INTRODUCCIÓN
El mango es una de las cinco frutas más consumidas en Colombia, su producción se concentra en el centro y norte del país (Minsalud, 2013). Los departamentos de Cundinamarca y Tolima representan más de la mitad de la producción de mango con una producción conjunta en el año 2018 de 163.918 toneladas, seguidos de los departamentos de Atlántico, Magdalena, Córdoba, Bolívar y Cesar; los cuales superaron individualmente en ese año las 10.000 toneladas anuales (Agronet, 2020).
La antracnosis es la enfermedad más prevalente y con mayor impacto sobre los cultivos de mango en Colombia y en el mundo. Se manifiesta por necrosis o manchas en ramitas, hojas, panículas florales y frutos. En hojas se pueden observar lesiones pequeñas que pueden agrandarse hasta afectar mayores porciones de las hojas. Las ramitas infectadas se tornan de color negro con avance desde la punta hacia la base. En las panículas florales la infección causa una coloración negra y la caída de las flores y frutos que apenas comienzan a formarse. En los frutos, la enfermedad presenta diferente severidad de acuerdo con el estado de desarrollo de los mismos; mientras que los frutos pequeños pueden sufrir momificación, los más grandes presentan manchas levemente hundidas de color pardo a marrón oscuro. La distribución de las manchas en los frutos tiende ser hacia el pedúnculo, en alguno. (Páez 2003; Tovar-Pedraza et al., 2020).
Se creía que C. gloeosporioides era el principal patógeno de la antracnosis del mango y de otras frutas tropicales, principalmente debido al uso de caracteres morfológicos para la identificación, no obstante, luego de análisis de secuencias génicas han encontrado con frecuencia a especies como C. asianum, C. siamense, C. fructicola, C. C. scovillei y C. tropicale (Li et al., 2019; Quintero et al., 2019).
En Colombia, las cosechas de mango presentan perdidas de un 40% debido a la antracnosis producida por Colletotrichum sp (Páez 2003), cuya frecuencia de aparición está relacionada con aspectos climáticos como la temperatura, humedad relativa, y otros factores determinantes (Huerta et al., 2009, Adorno y Soilán 2018).
En este sentido, productos de origen vegetal como los extractos y aceites esenciales provenientes de plantas cítricas y aromáticas se han considerado para el control de hongos fitopatógenos tanto en cosecha como en post-cosecha (Landero-Valenzuela 2016). Esta última etapa es crítica, es por ello que los aceites esenciales con efecto anti-fúngico constituyen una alternativa como componente inhibidor en formulaciones de recubrimientos comestibles diseñados para reducir el deterioro y las infecciones de origen fúngico en la etapa postcosecha (Rimá de Oliverira et al., 2017)
Swinglea glutinosa Merr es una especie vegetal, conocida comúnmente como limón de cerca, perteneciente a la familia Rutaceae y reconocida por su utilización en la formación de cercas vivas (Segovia et al., 2000); además, el extracto de este ornamento ha sido reportada para controlar arvenses (Gil et al., 2010) y algunas enfermedades fúngicas en ciertos cultivos (Hincapié et al., 2017). La presente investigación tiene como objetivo evaluar el efecto antifúngico in vitro del aceite esencial de S. glutinosa sobre hongo fitopatógeno Colletotrichum sp.
MATERIALES Y MÉTODOS
Extracción de aceite esencial (AE) por hidrodestilación
El material vegetal se tomó de una finca en las cercanías de la ciudad de Valledupar (Colombia), con una altitud de 200 m.s.n.m. y temperatura promedio anual de 28 ° C. La extracción de AE se realizó mediante la técnica de hidro-destilación usando un destilador tipo Clevenger con un balón de 4000 mL. Se realizaron 11 destilaciones, cada una con 300 g de exocarpio del fruto de S. glutinosa en 1000 mL de agua, adicionalmente de 6 destilaciones, cada una con 200 g de hojas picadas en 1000 mL de agua. El tiempo de extracción para cada ciclo fue de 2 horas. A partir de la relación entre la cantidad de AE obtenido y la biomasa utilizada se calculó el rendimiento de la destilación (León et al., 2015).
Determinación cromatográfica de la cantidad relativa y los componentes del AE
La composición química volátil (cantidad relativa e identificación tentativa) se contrató como servicio externo. Fue realizado por el Laboratorio de Cromatografía y Espectrometría de Masas (CROM-MASS) de la Universidad Industrial de Santander (UIS). Se realizó según método basado en la Norma ISO 7609-1985 (E): Essential oils - Analysis by gas chromatography on capillary columns - General method, empleando como material de referencia la mezcla certificada de trihalometanos (AccuStandard, New Haven, CT). La preparación de las muestras se llevó a cabo por dilución e inyección directa de los aceites esenciales al equipo cromatográfico. Se utilizó un cromatógrafo de gases AT 6890 Series Plus (Agilent Technologies, Palo Alto, California, EE.UU.), acoplado a un detector selectivo de masas (Agilent Technologies, MSD 5975) operado en el modo de barrido completo de radiofrecuencia (full scan). La columna empleada en el análisis fue DB-5MS (J & W Scientific, Folsom, CA, EE.UU.) [5%-Fenilpoli(dimetilsiloxano), 60 m + 0.25 mm x 0.25 μm]. La inyección se realizó en modo Split (30:1), Viny = 2 μL. La identificación presuntiva de los compuestos registrados en la muestra de aceite esencial, se basó en sus espectros de masas (EI, 70eV); usando las bases de datos de Adams, Wiley y NIST.
Obtención de aislado de Colletotrichum sp. de frutos de mango:
Frutos de mango con antracnosis fueron desinfectados con inmersión en solución de hipoclorito de sodio 1% durante 2 minutos seguido de tres lavados consecutivos con agua destilada estéril. Porciones de 5 mm2 de los bordes de las lesiones del fruto fueron sembrados en placas Petri con medio jugo de verduras V8® y se incubaron a 25 ± 2 °C por un máximo de 8 días (Saldarriaga-Cardona et al., 2008). A partir de micelio de sub-cultivos se obtuvieron suspensiones conidiales, de las cuales se inoculó 1 mL por siembra en profundidad en placas Petri con agar agua () y se incubó a 25 ± 2 °C por 24h. Conidios germinados y bien separados fueron transferidos a placas con medio jugo V8® hasta obtener un cultivo axénico monospórico (Olalde-Lira et al., 2020).
La identificación morfológica de Colletotrichum se realizó teniendo en cuenta las características típicas de este género (Oliveira et al, 2005; Hyde et al., 2009; Weir et al., 2012).
Prueba de patogenicidad
En este paso se determinó la patogenicidad del aislado seleccionado. Frutos de mango variedad "hilaza" sanos y fisiológicamente maduros fueron desinfectados con inmersión en hipoclorito de sodio al 2.5 % durante 2 minutos, seguido del enjuague con agua destilada estéril. Posteriormente se practicaron incisiones de 7 mm en los frutos y se inoculó una suspensión conidial de Colletotrichum sp. con 2,5x105 conidios ml-1 siguiendo la metodología descrita por Rondón et al., (2006). Los frutos se mantuvieron en cámara húmeda por 7 días con la finalidad de confirmar la sintomatología y morfología del hongo en los frutos.
Cuantificación de la actividad antifúngica in vitro del aceite esencial de S. glutinosa sobre Colletotrichum sp.
Inhibición del crecimiento por técnica de dilución en agar:
Inicialmente se obtuvieron placas de agar con diferentes concentraciones de aceite esencial; para ello, a tubos de ensayo con agar jugo V8® estériles y aún líquidos (45°C), se les adicionó AE de S. glutinosa hasta obtener concentraciones finales de 0.3, 1 y 2 % (v/v), inmediatamente se homogenizó, se distribuyó en placas de 9 cm de diámetro y se dejó solidificar y secar en esterilidad.
A cada agar se le realizó un pozo central de 5 mm de diámetro con sacabocados estériles. En cada tratamiento se le añadió al pozo 0.1 mL de una suspensión de conidial con 4x104 conidios mL-1 de Colletotrichum sp. y Tween 80 al 0,01 %. Posteriormente, las cajas se incubaron a 25 ± 2 °C. A los 11 días se midieron dos diámetros perpendiculares de cada colonia en los grupos de tratamientos y grupo control sin AE. Se determinó la acción antifúngica en relación con el grupo control sin AE. (Gemeda et al., 2014; Velásquez 2014). El ensayo se realizó por triplicado.
Cuantificación de la inhibición de germinación de conidios: se utilizó un cultivo de 15 días de crecimiento para la obtención de los conidios; primero se agregó 5 mL Tween 80 al 0,1 % estéril y se esparció con una varilla de vidrio en forma de L. La suspensión se recogió y se centrifugo a 2000 rpm durante 5 minutos; el sobrenadante se descartó y se volvió a centrifugar para obtener una suspensión de esporas más concentrada, luego se realizó recuento de esporas en cámara de Neubauer y se ajustó a 2x105 esporas mL-1 (Gemeda et al., 2014).
En este ensayo se utilizó caldo jugo V8 al 5% clarificado. Para su preparación se centrifugó 10 mL de jugo V8 a 10000 g durante 5 minutos, el sobrenadante se pasó por papel filtro cualitativo número 1, se tomó 5 mL de este caldo clarificado y se adicionaron en 95 mL de agua destilada con 0,1 g de CaCO3 y 0,1 mL de Tween 80. El caldo se esterilizó a 121°C y 15 psi por 1 5 minutos en autoclave.
En matraces estériles de 100mL se dispensaron 5mL de caldo Jugo V8® al 5% clarificado, se adicionó 1mL de la solución de esporas de 2x105 previamente preparada y se añadió aceite esencial hasta obtener concentraciones 2, 4 y 8 μL mL-1. Al control no se le adicionó aceite esencial. Este procedimiento se realizó por triplicado con cada concentración. Los tratamientos se incubaron por 24 horas a 33 °C en un agitador rotatorio a 60 rpm con control de temperatura, posteriormente se realizó recuento de conidios germinado y no germinados en cámara de Neubauer. El porcentaje de inhibición de la germinación de espora se calculó como con la siguiente ecuación:
Dónde: cc es conidios germinados del control y ct es conidios germinados en tratamiento.
Inhibición en Test de microatmósfera: el efecto inhibitorio in vitro de la fase volátil se estimó siguiendo el ensayo de micro-atmósfera descrito por Gwinn et al., (2010) con algunas modificaciones. En el centro de cajas Petri con agar jugo V8® estériles se colocó un disco de agar de 5 mm de diámetro con micelio activo de Colletotrichum sp., seguidamente se invirtieron las cajas y en cada una se adhirió en la parte central de la tapa un disco papel filtro de 5 mm de diámetro impregnado con 20 o 30 μL de aceite esencial de S. glutinosa de acuerdo al tratamiento, con excepción del grupo control (agua destilada). Cada caja fue sellada con una película extensible de PVC para evitar la salida de los vapores del AE e incubada durante 8 días a 25 ±2 °C. La inhibición se estimó basado en las diferencias de los diámetros de la colonia en cada tratamiento y el control. Este procedimiento se realizó por triplicado.
Análisis estadístico
Se utilizó análisis de varianza de una vía (ANOVA; alfa= 0.05) y posterior comparación de medias mediante prueba de Tukey (alfa= 0.05). Finamente se aplicó análisis de regresión lineal para determinar el grado de correlación entre las variables cuantitativas de los ensayos de dilución en agar (crecimiento micelial) y dilución líquida (germinación de esporas). Se utilizó el paquete estadístico Minitab® versión 17.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Rendimiento del proceso de hidrodestilación
El rendimiento de aceite esencial S. glutinosa obtenido por hidro-destilación fue 0.14% a partir de la corteza del fruto y 0.04% de las hojas de la planta. Ambos valores inferiores a los obtenidos por Stashenko et al. (2015), quienes mediante destilación por vapor obtuvieron un rendimiento de 0.75 % con la corteza del fruto y del 0.25% con hojas con la misma especie. A partir de la corteza del fruto y en condiciones similares a las utilizadas en este trabajo, Jaramillo-Colorado et al. (2020), reportaron un rendimiento de 0.53 %, y Bueno-Sánchez et al. (2009), del 0.7 %. Estas diferencias, además de estar influenciadas por el origen de la materia prima y las variables del proceso, se ve afectado por el grosor del exocarpio que es extraído de los frutos, ya que el aceite esencial se encuentra casi exclusivamente en la capa más externa o albedo (Yang et al., 2017).
Determinación cromatográfica de la cantidad relativa y los componentes del AE
En la tabla 1 se muestran los componentes identificados en el aceite esencial de S. glutinosa; en total se identificaron 41 metabolitos secundarios en concentraciones superiores a 0,01 % (ver gráfico 1). Los componentes mayoritarios detectados fueron β-pineno (31,3%), α-pineno (15,1%), germacreno D (14,4%), trans- nerolidol (5,6%) y sabineno (5,4%). Estos resultados son similares a los de Bueno-Sanchez et al. (2009), quienes reportaron β-pineno (49.6%), α-pineno (12%) y sabineno (11.0%) como componentes principales del AE de corteza del fruto de S. glutinosa de la ciudad Bucaramanga (Colombia). No obstante, en otro estudio con material de Bucaramanga, se encontró al sesquiterpeno transnerolidol como componente mayoritario del AE de las hojas (28.42 %) y de la corteza del fruto (19.14 %) de S. glutinosa (Stashenko et al., 2015). Transnerolidol (34.6%) también fue reportado como el componente predominante del AE de la corteza del fruto de S. glutinosa por Jaramillo-Colorado et al. (2020) seguido de nerolidol acetato (9.8%) y los monoterpenos β-pineno (8.5%), α-terpineol (6.5%) y limoneno (5.2%) en materia prima obtenida de Cartagena (Colombia). Estas variaciones pueden atribuirse a condiciones edafo-climáticas, genotipo, estación anual y estado fisiológico de las plantas (Ferhat et al., 2014; Alsohaili, 2018)
Obtención de aislado de Colletotrichum sp. de frutos de mango
Se obtuvo un aislamiento de Colletotrichum sp., el cual presentó inicialmente micelio blanco, que con el tiempo se tornó grisáceo y con aparición de conidios color rosado; microscópicamente se observaron conidios oblongos unicelulares, hialinos con extremos obtusos a redondeados y aparición de espinas negras o setas.
La patogenicidad del hongo aislado fue confirmada. Los frutos inoculados presentaron a partir del cuarto día lesiones café oscuras a negras consistentes con antracnosis (Konsue et al., 2020), mientras que los frutos no inoculados (control) no presentaron signos de la enfermedad.
Evaluación de la actividad antifúngica in vitro del aceite esencial de S. glutinosa, sobre Colletotrichum sp. Evaluación por técnica de dilución en agar: En la imagen 1 se pueden observar cajas representativas de cada tratamiento. Todas las concentraciones de AE evaluadas (0,3% 1% y 2%) mostraron inhibición del crecimiento radial del 31.16 a hasta un máximo de 82.41 % (Tabla 2). De acuerdo al ANOVA se encontraron diferencias significativas entre los diferentes tratamientos (p=0.000). Así mismo, se encontró un r2=0.9244 en el análisis de regresión lineal, lo cual indica una importante correlación entre la inhibición y la concentración del aceite esencial. Previamente se ha reportado que los enantiómeros de los monoterpenos β-pineno y α-pineno, en este caso los componentes mayoritarios del aceite esencial, poseen actividad inhibitoria sobre Colletotrichum gloeosporioides (Hong et al., 2015), así como sobre levaduras como Candida albicans y Cryptococcus neoformans (Rivas et al., 2012). No obstante, no puede atribuirse la inhibición del crecimiento micelial solo a estos dos compuestos, debe tenerse en cuenta que la toxicidad de los AE sobre las células microbianas depende no solo del efecto aislado de los compuestos mayoritarios, sino también de los efectos sinérgicos entre todos sus componentes (Hyldgaard et al., 2012). En general, los componentes de los AE interfieren con la formación de la pared celular, además, debido a su naturaleza lipofílica pueden ingresar en la célula y causar daño en membrana internas (Sil et al., 2020).
Evaluación por Test de inhibición de germinación de esporas: El AE de Swinglea glutinosa inhibió la germinación de las esporas de Colletotrichum sp. en hasta el 100 % a una concentración del 8 μL/mL (Tabla 3). El análisis de regresión lineal arrojó un r-cuadrado de 94,23%, lo que indica una clara correlación entre la concentración de aceite y la inhibición de la germinación de los conidios. Este resultado muestra que se requiere una dosis considerablemente menor para lograr la inhibición completa de la germinación de los conidios de Colletotrichum sp. que para causar la detención completa del crecimiento de micelial; lo que coincide con lo reportado por Hong et al. (2015), y He et al. (2018), estos últimos lograron la inhibición completa de la germinación de C. acutatum con aceite esencial de canela a una concentración de 0.175 μL/mL (v/v), mientras que para el crecimiento micelial se requirió una concentración de 0.200 μL/mL. Duduk et al. (2015), reportaron diferencias incluso mayores al utilizar los AE de canela, tomillo y clavo contra Colletotrichum acutatum; mientras que el efecto fungistático completo sobre el micelio se logró a 667 μl/l en todos los aceites, la fase volátil inhibió completamente la germinación conidial a concentraciones de 1.53, 15.3 y 76.5 μl/l respectivamente. Los mecanismos diferenciales de los AE sobre las conidias y el micelio de Colletotrichum y otros géneros de hongos fitopatógenos no están bien establecidos; no obstante, la capacidad para inhibir la germinación conidial y reducir la formación de apresorios, hacen de los aceites esencial un componente potencialmente valioso en la formulación de recubrimientos post-cosecha de frutas y hortalizas (Rimá de Oliveira et al., 2017).
Evaluación por Test de microatmósfera: los dos volúmenes de AE utilizados (20 y 30 μL/caja, con concentraciones aproximadas de 0.30 y 0.46 μL/cm3) inhibieron el crecimiento radial de Colletotrichum sp. en un 22,97% con respecto al control (Tabla 4). El análisis de varianza y Test de Tukey indicaron que no existen diferencias entre los tratamientos con AE, pero si difieren con respecto al control (p=0.000). Las concentraciones utilizadas no permitieron que luego de 8 días se pudieran detectar diferencias entre las concentraciones utilizadas. Mientras que la dilución en agar garantiza el contacto directo del aceite con las hifas tanto superficiales como las que penetran en el agar, la exposición en microatmósfera afecta mayoritariamente las hifas superficiales o la germinación conidial. Entre los aceites con mayor poder inhibitorio contra Colletotrichum spp. se encuentra la canela común y especies relacionadas; Rabari et al. (2018), por ejemplo, evaluaron 75 aceites esenciales contra C. gloeosporioides utilizando 5 μL por caja, y encontraron mayor diámetro de inhibición con los AE de cassia (Cinnamomum cassia) y canela común (Cinnamomum zeylanicum);Duduk et al. (2015), con tres AE (canela, tomillo y clavo) lograran mayor inhibición de C. acutatum a concentraciones menores a las utilizadas en este estudio.
CONCLUSIONES
α-pineno y β-pineno son componentes mayoritarios (46,4 %) del aceite esencial en este estudio, los cuales han sido reportados por su efecto antifúngico. El aceite esencial de Swinglea glutinosa inhibió a Colletotrichum sp. en función de la concentración. Se logró una inhibición máxima del 82.41 % del crecimiento micelial y la inhibición completa de la germinación de esporas de Colletotrichum sp en medio líquido.