Microorganismos y producción de inóculos

Pleurotus ostreatus (HPB/P3), Trametes versicolor (HPB/ T2), Enterobacter xianfangensis (CB1), Pseudomonas azotoformans (CB2), Pseudomonas sp. (CB3), Bacillus subtilis (CB4) y Pseudomonas fluorescens (CB5), pertenecen a la colección de microorganismos de la Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, Colombia. Los hongos se reactivaron en agar extracto salvado de trigo (AEST) según ^{Morales-Álvarez et al. (2016)} y las bacterias se reactivaron a partir del banco de cepas primario en agar nutritivo siguiendo la metodología de ^{Meza et al., (2004)}. Los pellets de biomasa de P. ostreatus (CF1) y T. versicolor (CF2), se produjeron en caldo extracto salvado de trigo (CEST) empleando Erlenmeyers de 250 mL que contenían 100 mL de medio y 7 discos de agar con micelio fúngico. Los hongos se cultivaron por 7 días a 30 °C y 120 rpm, en un agitador horizontal termostatado New Brunswick™ Innova® 44. Para las bacterias se prepararon suspensiones con solución salina al 0.85 % (m/v) y se mezclaron en proporciones iguales para obtener la misma concentración de cada una de ellas (1x10⁸ células/mL). Se tomaron 40 mL de biomasa pelletizada de cada hongo y se homogenizaron mecánicamente empleando una licuadora estéril marca Oster por 2 minutos. A esta mezcla se le adicionó 1.0 mL de la suspensión de bacterias y nuevamente se homogenizó por 2 minutos. El inóculo se empleó para inocular los reactores de 1 L.

Pruebas de interacción fúngica y bacteriana

Para evaluar si los hongos y las bacterias podían unirse para formar un consorcio se realizaron pruebas de interacción bacteria-bacteria y hongo-bacteria. Las pruebas de interacción entre bacterias se desarrollaron siguiendo las metodologías reportadas por ^{Barrera et al., (1999)} y ^{Angulo-Cortés et al., (2012)}, a las cuales se les realizaron modificaciones: Se prepararon suspensiones de cada una de las bacterias en solución salina al 0.85 % (m/v) con una concentración de 1x10⁶ UFC/mL. Posteriormente, se sembró en superficie 0.1 mL de cada una de ellas en agar BHI y se colocaron 4 anillos de plástico estériles de 1.0 cm de alto x 0.5 cm de diámetro. A continuación, se adicionaron 100 de la bacteria a enfrentar con la que se sembró de forma masiva en el agar BHI. La formación de halos de inhibición en milímetros en la zona aledaña al anillo se consideró como prueba de interacción positiva. Como control negativo se utilizó solución salina al 0.85 % (m/v), las cajas se incubaron por 48 horas a 30 °C en una incubadora Memmert® y se determinó por triplicado el halo de inhibición en milímetros (mm).

En relación con los hongos se sembró en superficie 0.1 mL de cada una de las bacterias a evaluar (1x10⁶ UFC/ mL) en agar Papa Dextrosa sin acidificar (PDA). Posteriormente, se sembró un disco de agar PDA de 5 mm que contenía micelio fúngico en el centro de la caja. Como control de crecimiento se sembró sólo a P. ostreatus y T. versicolor en agar PDA, todas las cajas se incubaron por 8 días a 30 °C en una incubadora Memmert® y se realizaron mediciones a los 8 días. Como variable de respuesta se determinó el porcentaje de inhibición del crecimiento micelial empleando la Ec. 1.

Donde: % ICM corresponde al porcentaje de inhibición del crecimiento micelial, CML es el crecimiento micelial libre en milímetros, y CMIb es el crecimiento micelial influenciado por la bacteria en milímetros.

Determinación de actividad enzimática en presencia de inductores y colorantes sintéticos

Se realizó un experimento a escala de Erlenmeyer de 250 mL para establecer si los hongos y las bacterias tenían actividades enzimáticas como Lacasa y peroxidasas. Los hongos y las bacterias se cultivaron por separado en medio mínimo compuesto por: Glucosa 0.5 g/L, triptosa 0.05 g/L, KH₂PO₄ 1 g/L, MgSO₄ 7H₂O 0.250 g/ L, CaCl₂ 0.05 g/L y 10 mL/L de una solución de elementos traza (MnSO₄ 0.5 g/L, FeSO₄ 0.1 g/L, ZnSO₄ 0.1 g/L y CuSO₄ 0.1 g/L). A este medio se le adicionó ácido 2,2' - azino -bis -(3- etillbenzotiazolin - 6-sulfonico) (ABTS), 2,6-dimetoxifenol (DMP) y veratril alcohol (VA), en una concentración de 10 mg/L para cada inductor y con un pH final 6.8. Cada uno de los recipientes se inoculó con 10 % (v/v) de biomasa viable (pelletizado fúngico homogenizado o suspensión bacteriana) y se incubaron por 3 días a 30 °C y 120 rpm, en un agitador horizontal termostatado New Brunswick^TM Innova^® 44. Posteriormente, los sobrenadantes se recuperaron por centrifugación a 9000 x g por 20 minutos a 4 °C en una centrifuga refrigerada Sorvall y se cuantificaron las enzimas Lacasa, Manganeso Peroxidasa y Lignino peroxidasa. La viabilidad de la biomasa se determinó por triplicado sembrando los hongos en agar EST y midiendo el crecimiento radial a los 8 días a 30 °C. Para las bacterias se realizaron diluciones decimales y siembra por micro gota en agar BHI (Martínez et al., 2013).

La actividad Lacasa se determinó siguiendo la oxidación del ABTS 5 mM empleando el protocolo de ^{Tinoco et al., (2001)} y ^{Rivera-Hoyos et al., (2015)} definiendo la unidad enzimática como la cantidad de enzima necesaria para realizar la oxidación de 1 µmol de ABTS por minuto. La actividad Manganeso Peroxidasa se evaluó por la oxidación del 2,6-Dimetoxifenol 10 mM, la unidad enzimática se definió como la cantidad de enzima que se necesita para realizar la oxidación de 1 µmol de 2,6-DMP por minuto (^{Santoyo et al., 2008}). La actividad Lignino Peroxidasa se evaluó por la oxidación del Veratril Alcohol (VA) 10 mM a veratril aldehído y la unidad enzimática se definió como la cantidad de enzima necesaria para la oxidación de 1 µmol de VA por minuto (^{Tien y Kirk, 1983}). Para leer las absorbancias de las muestras y convertirlas en actividad enzimática se utilizó un espectrofotómetro Genesis 20^®.

Pruebas de decoloración en medio sólido

La capacidad para decolorar los colorantes sintéticos sin ningún suplemento de carbono y nitrógeno se evaluó por triplicado preparando agar colorante (Cristal Violeta, Rojo Congo, Fuscina de Gram y Verde Malaquita a 10 mg/L con 15 g/L de agar a pH 6.8 ± 0.2). Los hongos se sembraron colocando un disco de agar de 5 mm de diámetro que contenía micelio fúngico en la parte central de la caja. Las cajas se incubaron durante 8 días a 30 °C empleando una incubadora Memmert^®. Al finalizar el tiempo de incubación se midió el crecimiento del micelio en mm y se determinó el porcentaje de decoloración, empleando la Ec. 2.

Donde: A equivale a los 50 mm del diámetro de la caja de Petri. B es el halo de decoloración en mm generado por el hongo, y 100 corresponde al 100 % o máximo de decoloración a obtener bajo las condiciones del ensayo que fue equivalente a 50 mm.

Para evaluar el crecimiento y decoloración de las bacterias, se sembraron 10 µL de cada una de ellas en el mismo agar colorante en la parte central de la caja. Se cultivaron por 8 días a 30 °C en una incubadora Memmert^® y al finalizar el tiempo de incubación se determinó un índice de crecimiento y decoloración (ICD) empleando una escala adimensional de 0 a 10. Donde un índice de 10 equivale a una cepa con crecimiento, adsorción del colorante y decoloración; 7.5 indicó que la bacteria creció en el agar, adsorbió el colorante, pero no se evidenció decoloración; 5.0 correspondió solamente al crecimiento, sin adsorción, ni decoloración; y finalmente, los índices con valores de cero indicaron que la bacteria no creció, no adsorbió colorante, ni decoloró los colorantes a los 8 días de observación.

Identificación Molecular

Se realizó la identificación molecular de tres bacterias empleando herramientas moleculares. Cada una de ellas se reactivó por aislamiento en agar BHI y se cultivaron por 24 horas a 30 °C. A partir de las colonias aisladas se realizó el aislamiento y purificación del DNA, amplificación por PCR (C1000^TM Thermal Cycler, Bio-Rad) de la región ribosomal 16S de un tamaño de 1465 pb, purificación de los fragmentos de PCR y secuenciación con los indicadores 27F, 517F, 800R, 1492R del gen ribosomal 16S. Posteriormente, se realizó limpieza manual de cada una de las secuencias de los fragmentos obtenidos, ensamblaje de las secuencias y obtención de la secuencia problema. El análisis taxonómico de la secuencia problema ensamblada, se realizó mediante la comparación contra las bases de datos NCBI (National Center For Biotechnology Information) Greengenes (Laurence Berkely National Laboratory) y RDP (Ribosomal Database Project). Finalmente, se realizó el alineamiento y generación de los árboles de distancias utilizando las secuencias con mayor similitud a la secuencia problema y la clasificación taxonómica de la secuencia consenso (datos no mostrados).

Experimentos de remoción empleando residual liquido sintético

Muestreo y caracterización del agua residual real para diseñar el residuo líquido sintético

Se realizaron muestreos puntuales de los residuos líquidos generados en 4 laboratorios de docencia en los que se realizan coloraciones de Gram y coloraciones especializadas para observar esporas y cápsula bacteriana. A cada muestra se le determinaron los valores de demanda química de oxígeno (DQO) (Método 5210B) (APHA, 2012), demanda bioquímica de oxígeno al quinto día (DBO₅) (Método respitométrico) (Martínez et al., 2013), relación de tratabilidad (DBO₅/DQO), unidades de color (UC) (^{Livernoche et al., 1983}; ^{Pallerla et al., 1997}), pH, conductividad (determinada por conductivímetro), sólidos suspendidos totales (Método 2540D) (APHA, 2012) y recuento de Escherichia coli (Log10 de UFC/mL) como indicador de contaminación fecal (Martínez et al., 2013). Tomando como base la caracterización de cada uno de los lotes, se preparó un nuevo residual líquido sintético (RLS) que simuló los valores promedio y permitió controlar las concentraciones iniciales en los experimentos de remoción.

El RLS estaba compuesto por una mezcla de Cristal violeta (CV), Verde de malaquita (VM), Rojo Congo (RC) y Fucsina de Gram (FG) a una concentración de 10 mg/L en una proporción de 1:1:1:1, inductores enzimáticos (MnSO₄ 7H₂O 1 mM y CuSO₄ 7.5 mM), carbono y nitrógeno de fácil asimilación (Glucosa 0.5 g/L y Cloruro de amonio 0.05 g/L). El pH final fue de 6.8 ± 0.2, de tal manera que se favoreciera tanto el crecimiento de las bacterias como de los hongos.

Experimentos de remoción en función del tiempo

Se evaluaron 3 tratamientos que se presentan a continuación: T₁: Consorcio fúngico/bacteriano. T₂: P. ostreatus y T. versicolor y T₃: Solo las bacterias (Enterobacter xianfangensis, Pseudomonas azotoformans, Pseudomonas sp., Bacillus subtilis y Pseudomonas fluorescens). Como control absoluto se empleó el RLS sin inocular ningún microorganismo y como control de adsorción se realizó el mismo montaje que para los tratamientos, pero la biomasa se inactivó en autoclave por 15 minutos a 121 °C. Los experimentos se realizaron por triplicado empleando recipientes de un litro con 0.8 L de RLS como volumen efectivo de trabajo. Cada reactor tenía dos puertos de entrada (inoculación y aireación) y dos puertos de salida (muestreo de RLS y salida de gases). La aireación y mezcla se realizó por inyección de aire en profundidad empleando difusores cilíndricos porosos (3 mm de diámetro de poro) instalados en la parte inferior y central del reactor. El aire se suministró con aireadores eléctricos (con capacidad para alimentar 1 L/min). Cada reactor se inoculó con 10 % (v/v) de biomasa de acuerdo con cada uno de los tratamientos y controles a avaluar. La temperatura promedio fue de 20 °C ± 3.0. Se realizaron muestreos periódicos hasta completar 96 h para observar los cambios asociados con pH, DQO, recuento de hongos, bacterias (expresados como Log10 de unidades formadoras de colonia por mililitro), actividades enzimáticas (Lacasa, MnP y LiP) y unidades de color. Para determinar este parámetro, las muestras se centrifugaron a 9000 x g por 10 minutos a 4 °C en una centrifuga refrigerada Sorvall. Se recuperaron los sobrenadantes iniciales y los correspondientes a cada punto de muestro. Con la muestra inicial se realizó un barrido UV/VIS (200-700 nm) empleando un espectrofotómetro Genesis 20^®, para determinar en la región visible la longitud de máxima absorción para el RLS. La cuál se utilizó para medir la absorbancia de cada uno de los puntos de muestreo y determinar las unidades de color utilizando la Ec. 3.

Donde: A₁ es absorbancia a la longitud de onda a la cual la absorbancia fue máxima para RLS y 0.132 es la ABS_465nm de una solución estándar de platino-cobalto a 500.00 CU (^{Livernoche et al., 1983}).

Una vez de determinaron las unidades de color con estos valores se calculó el porcentaje de remoción de las unidades color empleando la Ec. 4.

Donde: RUC es remoción de unidades de color en porcentaje. UCi son las unidades de color iniciales. UC_f son las unidades de color finales (Fernádez et al., 2015).

Análisis estadístico

Se realizó un análisis de varianza y una comparación entre cepas mediante una prueba de Tukey para seleccionar las cepas con menor efecto antagónico y capacidad de decoloración en medio sólido. Para los experimentos de remoción se realizó una comparación entre los tratamientos T₁, T₂ y T₃, a las 96 horas. Adicionalmente, se realizaron análisis de correlación de Pearson teniendo en cuenta las 96 horas de proceso. Los datos se analizaron empleando el programa estadístico SAS 9.0, usando un nivel de significancia para todas las pruebas del 5 % (α=0.05).

Pruebas de interacción fúngica y bacteriana

Uno de los principales inconvenientes al emplear consorcios fúngicos y bacterianos para el tratamiento de aguas residuales, es que los hongos pueden ser inhibidos por las bacterias a través de diferentes mecanismos (^{Morato et al., 2014}; ^{Badia-Fabregat et al., 2017}). Por esta razón, en el presente estudio se realizaron pruebas de interacción in vitro antes de evaluar la eficiencia de los hongos y las bacterias en la remoción de unidades de color y DQO, presentes en el RLS. Se observaron diferencias significativas entre cepas (p<0.0001 ). El primer grupo (letra a) fueron las cepas CB1 (Enterobacter xiangfangensis) y CB2 (Pseudomonas azotoformans), con halos de inhibición de 2.0 y 4.0 mm de diámetro sobre las cepas CB4 ( Bacillus subtilis) por E. xiangfangensis y CB1 por la cepa de P. azotoformans. El segundo grupo (letra b) contenía a todas las bacterias que no generaron inhibición sobre las demás destacándose las cepas CB3 (Pseudomonas sp.), CB4 (Bacillus subtilis) y CB5 (Pseudomonas fluorescens), (Tabla 1). Siguiendo la metodología reportada por Angulo y colaboradores en el 2012, ninguna de las cepas generó halos de inhibición superiores a 5.0 mm y por lo tanto ninguna fue excluida del estudio (^{Angulo-Cortés et al., 2012}).

Al analizar los resultados de enfrentamiento bacteria/ hongo se observó que las cepas CB1 y CB4 solamente generaron una inhibición en el crecimiento micelial del 3.0 % y 5.0 % sobre T. versicolor a los 8 días de evaluación. P. ostreatus no fue inhibido por ninguna de las bacterias obteniendo porcentajes del 0 % (Tabla 1). Los porcentajes obtenidos fueron bajos determinando que los dos hongos podrían unirse a las cinco bacterias.

Tabla 1 Inhibición en mm para bacterias e inhibición del crecimiento micelial para hongos. 

En relación con las tres cepas bacterianas que generaron baja inhibición, se estableció que pertenecen a los géneros Enterobacter, Pseudomonas y Bacillus. Las tres han sido empleadas como controladores biológicos en suelos, por la producción antibióticos (pirrolnitrina, 2,4- diacetilfloroglucinol, piocianina y el ácido fenacín-1- carboxílico), bacteriocinas y sideroforos (^{Santoyo et al., 2010}). Aunque estas sustancias no han sido reportadas recientemente en el tratamiento de aguas residuales, en el presente estudio se implementaron dos estrategias para tratar controlar su posible efecto negativo. Se adicionó mayor cantidad de biomasa fúngica en relación con la biomasa bacteriana y se disgregó el micelio fúngico, para incrementar el área superficial de contacto.

Las bacterias que no generaron halos de inhibición pudieron desarrollar interacciones positivas no obligadas entre ellas mismas y con los dos hongos (protocoperación/ sinergismo) (^{Mir-Tutusaus et al., 2017}). Esta interacción permite que los hongos primero transformen los compuestos más complejos, liberando intermediarios que pueden ser empleados por las bacterias (^{Dashtban et al., 2010}). Por otro lado, tanto los hongos como las bacterias producen enzimas e isoformas diferentes de una misma enzima que oxidan la estructura aromática y sustituyentes alifáticos de los colorantes. Esto podría favorecer los procesos de mineralización hasta CO₂, agua, liberación de iones solubles e incremento de la biomasa (^{Dashtban et al., 2010}).

Determinación de actividad enzimática en presencia de inductores y colorantes sintéticos

En la figura 1A se presentan los resultados de los recuentos de las bacterias al cultivarlas en presencia de inductores enzimáticos como ABTS, DMP y VA, con una concentración inicial de 10 mg/L. Todas crecieron alcanzando recuentos que oscilaron entre 4.0 y 10 unidades logarítmicas. Con los hongos también se observó crecimiento al cultivarlos con los inductores, sin embargo, T. versicolor creció más despacio que P. ostreatus (89, 75 y 85 mm de crecimiento miceliar), obteniendo valores de 23, 55 y 20 mm en presencia de ABTS, DMP y VA, respectivamente.

El crecimiento inicial de los hongos y las bacterias se relacionó con el uso de la fuente de carbono (Glucosa) y nitrógeno (Cloruro de amonio), los cuales pudieron ser metabolizados para la producción de biomasa y energía (^{Martinko et al., 2014}). Por otro lado, a partir de la oxidación de los inductores enzimáticos los microorganismos también pudieron obtener una fuente adicional energía (^{Dashtban et al., 2010}).

En relación con las actividades enzimáticas, las bacterias no produjeron la enzima Lacasa en presencia del ABTS y con los hongos los valores obtenidos fueron de 173 y 137 U/L para P. ostreatus y T. versicolor (Figura 1B). La actividad MnP para las bacterias osciló entre 0.5 y 1.6 U/L, valores bajos si se comparan con los hongos ya que la actividad para P. ostreatus fue de 143 U/L y para T. versicolor fue de 433 U/L (Figura 1B). En relación con la actividad LiP los resultados oscilaron entre 0.06 y 0.3 U/L, para las bacterias y entre 11 y 143 U/L para T. versicolor y P. ostreatus (Figura 1B). Aunque las bacterias tuvieron actividades enzimáticas bajas, vale la pena resaltar que es el primer reporte de géneros como Pseudomonas, Enterobacter y Bacillus, aislados de aguas residuales reales contaminadas con colorantes de Gram que tienen actividad Manganeso peroxidasa y Lignino peroxidasa.

Figura 1 Crecimiento y actividades enzimáticas en medios inductores para las cepas bacterianas (CB1: Enterobacter xianfangensis CB2: Pseudomonas azotoformans, CB3: Pseudomonas sp., CB4: Bacillus subtilis y CB5: Pseudomonas fluorescens) y los hongos P. ostreatus y T. versicolor (CF6 y CF7) 

Los compuestos como el ABTS, DMP y VA, son empleados como inductores de actividad enzimática, mediadores redox para la oxidación de fracciones no aromáticas de la lignina y como sustratos para monitorear la actividad enzimática in vitro (^{Grassi et al., 2011}). Estos compuestos tienen un potencial redox más bajo que las enzimas Lacasa, MnP y LiP, por esta razón son susceptibles a ser oxidados por la sustracción de electrones y se producen intermediarios oxidados (Catión ABTS⁺, Catión ABTS⁺⁺, veratril aldehido, entre otros) que finalmente pueden llegar hasta ácido succínico y ácido acético (^{Dashtban et al., 2010}; ^{Elisashvili y Kachlishvili, 2009}).

Pruebas de decoloración en medio sólido

Los resultados relacionados con el índice de crecimiento y decoloración (ICD) para las bacterias y los hongos se presentan en la Tabla 2. Todos los microorganismos fueron cultivados bajo una condición limitante de carbono y nitrógeno de fácil asimilación, ya que el agar no tenía ningún suplemento nutricional y esto permitió evaluar su potencial para crecer y decolorar, utilizando como única fuente de carbono y nitrógeno los colorantes pertenecientes a la familia de los trifenilmetánicos y el colorante azóico rojo congo. De acuerdo con los rangos establecidos para calcular el ICD las cepas bacterianas con índices de 10 son las que tuvieron mayor potencial para crecer, realizar adsorción y decoloración, siendo estadísticamente diferentes (p<0.0001). El segundo grupo estaba compuesto por las bacterias que crecieron, adsorbieron parte del colorante, pero no generaron zonas de decoloración cercanas a la colonia. Por último, las bacterias con menor potencial fueron las que crecieron formando colonias pequeñas, en las cuales no se observó ni adsorción, ni decoloración. En relación con las familias de colorantes, el rojo congo (azóico) y verde de malaquita (trifenilmetánico) fueron los más biodegradables ya que se obtuvieron ICD de 10 para la mayoría de las bacterias. Los colorantes Cristal Violeta y Fucsina pertenecen a los trifenilmetánicos, pero tienen una estructura más compleja que el verde malaquita, esta podría ser una de las causas por las cuales los ICD oscilaron entre 5.0 y 7.5. Al realizar la mezcla de los 4 colorantes en concentraciones de 10 mg/L para cada uno de ellos se observó una disminución en ICD determinando que los valores oscilaran entre 5.0 y 7.5, para todas las bacterias. Esto se relacionó con la mezcla de colorantes con estructuras químicas diferentes, pero cabe resaltar que, a pesar de esto, ninguna fue inhibida en un 100 % (ICD: 0) (Tabla 2).

Tabla 2 Indice de decoloración y crecimiento para las bacterias y hongos en medio sólido. 

Crecimiento (C). Adsorción (Ad). Decoloración (D). No se observó crecimiento (NC). C/Ad/D: 10. C/Ad/-: 7.5. C/-/-: 5.0. NC: 0. Las letras representan los grupos heterogéneos de acuerdo con el análisis estadístico. (Las mismas letras entre cepas indican que no existen diferencias significativas entre ellas (p>0.05).

Los resultados obtenidos con los hongos permitieron confirmar su gran versatilidad para crecer a partir de sustratos complejos de tipo aromático, que tengan similitud estructural con las sub unidades de fenil propano de la lignina. Para P. ostreatus y T. versicilor los ICD fueron iguales a 10 para los colorantes por separado y en mezcla (Tabla 2).

Identificación Molecular

Una vez se determinó el potencial enzimático y el ICD, se realizó la identificación molecular de tres de las bacterias (CB1, CB2 y CB3). Las cepas CB4 y CB5, ya habían sido caracterizadas previamente, donde se determinó que CB4 correspondía a Bacillus subtilis y CB5 a Pseudomonas fluorescens. Los hongos P. ostreatus y T. versicolor fueron caracterizados desde el año 2003.

Los resultados del análisis taxonómico para el aislamiento CB1, con una longitud de la secuencia consenso de 1409 pb, indicaron que se trata de un microorganismo perteneciente al género Eneterobacter (Clasificadores RDP y Greengenes), especie xiangfrangensis (refseq/RNA - NCBI), con un 99 % de identidad en el 97 % de su longitud, comparada con secuencias del gen ribosomal 16S pertenecientes a Enterobacter xiangfrangensis, indicando una alta probabilidad de pertenecer a esta especie. Para las secuencias ensambladas de 1350 pb (CB2) y 1363 pb (CB3), los clasificadores RDP y Greengenes determinaron que se trata de secuencias de microorganismos pertenecientes al género Pseudomonas, sin embargo, no fue posible determinar de manera concluyente la especie para el aislamiento CB3, asignándola finalmente como Pseudomonas sp. Por otra parte, al analizar la secuencia de CB3 contra la base de datos refseq/ RNA - NCBI, se obtuvo un 99 % de identidad en el 100 % de la longitud de la secuencia consenso, con secuencias del gen ribosomal 16S pertenecientes a la especie Pseudomonas azotoformans, con un soporte de ramas del 100 %, indicando una alta probabilidad de pertenecer a dicha especie.

Experimentos de remoción en función del tiempo

En los laboratorios de docencia para las asignaturas de Microbiología se producen residuos líquidos provenientes de las tinciones biológicas; desde el año 2012 estos subproductos se colectan, se almacenan y se entregan a una empresa externa para que realice su disposición final apropiadamente. Adicionalmente, durante todo este tiempo se han realizado muestreos puntuales (2012 - 2016) para conocer sus características físicas, químicas y microbiológicas. Como se puede observar en la Tabla 3, la composición de los residuos líquidos varía en cada lote de muestreo, las concentraciones de algunos de ellos fueron altas y no cumplen con la normatividad vigente para Colombia (Ministerio de Ambiente y Desarrollo Sostenible, Resolución 0631 del 2015).

Tabla 3 Caracterización física, química y microbiológica para el agua residual proveniente de tinciones biológicas durante los años 2012 a 2016. 

Tomando como base los resultados de la caracterización de 5 años, se realizó el diseño de un residuo líquido sintético (RLS) que simulara las características de algunos de los parámetros de los residuos reales y permitiera valorar el nuevo consorcio fúngico/bacteriano bajo unas condiciones más controladas.

Al realizar la caracterización inicial de RLS los valores obtenidos fueron: DQO 2719 mg/L, DBO5 345 mg/L, relación de tratabilidad DBO₅/DQO 0.130, unidades de color 3200, SST 1044 mg/L, pH 7.0 y conductividad 1.71 mS/cm. Las poblaciones de bacterias y hongos totales fueron menores a 2.0 unidades logarítmicas. Bajo estas condiciones se determinó con mayor grado de control la capacidad de remoción del consorcio fúngico/bacteriano (T₁), P. ostreatus/T. versicolor (T₂) y el consorcio bacteriano solo (T₃).

Experimentos de remoción en función del tiempo

En la Figura 2A se presenta la remoción de unidades de color expresadas como remoción de color en porcentaje. En relación con el control absoluto (RLS sin inocular los microorganismos) la remoción de color y DQO no superó el 3 % para los dos parámetros y no se detectaron actividades enzimáticas. La remoción de color por adsorción a la biomasa inactiva del consorcio fúngico/ bacteriano, los dos hongos y solo bacterias, no superó el 10 % (datos no mostrados o no graficados) y no se detectaron actividades enzimáticas. Por lo tanto, los tratamientos superaron a los controles y el análisis estadístico solamente se realizó entre los tres tratamientos.

Figura 2 (A) % remoción de unidades de color y (B) % remoción para DQO, para T₁: Consorcio fúngico/bacteriano, T₂: Cocultivo de P. ostreatus /T. versicolor, T₃: Enterobacter xiangfansgensis, Pseudomonas azotoformans, Pseudomonas sp., Bacillus subtilis y Pseudomonas. La letra a, corresponde al mejor tratamiento seguido por las letras b y c ( prueba de Tukey ). Las barras representan la desviación estándar y el promedio de tres replicas. 

Se obtuvieron diferencias significativas entre tratamientos (p<0.0001) determinando que el mejor fue T₁ obteniendo porcentajes del 99 %, seguido por T₂ y T₃ con valores de 93 %, y 49 % a las 96 h de proceso. Para los tratamientos T₁ y T₂, se evidenció una remoción elevada de las unidades de color durante las primeas 24 h (98 % y 72 %) la cual podría relacionarse con la adsorción de los colorantes a la pared celular de P. ostreatus y T. versicolor, ya que el T₃ solamente tenía las cinco bacterias y la remoción a las 24 h fue del 7 %. Las UC de color finales fueron de 15, 111 y 881 UC, respectivamente para T₁, T₂ y T₃ ^.

Dadas las características químicas de los colorantes que son los responsables de las elevadas concentraciones de DQO, la remoción se realizó más lentamente y los porcentajes fueron más bajos si se comparan con la remoción de UC. A las 96 horas, la remoción fue del 70 % y el 55 % para el consorcio fúngico/bacteriano (T₁) y los dos hongos en proporción 1:1 (T₂), respectivamente. Con las bacterias la remoción no superó el 20 % (Figura 2B).

Al realizar una correlación entre decoloración y remoción de DQO se obtuvo un valor positivo y significativo entre las dos variables de respuesta para los tratamientos T₁ y T₂ (p= 0.97, p<0.0001, p= 0.90, p=0.0004, respectivamente). Demostrando que a medida que se modifican los grupos cromóforos, anillos aromáticos y sustituciones alifáticas, la carga contaminante se hace más biodegradable y se favorece la remoción de la DQO. Obteniendo concentraciones finales de DQO de 823 mg/L, 1133 mg/L y 963 mg/L para T₁, T₂ y T₃, respectivamente.

Cuando los microorganismos entraron en contacto con una mezcla de colorantes, lo primero que se evidenció fue un proceso de adsorción el cual fue rápido y posiblemente independiente del metabolismo. El consorcio evaluado en T₁ y los dos hongos en cocultivo (T₂) removieron más eficientemente el color que las bacterias solas (T₃), básicamente porque los hongos se adicionaron en mayor proporción que las bacterias y fueron preparados como una suspensión, esto favoreció que en las primeras horas de proceso se tuvieran mayor cantidad de sitios activos disponibles en la pared fúngica para unirse con los colorantes. Adicionalmente, el pH cercano a la neutralidad (6.5-6.8) permitió que los colorantes catiónicos fueran atraídos a la pared fúngica (grupos amino, carboxilo, entre otros) y posiblemente se unieran por fuerzas de Van der Waals y los puentes de Hidrógeno (^{Morales-Álvarez et al., 2016}; ^{Castillo et al., 2013}; ^{Kurade et al., 2017}).

Una vez se alcanzó el equilibrio de adsorción, los colorantes fueron transformados por las enzimas extracelulares que produjeron los hongos y las bacterias, reflejándose en la remoción de la DQO y color (Figura 2A, B). La remoción obtenida en T₁ y T₂, podría asociarse con la producción de diferentes isoformas de una sola enzima como la lacasa, actividades LiP, MnP y consumo de la glucosa como co sustrato por parte del consorcio. ^{Vijayalakshmidevi y Muthukumar, (2015)}, reportaron al igual que en el presente trabajo que, si bien los microorganismos de forma individual pueden remover eficientemente ciertos compuestos presentes en aguas residuales, los consorcios mejoran significativamente el desempeño de los tratamientos biológicos. En relación con el comportamiento del pH, todos los experimentos iniciaron con un valor de 7.0 y a las 96 h los valores finales fueron 6.19, 5.45 y 5.98 para T₁, T₂ y T₃. La disminución se asoció con la producción de ácidos orgánicos a partir del consumo glucosa y por la biotransformación de los colorantes.

En la Figura 3 se presentan los recuentos expresados como Log10 de UFC/mL para los hongos y las bacterias. En el T₁ el recuento de hongos osciló entre 4.0-7.0 unidades logarítmicas, siendo más bajos que los obtenidos con las bacterias (Figura 3A). Lo que podría atribuirse a la menor velocidad de crecimiento que tienen los hongos, en especial la cepa de T. versicolor la cual al ser cultivada en agar salvado de trigo tuvo una velocidad de 3.3 mm/d siendo 4 veces menor que la de P. ostreatus (12.5 mm/d) (datos no mostrados). En relación con los recuentos de bacterias en T₁ oscilaron entre 4.0 y 14.0 unidades logarítmicas, evidenciando un crecimiento exponencial hasta las 48 horas, posteriormente las poblaciones descendieron hasta finalizar en 10.0 unidades logarítmicas (Figura 3B). Los recuentos de bacterias más elevados se relacionaron con la mayor velocidad de crecimiento y tiempos de duplicación más cortos. Por otro lado, las poblaciones de bacterias fueron más altas en T₁ que en T₃, demostrando que se requiere de la presencia de los hongos ligninolíticos para que se favorezca el crecimiento de las bacterias y los intermediarios producidos por los hongos fueron asimilados con mayor facilidad que los colorantes iniciales.

Figura 3 (A) Recuentos de hongos totales. (B) Recuentos de bacterias totales en reactor de 1L (C) Actividad enzimatica Lacasa (U/ L). (D) Manganeso Peroxidasa (MnP) y (E) Lignino Peroxidasa (LiP) para T₁ Consorcio fúngico bacteriano, T2 Co cultivo de P. ostreatus/ Trametes versicolor T₃ : Esterobacter xiangfangensis, Pseudomonas, Pseudomonas sp. Bacillus subtilis y Pseudomonas fluorrescens. 

Durante los mismos intervalos de muestreo se monitorearon las enzimas lacasa y peroxidasas (Figuras 3C, D, E). En el T₁ la actividad lacasa fue incrementando en función del tiempo hasta obtener un máximo de 75 U/L a las 96 h. Para T₂ la actividad fue más baja que en T₁ y no siguió una tendencia ascendente en función del tiempo (Figura 3C). En relación con las peroxidasas, la actividad MnP se cuantificó en todos los tratamientos, obteniendo los valores más altos en T₁ (205 U/L), seguido por T₂ (36 U/L) y T₃ (7.5 U/L). En ninguno de los tratamientos se evidenció una actividad progresiva lo que podría relacionarse con el mecanismo de acción de estas enzimas sobre los colorantes e intermediarios (Figura 3D). La actividad LiP fue la más baja en todos los tratamientos oscilando entre 0.073-0.63 U/L en T₁, 0.5-1.7 U/L para T₂ y 0.025-2.6 U/L en T₃ (Figura 3E). Al realizar la correlación entre decoloración, remoción de DQO, actividad lacasa, MnP y LiP, se obtuvo una correlación positiva significativa (p=0.81, p<0.0050) entre decoloración, DQO y actividad lacasa para el T₁. Las peroxidasas no tuvieron correlación positiva con la decoloración y remoción de DQO para el T₁ (p=0.345, p<0.56). Demostrando que las enzimas que más influenciaron la decoloración y disminución de DQO fueron las lacasas.

Durante la etapa inicial del proceso pueden participar las enzimas producidas por los hongos como lacasas y peroxidasas, de tal forma que se generen intermediarios más sencillos que pueden ser empleados por las bacterias. Adicionalmente, las bacterias produjeron Manganeso peroxidasa y lignino peroxidasa, enzimas que tienen el mismo mecanismo de acción que las peroxidasas fúngicas. En relación con el posible orden mediante el cual actúa cada enzima, las lacasas han sido reportada como las responsables de oxidar los grupos cromóforos de los colorantes de la familia de los trifenilmetánicos y azóicos, generando intermediarios que actúan como sustratos con bajo potencial redox para las peroxidasas siempre y cuando esté presente el H₂O₂ que actúa como co factor (^{Morales-Álvarez et al., 2016}; ^{Castillo et al., 2013}).