca Valley

Ana Tarin Gutiérrez-Ibáñez¹ , Jesús Ricardo Sánchez Pale² , Antonio Laguna Cerda³ , José Francisco Ramírez Dávila⁴ , Artemio Balbuena Melgarejo⁵ y Omar Guadalupe Alvarado Gómez⁶.

¹Facultad de Ciencias Agrícolas, UAEMex, Campus Universitario Toluca-Ixtlahuaca, Km. 15 entronque al Cerrillo Toluca, Edo. de México CP 50200; *Autor para correspondencia e-mail: atarini@uaemex.mx .
²Facultad de Ciencias Agrícolas, UAEMex, Campus Universitario Toluca-Ixtlahuaca, Km. 15 entronque al Cerrillo Toluca, Edo. de México CP 50200; e-mail: jrsanchezp@uaemex.mx .
³Facultad de Ciencias Agrícolas, UAEMex, Campus Universitario Toluca-Ixtlahuaca, Km. 15 entronque al Cerrillo Toluca, Edo. de México CP 50200; e-mail: alagunac@uaemex.mx
⁴Facultad de Ciencias Agrícolas, UAEMex, Campus Universitario Toluca-Ixtlahuaca, Km. 15 entronque al Cerrillo Toluca, Edo. de México CP 50200; e-mail: jframirezd@uaemex.mx
⁵Facultad de Ciencias Agrícolas, UAEMex, Campus Universitario Toluca-Ixtlahuaca, Km. 15 entronque al Cerrillo Toluca, Edo. de México CP 50200; e-mail: abalbuenam@uaemex.mx
⁶Facultad de Agronomía, Universidad Autónoma de Nuevo León. e-mail: omar-alvarado@prodigy.net.mx

Recibido: octubre 24 de 2012 Aprobado: junio 24 de 2013

Resumen

En México y Centro América se han detectado tubérculos de papa con manchado interno. Recientemente en Texas EUA a esta enfermedad se le ha denominado "Zebra Chip" (ZC) o rayado de la papa, los síntomas foliares se asemejan al síndrome denominado "Punta Morada de la Papa" (PMP) o enfermedad del "amarillamiento por psilidos" la cual es asociada con la presencia de "Candidatus Liberibacter solanacearum". El objetivo de esta investigación fue detectar la presencia de esta bacteria y de fitoplasmas en plantas de papa que presentaban la coloración purpura de los foliolos. Durante el ciclo primavera - verano 2011 y 2012 se hizo un muestreo en los municipios de Tenango del Valle, Zinacantepec, Villa de Allende y San José del Rincón, del Estado de México. La detección de ambos patógenos se realizó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con los iniciadores específicos para fitoplasmas: P1/P7, R16mF2/R16mR1 y para Ca Liberibacter solanacearum: OA2/Oi2c, resultando el 35,8% de las plantas positivas para fitoplasmas y el 11,6% para la bacteria. Los resultados indican que en algunas regiones productoras de papa del Estado de México, los dos presuntos agentes causales del síndrome de PMP, fitoplasmas y Ca. Liberibacter solanacearum, pueden estar asociados.

Palabras clave: Candidatus Liberibacter solanacearum, Fitoplasma, punta morada.

Abstract

In Mexico and Central America have been detected stained potato tubers with internal browning; recently in Texas, USA, this disease has been called "Zebra Chip" (ZC) or striped potato, foliar symptoms resemble the syndrome called "Potato Purple Top" (PPT) or "psyllid yellows" disease which is associated with the presence of "Candidatus Liberibacter solanacearum". The aim of the current work was to detect the presence of this bacterium and phytoplasma in potato plants with purple top symptoms. During 2011 and 2012 Spring - Summer cycle, a directed sampling was carried out in Tenango del Valle, Zinacantepec, Villa de Allende and San José del Rincón, State of México. The detection of both pathogens was performed by Polymerase Chain Reaction (PCR) with specific primers for phytoplasmas: P1/ P7, R16mF2/R16mR1 and for Ca Liberacter solanacearum: OA2/Oi2c, being 35,8 % from the positive plants for phytoplasmas and 11,6 % for this bacterium. These results indicated that in some areas these two PPT syndrome suspected causative agents, phytoplasmas and Ca. Liberibacter solanacearum, could be associated in the State of Mexico potato-producing region.

Key words: Candidatus Liberibacter solanacearum, Phytoplasm, Purple Top.

Introducción

El cultivo de papa (Solanum tuberosum L.) es uno de los más importantes en el Estado de México, con una superficie cosechada de 1,677 ha y un rendimiento de 19,39 ton/ha para el año 2010. Un defecto llamado "papa manchada" fue reportado por primera vez en México en 1994, y se caracteriza por desarrollar un patrón de necrosis estriada en cortes transversales del tubérculo, necrosis que se acentúa cuando las rebanadas de los tubérculos se fríen. Se considera que la producción de papa ha sufrido pérdidas económicas del 70 al 90% por este tipo de daños. La misma sintomatología fue observada en el año 2000 en Texas, E.U.A nombrándole "zebra chip" y posteriormente en Guatemala en donde se le llamó "papa rayada" (Munyaneza et al., 2007), recientemente el mismo síndrome fue reportado en plantaciones de papa en Nueva Zelanda (Liefting et al., 2008). Se considera que los daños económicos son significativos en estos países y se ha dirigido la investigación a conocer sus causas. Los síntomas de la enfermedad conocida como PMP en México son similares a ZC.

Por observaciones al microscopio electrónico y PCR anidado, Secor et al., (2009) hipotetizaron que "zebra chip" era causada por un fitoplasma, y que Bactericera cockerelli estaba asociado con la enfermedad (Munyaneza et al., 2007). Liefting et al., (2008) observaron en un experimento con papa que además de los síntomas mencionados, las plantas afectadas envejecían antes de tiempo y los rendimientos disminuían hasta un 60% comparado con el rendimiento esperado.

Paralelamente Liefting et al., (2008) determinaron que los síntomas de "zebra chip" están asociados con una nueva bacteria cuyo nombre propuesto es "Ca Liberibacter solanacearum", la cual parece ser la misma bacteria que causa el amarillamiento de los psílidos en tomate y chile, Hansen et al., (2008) proponen como "Ca L. psyllaureous", la cual sería la cuarta especie conocida hasta ahora del género Liberibacter.

De acuerdo con los investigadores referidos, esta nueva bacteria es transmitida por el psílido Bactericera cockerelli, insecto ampliamente distribuido en la mayoría de las zonas agrícolas., en fechas recientes, en otras regiones productoras de papa en el mundo se ha determinado como agente causal a la bacteria Liberibacter. Con la idea de contribuir al conocimiento de esta enfermedad. La presente investigación tuvo como objetivo detectar la presencia de Ca. Liberibacter solanacearum y fitoplamas en cultivos comerciales de papa, en las principales zonas productoras en el Estado de México.

Materiales y métodos

El muestreo se realizó en variedades comerciales de papa de cuatro municipios productores del Valle de Toluca (Zinacantepec, San José del Rincón, Tenango del Valle y Villa de Allende) (tabla 1), en el ciclo primavera- verano 2011 y 2012; cuando las plantas se encontraban en floración y expresaban síntomas de la enfermedad PMP. Se colectaron 30 muestras por municipio correspondientes a foliolos con coloración purpura, y se procesaron en el Laboratorio de Fitopatología del Centro de Investigación de Estudios Avanzados en Fitomejoramiento (CIEAF) perteneciente a la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad Autónoma del Estado de México.

La extracción de ADN de tejido foliar se realizó a partir de 0.3 g siguiendo el método descrito por Dellaporta et al., 1983, utilizando el kit de extracción comercial Plant DNAzol Reagent® (Invitrogen^TM). Para observar la integridad del ADN extraído se preparó un gel de agarosa a una concentración de 0.8% teñido con bromuro de etidio (0.1 µgmL^-1). Mediante un transluminador de luz UV GVM20 Syngene se visualizaron las bandas de ADN, la calidad y la concentración de ADN se midió en un biofotómetro marca Eppendorf. El ADN obtenido se diluyó en agua destilada estéril para obtener una concentración final de 20 ng µL^-1 y se guardó a -20 °C para su uso posterior (Dellaporta et al., 1983).

La amplificación consistió en tomar el ADN de cada muestra y someterlo a una primera reacción de PCR utilizando el par de iniciadores P1/P7:(5´-AAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATT-3´/5´-CGTCCTTCATCGGCTCTT-3´) y en una segunda amplificación se utilizaron los iniciadores R16mF2/R16mR1: 5´-CATGCAAGTCGAACGGA-3´-5´-CTTAACCCCAATCATCGA). El programa térmico utilizado en las PCR´s para la detección de Fitoplasmas fue el reportado por Lee et al., 1993

Para la detección de Ca Liberibacter solanacearum se utilizaron los iniciadores específicos: OA2/Oi2c 5´-GCGCTTATTTTTAATAGGAGCGGCA-3´/5´-GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT-3´), los cuales fueron diseñados a partir de la región 16S rDNA y que amplifican un fragmento de 1160pb (Liefting et al., 2008; Liefting et al., 2009).

Las muestras se amplificaron en un termociclador automático PTC-100 MJ Research y los productos de PCR se visualizaron mediante electroforesis en geles de agarosa (P1/P7 1.0%, R16mF2/R16mR1 1.3%, OA2 y OI2c 1.0%) teñidos con bromuro de etidio (0.1 µg mL^-1) en buffer TAE 1X, usando un transiluminador de luz UV GVM20 Syngene. El tamaño de los fragmentos obtenidos se determinó con el software Gene Tools 3.1. con respecto al marcador de peso molecular Ladder 100 pb (Invitrogen ®).

Resultados y discusión

El ADN obtenido se encontró dentro del rango de pureza adecuado para realizar la PCR (1.7-2.0) (Sambrook et al., 1989).

En la PCR-anidada se observó un fragmento de 1200 pb, tanto en el testigo positivo como en las muestras problema (figura 1), detectándose de esta manera la presencia de fitoplasmas en 43 plantas de papa.

La presencia de Candidatus Liberibacter solanacearum se detectó en 14 plantas con sintomatología de PMP, por la amplificación de un fragmento de 1160 pb (Figura 2).

Se detectó la presencia de fitoplasmas en un 35,8% de las muestras analizadas observándose el porcentaje más alto (15%) en las muestras que provenían de Tenango del Valle y el más bajo (5%) en las pertenecientes a Villa de Allende. Con lo que respecta a Candidatus Liberibacter solanacearum el 12% de las plantas analizadas con síntomas de PMP resultaron positivas, encontrándose el porcentaje más alto en la localidad de Tenango del Valle con un 23,3%, mientras que para Villa de Allende no fue detectado (tabla 2).

Los resultados confirman la presencia de fitoplasmas en las cuatro zonas de estudio y de Candidatus Liberibacter solanacearum solamente en 3. La presencia de ambos patógenos en una misma planta solo fue detectada en Zinacantepec y Tenango del Valle.

La introducción de Ca. L. solanacearum en México es incierta, sin embargo la presencia del insecto vector B. cockerelli asociada con su diseminación ha sido reportada desde 1947 (Vega et al., 2008), tiempo antes de considerar a la bacteria potencialmente perjudicial en solanáceas. El primer reporte de ZC en México fue en 1994 en campos de papa cerca de Saltillo (Munyaneza et al., 2007).

Rubio et. al., (2011), señalaron la presencia de fitoplasmas y Candidatus Liberibacter solanacearum en la región productora de papa de Toluca. Dichos resultados concuerdan con los encontrados en la presente investigación al detectarse un 47,4% de plantas positivas a fitoplasmas y Ca. Liberibacter solanacearum mientras que el 52,6% restante negativo podría asociarse a otros patógenos, lo cual coincide con lo reportado por Secor et al., 2009.

La ausencia de los dos patógenos en la mayoría de las muestras sintomáticas contrasta con el efecto que causan los fitoplasmas y Ca. Liberibacter solanacearum al bloquear el sistema de transporte de la savia en el floema de las plantas (Maramorosch, 1998), y expresar los síntomas de punta morada.

En la actualidad el desarrollo de estrategias de control para Ca. L solanacearum y fitoplasmas en cultivos de papa se ha enfocado al manejo del vector B. cockerelli, debido a que ambos patógenos se encuentran limitados al floema y su medio de diseminación entre plantas es mediante injerto y vía insectos vectores (Bové, 2006).

Conclusiones

Se detectó la presencia de fitoplasmas y Ca. Liberibacter solanaceaum en el 47,7% de las muestras de plantas de papa con síntomas de punta morada, en las principales regiones productoras del Estado de México.

Agradecimientos

A la Universidad Autónoma del Estado de México, por el apoyo económico mediante el proyecto con clave 3056/2011ESP.

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