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INTRODUCCIÓN
La estimulación cerebral profunda (deep brain stimulation) es una de las técnicas de mayor desarrollo y potencial en los últimos años para el tratamiento futuro de diversas condiciones clínicas neurológicas y neuropsiquiátricas, incluyendo la enfermedad de Parkinson (Arocho-Quinones, Hammer, Bock & Pahapill, 2017; Birchall et al., 2017; Borgonovo et al., 2017; Fukaya et al., 2017), las distonías y diskinesias (Almeida et al., 2017; Cif & Coubes, 2017; Kim, Chang, Jung & Chang, 2015; Lumsden, Kaminska, Ashkan, Selway & Lin, 2017; Ostrem et al., 2017; Toda, Saiki, Nishida & Iwasaki, 2016), la epilepsia (Cukiert & Lehtimaki, 2017; Dalkilic, 2017; Klinger & Mittal, 2016; Krishna, Sammartino, King, So & Wennberg, 2016), el trastorno obsesivo compulsivo (Choudhury, Davidson, Viswanathan & Strutt, 2017; Coenen et al., 2016; Dell'Osso, Cremaschi, Oldani & Carlo, 2017; Mulders et al., 2016; Sturm et al., 2003), la ansiedad (Bewernick et al., 2010; Castelli et al., 2006; Chang et al., 2012; Clark et al., 2009), la agresividad (Faria, 2013; Golden et al., 2016; Harat, Rudas, Zielinski, Birska & Sokal, 2015; Howland, 2013), el dolor crónico (Boadas-Vaello, Homs, Reina, Carrera & Verdu, 2017; Li et al., 2017; Plotkin, 1982; Ray & Burton, 1980), la obesidad (Dupre, Tomycz, Oh & Whiting, 2015), la depresión (Accolla et al., 2016; Bergfeld et al., 2016; Bewernick et al., 2017; Birchall et al., 2017; Sourani, Eitan, Gordon & Goelman, 2012) y la esquizofrenia (Agarwal, Sarris, Herschman, Agarwal & Mammis, 2016; Bakay, 2009; Nicolaidis, 2017; Salgado-Lopez et al., 2016), entre otras.
Los orígenes de la estimulación cerebral se remontan posiblemente al año 46 de nuestra era, cuando Scribonius Largus propuso colocar peces eléctricos (Torpedo nobiliana) en la cabeza de pacientes con migraña y epilepsia (Schwalb & Hamani, 2008). Pero fue a finales del siglo XIX cuando Gustav Fritsch y Eduard Hitzig dieron inicio a la era de la estimulación eléctrica cerebral, al provocar contracciones musculares en perros anestesiados como consecuencia de la estimulación eléctrica de la corteza cerebral. Igualmente conocidos son los trabajos desarrollados a mediados del siglo XX por Wilder Penfield en humanos, los cuales llevaron al desarrollo de los mapas de representación motriz y sensorial en el córtex cerebral y que, sin lugar a dudas, constituyeron la piedra inicial para la actual estimulación cerebral profunda (Murrow, 2014).
En la actualidad, el primer reporte de uso de estimulación eléctrica cerebral en la edad moderna con fines terapéuticos proviene del trabajo de Lawrence Pool en 1948, quien trató exitosamente síntomas de depresión y anorexia en una paciente con enfermedad de Parkinson mediante el implante de un electrodo en el núcleo caudado (Rosenow, Mogilnert, Ahmed & Rezai, 2004). Pero, posteriormente, a partir de mediados del siglo XX, la concientización sobre los graves efectos secundarios asociados a los tratamientos farmacológicos, tales como el L-Dopa, el avance tecnológico y el conocimiento en la fisiología de los ganglios basales (impulsado en gran medida por el estudio de modelos animales), fomentaron el uso extendido de la estimulación cerebral profunda para el tratamiento del Parkinson y de otros problemas motores asociados (Roth, Flashman, Saykin & Roberts, 2001; Schwalb & Hamani, 2008).
Otra de las áreas terapéuticas que se ha beneficiado por el uso de la estimulación eléctrica profunda, distinta al tratamiento de la sintomatología motriz, es el control del dolor crónico (Boccard, Pereira & Aziz, 2015; Cruccu et al., 2016; Schwalb & Hamani, 2008). Sin embargo, pese a la amplia difusión de la técnica, aún no son claros los mecanismos por los cuales funciona; y a pesar de que se ha encontrado que la estimulación de alta frecuencia puede tener un efecto superior a la de baja frecuencia, no es claro si el efecto se da por la depleción del neurotransmisor -asociada a la inducción de una alta tasa de disparo- o por el solo aumento de la liberación tónica de neurotransmisor. De hecho, la neurocirugía para el implante de electrodos de estimulación cerebral profunda se realiza con el paciente despierto, de forma tal que la efectividad de la estimulación se evalúa ajustando para cada caso los mejores parámetros de frecuencia, intensidad e intervalo inter-impulso. Y hasta donde se conoce, tampoco se han investigado sistemáticamente los efectos neurobiológicos a largo plazo sobre procesos como la up-regulation o la down-regulation de receptores, ni los cambios plásticos asociados al aumento (o disminución) de la actividad neuronal o posibles lesiones asociadas a los cambios de la dinámica sináptica en diferentes regiones del cerebro (Udupa & Chen, 2015). Teniendo esto en cuenta, los estudios que permitan determinar los mecanismos por los cuales la estimulación cerebral profunda ejerce sus efectos se hacen completamente necesarios.
Por otra parte, utilizando la técnica de lesión electrolítica como herramienta para determinar el papel de diferentes estructuras en determinados comportamientos se ha demostrado que las lesiones de la habénula alteran diversos procesos, principalmente emocionales y comportamentales, como el procesamiento emocional del dolor (Li et al., 2017; Margolis & Fields, 2016; Shelton, Becerra & Borsook, 2012), las situaciones de refuerzo (Baker, Raynor, Francis & Mizumori, 2017; Borsook et al., 2016; Jean-Richard Dit & McNally, 2014), el proceso de plasticidad sináptica -en un protocolo de depresión a largo plazo- (Lecourtier et al., 2006) e, incluso, la emergencia de comportamientos relacionados con la adicción (Baldwin, Alanis & Salas, 2011; Lecca, Meye & Mameli, 2014; Velasquez, Molfese & Salas, 2014; Yadid, Gispan & Lax, 2013).
Uno de los primeros hallazgos en el estudio de lesiones habenulares indicó que la lesión de algunas vías eferentes de la habénula (principalmente, el fascículo retroflexo) ocasiona un aumento de ansiedad y locomotricidad en ratas, así como un incremento de los niveles plasmáticos de corticosterona y los comportamientos de acicalamiento (Murphy, DiCamillo, Haun & Murray, 1996). Igualmente, resulta interesante que tras la lesión habenular se pierde la capacidad de reaccionar adecuadamente al estrés -aunque algunos autores han encontrado resultados contradictorios-(Amat et al., 2001; Hennigan, D'Ardenne & McClure, 2015; Thornton & Bradbury, 1989). Sin embargo, los resultados aparentemente contradictorios podrían explicarse si se toma en consideración que la habénula posee un rol importante en la evaluación de las posibilidades de refuerzo de diversos estímulos (Bromberg-Martin & Hikosaka, 2011), y porque, de hecho, la activación de la habénula conduce a cambios en la actividad dopaminérgica y serotoninérgica (Yang, Hu, Xia, Zhang & Zhao, 2008), por lo que la activación diferencial de cada uno de esos sistemas podría darse en función de su patrón de actividad.
Con respecto a la ansiedad, se ha demostrado que la inactivación de la habénula ocasiona una reducción de los niveles de ansiedad en el laberinto en cruz elevado (Gill, Ghee, Harper & See, 2013), pero hasta la fecha no se tienen reportes del efecto del incremento de la actividad habenular sobre este tipo de comportamientos. Así, teniendo lo anterior en cuenta, el objetivo de este trabajo fue determinar si diferentes patrones de estimulación de la habénula lateral conducen a alteraciones en la expresión de comportamientos asociados a la ansiedad y la locomotricidad.
Para tal fin, y buscando la realización de un estudio sistemático, se seleccionaron dos parámetros de análisis: la frecuencia y la intensidad de la estimulación. Y cada uno de estos, teniendo en cuenta reportes previos sobre estimulación cerebral profunda (Arocho-Quinones et al., 2017; Kim et al., 2016; Li et al., 2016), fue dividido en dos niveles: (a) frecuencia: alto y bajo, con un punto de corte de 150 Hz; y (b) intensidad: alto y bajo, con un punto de corte de 100 uA (Yeomans, 1990).
MÉTODO
Diseño
Se utilizó un diseño experimental con cuatro grupos experimentales y un grupo control, sin medidas repetidas. Los grupos experimentales recibieron estimulación eléctrica cerebral profunda unilateral en la habénula, con variación en la intensidad -baja (10-80 pA) o alta (120-260 pA)- y en la frecuencia -baja (80-150 Hz) o alta (240-380 Hz)-.
Sujetos
Se utilizaron 26 ratas Wistar machos, con pesos entre 250 y 350 g, provenientes de una colonia exocriada del Charles River Institute, mantenidas en el Laboratorio de Neurociencia y Comportamiento de la Universidad de los Andes. Los animales se alojaron en cajas hogar en condiciones controladas de iluminación (ciclo luz-oscuridad de 12:12 h; luz iniciada a las 05:00 p. m.), temperatura (23 °C ± 2), humedad relativa mantenida al 57 %, con libre acceso a agua y comida durante todo el experimento y con atenuación de sonidos externos. Todos los sujetos experimentales fueron manipulados durante diez minutos al día desde tres días antes del inicio de los experimentos con el fin de familiarizarlos con el experimentador, los procesos y las salas experimentales.
Aparatos
Estimulación cerebral profunda. Para la estimulación cerebral se utilizó un estimulador de pulsos S88X (GRASS) con cuatro parámetros de control de pulso (frecuencia, duración, repetitividad en trenes e intervalo inter-impulso) para dos salidas independientes de estimulación por corriente.
Laberinto en cruz elevado. Para evaluar los niveles de ansiedad de los animales se utilizó el laberinto en cruz elevado, un artefacto de madera con dos brazos de 1 m cruzados perpendicularmente entre sí, dos de ellos encerrados por paredes de 50 cm de altura (brazos cerrados) y dos descubiertos (brazos abiertos), con un borde de 1 cm de altura para evitar la caída de los animales. El aparato completo se encuentra elevado a una altura de 50 cm del suelo. Los experimentos fueron grabados y digitalizados para su posterior análisis. Para el registro comportamental, cada brazo fue dividido virtualmente en cuadrados de 10 cm.
Campo abierto. El campo abierto consiste en una caja cúbica de acrílico obscuro de 60 cm de lado, sin la tapa superior. Los experimentos fueron grabados y digitalizados para su posterior registro. Para el registro comportamental, el piso del campo abierto fue virtualmente dividido en cuadrados de 10 cm de lado.
Procedimiento
Los sujetos fueron asignados aleatoriamente a uno de cinco grupos para recibir estimulación cerebral profunda en la habénula con diferentes parámetros de frecuencia y de intensidad. Las características de estimulación de los grupos comprendían intensidades bajas (10-80 μA) y altas (120-260 μA), y frecuencias bajas (80-150 Hz) y altas (240-380 Hz). De esa forma, se conformaron grupos de baja intensidad y baja frecuencia (BIBF, n = 5), alta intensidad y baja frecuencia (AIBF, n = 5), baja intensidad y alta frecuencia (BIAF, n = 5), alta intensidad y alta frecuencia (AIAF, n = 5), y un grupo control (n = 6) sometido a los mismos procedimientos, pero sin recibir ningún tipo de estimulación. En la Tabla 1 se presenta la asignación de sujetos.
Para la estimulación eléctrica crónica de la habénula se colocaron electrodos intracerebrales mediante cirugía estereotáxica tradicional. En detalle, los animales fueron anestesiados con una inyección intraperitoneal de pentobarbital (Penthal, 64.8 mg/kg) y puestos en un aparato estereotáxico, como anestésico local se aplicó lidocaína (2 %). Durante toda la cirugía se monitorearon los signos vitales y se mantuvo la temperatura con una manta térmica. Se retiró el cuero cabelludo y con la ayuda de un motortool se abrió un agujero de 0.5 mm en el cráneo expuesto, a través del cual se insertó unilateralmente el electrodo, con una inclinación de 20 °. La ubicación final del electrodo fue: AP: -3.6 mm, ML: 0.7 mm y DV: 5.0 mm, de acuerdo con el atlas de Paxinos y Watson (2006), tomando el punto bregma como referencia. El electrodo fue fijado al cráneo por medio de dos tornillos de anclaje y acrílico dental. Terminada la cirugía, los animales recibieron tratamiento con antiinflamatorio/analgésico (Meloxicám, 1 mg/kg) y antibiótico (Enrofloxacina, 10 mg/kg). Todos los animales tuvieron un período de recuperación de seis días después de la cirugía.
Para la realización de la estimulación, cada animal era retirado de su caja hábitat y colocado en la caja de estimulación. Luego de un periodo de familiarización de un minuto, se iniciaba la estimulación a la combinación de frecuencia e intensidad previamente asignada al sujeto, dependiendo del grupo al cual correspondía. La estimulación tenía una duración de 15 minutos continuos por día y fue realizada durante tres días consecutivos. Veinticuatro horas después de la última estimulación, los animales fueron transportados a las salas experimentales para su valoración comportamental. Debido a la gran sensibilidad del laberinto en cruz elevado para cambios del estado de ansiedad de los animales, esta prueba fue realizada siempre antes del campo abierto. En la Figura 1 se presenta un esquema del procedimiento realizado.
En la fase de evaluación comportamental, cada animal fue colocado en el cuadrado central del laberinto, con el hocico dirigido hacia uno de los brazos cerrados, y se le permitió explorar libremente durante cinco minutos. Durante este periodo, se cuantificó el número de entradas y tiempo de permanencia en cada tipo de brazo y en el área central. Se registraron, además, las frecuencias y tiempos de duración de comportamientos, como el levantarse, el estiramiento y el mirar hacia abajo -por el borde de los brazos abiertos-.
Finalizado el tiempo de exploración en el laberinto en cruz elevado, el animal fue llevado a otra sala experimental para su evaluación en el campo abierto. Luego, se ubicó a cada sujeto en el centro del campo de cara a una de las paredes del mismo y se permitió que explorara libremente durante cinco minutos. Se contabilizó el tiempo que permanecía en la periferia (definida como un corredor de 10 cm de ancho desde cualquiera de las paredes) y en el centro del campo. Siempre, después de finalizar la exploración de cada animal en cada test comportamental, el aparato fue limpiado con alcohol al 10 % para evitar pistas olfativas.
Finalizada la evaluación comportamental, los animales fueron anestesiados con una mezcla de ketamina/xilacina (90 mg/kg + 10 mg/kg) y perfundidos vía transcardiaca con 300 ml de solución salina (0.9 %), seguida por 300 ml de paraformaldehido (4 %). Finalmente, los cerebros fueron extraídos, almacenados en paraformaldehido (4 %) durante cuatro días y procesados para su uso histológico con el fin de verificar la ubicación de los electrodos, para lo cual se realizaron cortes coronales de 30 μηι de grosor en un vibrátomo (VIBRATOME 1500). Estos cortes fueron posteriormente marcados con coloración de Nissl por violeta de cresil. Los datos correspondientes a los animales que mostraron ubicaciones del punto de estimulación diferentes a la deseada fueron retirados del estudio.
Consideraciones éticas
Todos los procedimientos realizados en este trabajo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (CICUAL) de la Universidad de los Andes y estuvieron en consonancia con las normas éticas y legales exigidas para la investigación con animales de laboratorio en Colombia (Ley 84 de 1989 y Resolución No. 8430 de 1993 del Ministerio de Salud). Adicionalmente, se respetaron los acuerdos de la declaración universal de los derechos de los animales, proclamada por la Liga Internacional de los Derechos del Animal, Ginebra, Suiza (1989), y los principios éticos de la experimentación animal enunciados por el International Council for Laboratory Animal Science (ICLAS).
Análisis de datos
Los tests de normalidad (Shapiro-Wilk) fueron aprobados para todas las mediciones, lo cual permitió la realización de un Análisis de Varianza de una vía. Cuando fue necesario, se realizó el análisis post hoc, utilizando la prueba de Tukey. En todos los casos, se estableció un alfa de .05.
RESULTADOS
A continuación, se presentan los resultados del estudio, iniciando con los hallazgos histológicos, y luego con los comportamentales tanto emocionales como de motricidad.
Histología
En la Figura 2 se muestra la ubicación de los electrodos. Los animales que tuvieron electrodos en lugares diferentes al deseado fueron retirados del experimento.
Laberinto en cruz elevado
Con respecto al número de entradas a los brazos abiertos, el ANOVA mostró diferencias significativas entre los efectos de los tipos de estimulación (F[421] = 6.71; p < .001); y la comparación post hoc de las medias de los grupos (Tukey) evidenció que los animales del grupo BIAF entraron más a los brazos abiertos del laberinto que los animales de los grupos AIBF y BIBF (p < .05). No se encontró efecto sobre la cantidad de entradas a los brazos cerrados (Figura 3-B), (F[4,21] = .91; p = .475).
Figura 3 (A) Entradas a los brazos abiertos del laberinto en cruz elevado. (B) Entradas a los brazos cerrados. (C) Porcentaje de tiempo de permanencia en los brazos abiertos. (D) Distancia total recorrida dentro del brazo abierto. (*) diferencia con respecto al grupo BIAF. p < .05.
Con respecto al porcentaje de entradas a los brazos abiertos (Figura 3-A), el ANOVA mostró diferencias significativas entre los efectos de la estimulación (F[421] = 3.06; p = .039); y la comparación post hoc de las medias de los grupos (Tukey) evidenció que los animales del grupo BIAF entraron más a los brazos abiertos del laberinto que los animales de los grupos AIBF (p < .05).
Adicionalmente, el ANOVA mostró un efecto de la estimulación sobre el porcentaje de tiempo de permanencia en los brazos abiertos (F[421] = 4.43; p = .01, véase Figura 3-C); y la comparación post hoc de las medias de los grupos (Tukey) mostró que los animales del grupo BIAF permanecieron más en los brazos abiertos del laberinto que los animales de los grupos AIBF y BIBF (p < .05). Con respecto a la distancia toral recorrida dentro del brazo abierto (Figura 3-D), el ANOVA evidenció un efecto significativo de la estimulación (F[421] = 4.88; p = .01); y la comparación post hoc de las medias de los grupos mostró que los animales del grupo BIAF recorrieron mayor distancia que los animales de los grupos AIBF y BIBF (p < .05) (véase Tabla 2 para los resultados estadísticos de todas las medidas).
Tabla 2 Resultados estadísticos para los comportamientos en el laberinto en cruz elevado
| Comportamiento | F[4,21] | p |
| Entradas brazo abierto | 6.709 | < .001* |
| Porcentaje de entradas al brazo abierto | 3.058 | .039* |
| Porcentaje de tiempo en brazo abierto | 4.430 | .009* |
| Distancia recorrida en brazo abierto | 4.880 | .006* |
| Entradas brazo cerrado | 0.912 | .475 |
| Porcentaje de tiempo en brazo cerrado | 4.430 | .009* |
| Distancia recorrida en brazo cerrado | 0.590 | .672 |
| Porcentaje de tiempo en el centro | 2.420 | .080 |
| Tiempo de acicalamiento | 1.191 | .343 |
Campo abierto
La ejecución de los diferentes sujetos en el campo abierto mostró que no hubo diferencias significativas en la locomoción -medida en términos de la distancia total recorrida a partir del número total de cruzamientos realizados- (F[421] = .57; p = .642); y tampoco se encontraron diferencias significativas para el porcentaje de tiempo de permanencia en el centro ni para el tiempo empleado en acicalamiento (F[421] = .87; p = .501, F[421] = 1.44; p = .26, respectivamente) (véase Figura 4 y Tabla 3 para los resultados estadísticos de todas las medidas).
Figura 4 (A) Porcentaje de permanencia en el área central del campo abierto. (B) Tiempo de limpieza en el campo abierto.
Tabla 3 Resultados estadísticos para los comportamientos en el campo abierto
| Comportamiento | F[4,21] | p |
| Entradas área central | 0.853 | .051 |
| Distancia total recorrida | 0.569 | .642 |
| Porcentaje de tiempo en área central | 0.867 | .501 |
| Cantidad de levantamientos | 1.528 | .232 |
| Tiempo de levantamiento | 1.517 | .235 |
| Frecuencia de acicalamiento | 0.590 | .674 |
| Tiempo de acicalamiento | 1.440 | .257 |
| Frecuencia de congelamiento | 0.570 | .688 |
| Tiempo de congelamiento | 0.365 | .831 |
DISCUSIÓN
En el presente estudio se evaluó el efecto de la estimulación eléctrica de la habénula lateral sub-crónica sobre los niveles de ansiedad y la respuesta locomotriz en ratas Wistar. Luego de la estimulación eléctrica de la habénula lateral por quince minutos durante tres días, se hizo una evaluación en el laberinto en cruz elevado y en un campo abierto.
La habénula lateral ha sido vinculada con numerosos procesos emocionales y cognitivos, pero a pesar de que en diversos estudios se ha utilizado la estimulación eléctrica de esta estructura como metodología, aún no hay consenso sobre el tipo de estimulación más efectiva (Baker et al., 2016; Baker, Oh, Kidder & Mizumori, 2015; Chan et al., 2017; Hikosaka, Sesack, Lecourtier & Shepard, 2008; Hong & Hikosaka, 2008; Lecourtier, Neijt & Kelly, 2004; Moreines, Owrutsky & Grace, 2017; Ootsuka & Mohammed, 2015; Zhao, Zhang, Yang & Rusak, 2015). Por ejemplo, algunos autores, como Li et al. (2016; 2017), reportan resultados positivos con estimulación eléctrica a una frecuencia de 130 Hz y 150 μA de intensidad (equivalente al grupo AIBF en este estudio), en tanto que, con frecuencias menores (como de 80 Hz), no encuentran estos resultados a la misma intensidad (equivalente al mismo grupo en este trabajo).
En este sentido, los resultados expuestos indican que la estimulación eléctrica de la habénula a alta frecuencia (240-380 Hz) induce claros efectos comportamentales al disminuir las respuestas de ansiedad en el laberinto en cruz elevado, y que la estimulación de la misma estructura con bajas frecuencias (80-150 Hz) no induce cambios significativos. Estos datos contrastan con los reportes de Heldt y Ressler (2006) y de Gill et al. (2013), quienes describieron cambios emocionales asociados con lesiones de la habénula, en donde mencionan la reducción de las respuestas de ansiedad en ratas con inactivación de la habénula. Sus resultados, pese a utilizar otra metodología de estudio, permiten determinar que la habénula tiene un rol importante en la generación y expresión de reacciones emocionales. Tal vez la estimulación a la que fueron sometidos los animales del presente estudio ocasionó un efecto inhibitorio sobre las eferencias habenulares, ya sea por un fenómeno de depleción de neurotransmisores o por disminución en la expresión de receptores en las estructuras postsinápticas. Desafortunadamente, estos resultados no permiten determinar el mecanismo causante de dicho efecto.
Por otra parte, Song et al. (2017) reportaron recientemente que la lesión completa de la habénula lateral facilita el aprendizaje de la respuesta de evitación activa y la extinción del miedo, datos que parecerían ir en contra de los hallazgos de este estudio; sin embargo, podría proponerse que la estimulación realizada en la habénula posea efectos a largo plazo (quizá mediados por procesos de desensibilización de receptores en estructuras diana) o bien que la estimulación realizada genere un estado de "fatiga" neuronal (posiblemente por depleción de neurotransmisores) que permanece por algunos minutos después de finalizada la estimulación, y que simularía el efecto de la lesión realizada por Song et al. (2017). En cualquier caso, se requiere de la realización de nuevos experimentos para determinar el mecanismo en cuestión.
Los hallazgos reportados, inducidos por la estimulación de la habénula, parecen estar restringidos a la esfera emocional, pues no se encontraron cambios en la función motriz, evaluada tanto en el laberinto en cruz elevado mediante el análisis de la distancia total recorrida en el brazo cerrado, como en el campo abierto. En este sentido, los datos están en consonancia con los reportados por varios autores con respecto a aumentos de la función motriz asociados a lesiones de la habénula (Han, Jin, Song, Wang & Zhao, 2014; Murphy et al., 1996; Wickens & Thornton, 1996). Adicionalmente, no se encontraron alteraciones en el comportamiento de acicalamiento en el laberinto en cruz elevado ni en el campo abierto, a pesar de que, de acuerdo con los hallazgos de Murphy et al. (1996), se esperaría una disminución de los mismos.
Por otra parte, existen numerosos reportes que correlacionan cambios en los niveles cerebrales de serotonina (principalmente en la amígdala y en el córtex prefrontal) con un aumento de las respuestas de tipo ansioso en el laberinto en cruz elevado (Andersen & Teicher, 1999; Dos, de Andrade & Graeff, 2010; Faria et al., 2006; John & Currie, 2012; Lin & Parsons, 2002; Maisonnette, Morato & Brandao, 1993; Moraes, Bertoglio & Carobrez, 2008; Motta, Maisonnette, Morato, Castrechini & Brandao, 1992; Setem, Pinheiro, Motta, Morato & Cruz, 1999), pero, debido a que la activación de la habénula posee un efecto facilitador sobre la liberación de serotonina (Lim et al., 2015; Pobbe & Zangrossi, 2010; Rolls, 2017; Vadovicova, 2014; Yang et al., 2008), sería factible suponer que el efecto de aumento del tiempo de permanencia en los brazos abiertos del laberinto en cruz elevado, así como el aumento de la distancia total recorrida dentro de ese mismo tipo de brazos, sea un efecto de adaptación mediado por serotonina.
Finalmente, pese a no haber encontrado diferencias significativas con relación al grupo control, es evidente que los grupos que recibieron estimulación de baja frecuencia mostraron una marcada disminución en la exploración del brazo abierto en términos del porcentaje de permanencia (x [CTR] = 16.7; x [BIBF] = 6.2; x [AIBF] = 3.6), número de entradas (x [CTR] = 4.0; x [BIBF] = 1.2; x [AIBF] = 1.6) y distancia total recorrida en ellos (x [CTR ] = 21.7; x [BIBF] = 3.6; x [AIBF] = 5.0). Para futuras investigaciones se recomienda la exploración de frecuencias menores con el fin de confirmar si podrían aumentar tales diferencias y constituir un posible efecto ansiogénico.
