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Introducción
Cuando la Asamblea Mundial de la Salud (1988) declaró su compromiso con la erradicación y se formó la Iniciativa de Erradicación Mundial de la Poliomielitis (IEMP) en pos de este objetivo, se registraron 350 000 casos anuales de (virus polio salvaje) WPV en 125 países. Los logros de la IEMP son eviden tes no solo en el retiro de WPV en diferentes rincones geo gráficos del mundo, sino también en la eliminación sucesiva de tipos de WPV. En el 2012 WPV no se volvió a presentar, el WPV1 no ha desaparecido, pero su incidencia se ha reducido en más del 90%; para el año 2015 el WPV tipo 2 fue declara do erradicado. Y en octubre de 2018 se logró la certificación mundial de erradicación del poliovirus salvaje tipo 3 (WPV3)1.
El desarrollo del programa de erradicación de la poliomielitis, se llevo a cabo con el apoyo de la vigilancia ambiental en todo el mundo, permitiendo confirmar la desaparición del poliovirus salvaje o poliovirus derivado de la vacuna. Esta vi gilancia ambiental ha demostrado ser un método eficiente y sensible para la detección de virus que teóricamente detec tan una persona infectada de cada 10.000 personas usando como muestra las aguas residuales2.
Colombia, por su posición geográfica, se ha convertido en ruta para todo aquel migrante que busca llegar ha Sudamérica, Centro o Norteamérica. Según Migración Colombia, alrededor de 34.000 migrantes irregulares fueron detectados en dife rentes zonas del territorio nacional durante el año 2016. Los extranjeros, provenientes en su gran mayoría de Haití (20.366), Cuba (8.167), India (874), Congo (570) y Nepal (553), fueron ubicados principalmente en los departamentos de Antioquia, Nariño y Valle del Cauca. Estos departamentos son los más importantes corredores viales utilizados por migrantes irregu lares y por las redes dedicadas al tráfico de estas personas. Las rutas que se han identificado utilizan como puntos de entrada los departamentos de Putumayo y Amazonas, hacen tránsito por el departamento del Valle del Cauca y tienen como obje tivo final el municipio de Turbo, en el departamento de Antio quia, de donde continúan hacia Centroamérica3. Así mismo, la comisión de Certificación Regional en el mes de julio de 2019, actualizó la evaluación del riesgo ante la importación de ree mergencia de brotes por virus polio; tres países del continente se catalogan como de alto riesgo (Guatemala, Haití y Vene zuela); pese a que Colombia se cataloga en bajo riesgo, el alto flujo de migrantes derivados del país fronterizo el cual reporto flujo migratorio regular de 263.331 ciudadanos venezolanos e irregular de 153.000 ciudadanos para el año 20174. Para el año 2018 la migración fue de más de 174.000 venezolanos y para el 2019 el Ministerio de Relaciones Exteriores presenta la cifra de más de 1.825.000 venezolanos en el país5; entre estos niños menores de 5 años que son susceptibles al ingresar al país con esquemas de vacunación incompletos para la edad6.
Desde el último caso de poliovirus salvaje en el municipio de Arjona (Bolivar) en 1991; el país se ha mantenido libre de la circulación de este virus durante 30 años. Para septiembre de 2019 la OMS determinó que dado el riesgo de transmisión internacional de poliovirus, de debe mantener el estatus de “Emergencia de Salud Pública de Importancia Internacional (ESSPII)” para esta enfermedad7. Por lo anteriormente expues to, debe considerarse la posibilidad de reintroducción del vi rus en Colombia debido a su condición de país receptor y de tránsito de población flotante, de migrantes irregulares, indo cumentados, desplazados que provienen de paises con bajas coberturas de vacunación o coberturas que no han sido divul gadas, e incluso de países en los que aún persiste el poliovirus de tipo salvaje. La detección de la importación de poliovirus, la transmisión posterior y la interrupción de las cadenas de transmisión requieren un alto nivel de integración de múl tiples estrategias de vigilancia entre ellas la ambiental. Deri vado de lo anterior, el presente estudio realizó una vigilancia ambiental en aguas residuales, con el objetivo de determinar la circulación de poliovirus en tres municipios considerados como punto transitorio de migrantes en Colombia.
Materiales y métodos
Para determinar la presencia de poliovirus en muestras de aguas residuales en los municipios se realizó un estudio ex ploratorio transversal, entre los años 2017-2019. La selec ción de los sitios de muestreo se realizó sobre la base de los municipios por los cuales ingresa la mayor población de migrantes regulares e irregulares : Cali (Valle del Cauca) con una población censada de 3.789.874 habitantes8, zona de tránsito de migrantes provenientes del sur del país; Cúcuta (Norte de Santander) con una población de 668.838 9, zona de tránsito de la frontera con Venezuela, y Turbo (Antioquia) con una población de 252.837 personas10; este municipio se encuentra ubicado en la única región costera de Antioquia por lo que se convierte en la salida del departamento al mar y zona de tránsito hacia el departamento del Chocó, con des tino Panamá.
Para la obtención de la muestra en cada municipio, se ubi caron los puntos de recolección en los sitios finales de las descargas de alcantarillado, de aguas circundantes o de los receptores de vertederos de aguas residuales las cuales se tomaron de manera seriada, cada tres o cuatro meses entre los años 2017-2019 con el fin de encontrar mayores posibi lidades de concentración viral en las aguas circulantes. Los sitios determinados para la toma de las muestras fueron las siguientes: Cali: planta de tratamiento de aguas residuales (PETAR, n=12); Turbo (Antioquía): estación de bombeo, Ebar, ciudadela Bolívar (n=12) ; Cúcuta : Caño Picho, el Rodeo, Cor moranes (n=12) (Figura 1).
Toma de muestras en aguas residuales
Las muestras fueron obtenidas directamente de los puntos de colección, en recipientes plásticos nuevos de 500 ml, rotu lados y transportados en cadena de frío 4º C hasta el labora torio del Centro de Investigaciones Biomédicas de la Univer sidad del Quindío. Una vez en el laboratorio, se procesaron dentro de las primeras 48 horas de la recolección. Aquellas que no se procesaron dentro de este intervalo fueron con servadas a -20 ◦C. El muestreo se llevó a cabo de acuerdo con los procedimientos de buenas prácticas para proteger al responsable de tomar las muestras o prevenir la contami nación cruzada entre ellas, donde se hizo la recuperación y concentración de los virus.
Concentración de partículas virales
Las aguas residuales colectadas fueron procesadas mediante el “método de separación de dos fases”, recomendado por la OMS, que se basa en el empleo de un volumen de 500 ml colectado a partir de un litro de aguas residuales11.
Determinación de la presencia de poliovirus
Se emplearon las líneas celulares RD (ATCC® CCL-136™) y L20B (National Institute for Biologicals Standards and Control [NIBSC], UK), siguiendo los procedimientos generales reco mendados por la OMS para el diagnóstico de EV - poliovirus5, (Figura 2).
La inoculación de las células se efectuó en cabina de flujo laminar clase II, tomando un criovial de 2 ml de las muestras almacenadas a -20 ºC, para descongelarlo de forma progre siva. Se sembraron 80.000 células L20B y RD por pozo so bre placas de 24 pozos, en medio MEM suplementado con suero fetal bovino (SFB) al 10%, HEPES al 1%, bicarbonato de sodio al 2%, aminoácidos esenciales al 1% y antibiótico/ antimicótico al 2%. Posteriormente se incubaron a 37°C con 5% de CO2 hasta que alcanzaron una confluencia entre el 80 y 90 %. Las muestras concentradas se inocularon a razón de 200 μL por pozo en los sistemas celulares anteriores, previo cambio del medio de crecimiento por el medio de manteni miento (SFB al 2%) y se observó en el microscopio invertido los cambios en su morfología durante los siguientes 5 días. Para la evaluación del efecto citopático (ECP) se empleó el procedimiento para identificación y aislamiento de EV pro puesto por la OMS.
Determinación intra típica de los aislados
De aquellas muestras que presentaron efectos citopáticos, se procedió a la extracción de ARN, utilizando el Invisorb® Spin Virus RNA Mini Kit siguiendo las consideraciones generales recomendadas por el fabricante. la cantidad de ARN se cuan tificó mediante un espectrofotómetro (Epoch®).
La retrotranscripción y amplificación por PCR se realizó, utili zando el kit comercial SuperScript® III Platinum® One-Step RT-PCR en la siguiente mezcla de reacción: 3 μL de ARN, 16,5 μL de H2O libre de nucleasas, 1,5 μl de SuperScript III RT/Plati num Taq, 25 μL de pre-mezcla 2X, 2,0 μL de primer A, 2,0 μL de primer B. Los parámetros de termociclador fueron los siguien tes: transcripción inversa (RT) a 55 ° C durante 18 min, inactiva ción de RT a 95 ° durante 30 ciclos de 95°C de 45 segundos y 65 ºC por 45 s y 72 ºC durante 45 s; finalmente la mezcla de reac ción se mantuvo durante 7 min a 72 ºC. Se emplearon 4 juegos de iniciadores distribuidos de la siguiente manera: Cebadores genéricos (EV) que hibridan con sitios altamente conservados dentro de la región 5’ no codificante del genoma de los Entero virus permitiendo la amplificación de una secuencia de 114 pb común para todos los enterovirus B. Cebadores específicos del grupo de los poliovirus (Pan PV) que permiten la amplificación de una secuencia de 79 pares de bases (pb) común los 3 sero tipos de poliovirus. C. Cebadores específicos de serotipo (PV) que permiten la amplificación de una secuencia de 70, 79 y 140 pb de las cepas tanto vacunales como salvajes de los serotipos de poliovirus 1, 2 y 3 respectivamente12. Cebadores específicos de las cepas vacunales (Sabin) que permiten la amplificación de una secuencia de 97 pb, 71 pb, y 44 pb de la cepa vacunal Sabin 1, Sabin 2 y Sabin 3 respectivamente, excluyendo la amplifica ción cruzada con genotipos de poliovirus salvajes13. Se utilizó como control positivo vacuna oral antipolio.
Para la visualización del producto de amplificación se utili zó un gel de agarosa al 2%, se adiciono 4μl de SYBR Green, se utilizaron 4 μl de marcador de peso molecular Hypper ladder™ 50bp que permite la identificación del peso de las bandas desde 50 pb hasta 2000 pb, posteriormente se aplicó una potencia de 100 Voltios durante 40 minutos, finalmente los geles se observaron sobre un transiluminador.
Resultados
Del total de 36 muestras recolectadas en los municipios 3 con alto tránsito de inmigrantes, 6 fueron positivas en cul tivo celular para la linea celular RD. La muestra de la ciudad de Cúcuta especificamente en la localidad de Caño Picho, presentó efecto citopático tanto en la linea celular RD como en la L20B. Todos los aislamientos, incluyendo el obtenido la muestra que presentó efecto citopático en las dos líneas utilizadas, fueron confirmados como enterovirus mediante la amplificación del genoma con cebadores genéricos de ente rovirus. No se obtuvo amplificación con cebadores específi cos para el grupo de poliovirus (tabla 1).
Discusión
El Plan Estratégico para la Erradicación de la Poliomielitis y Fase Final 2013-2018, tuvo como objetivo la erradicación del virus salvaje y la eliminación de los poliovirus circulantes derivados de la vacuna (cVDPV). Para enero de 2013, el Consejo Ejecu tivo de la OMS aprobólas metas y el cronograma del Plan Estratégico orientado a detectar e interrumpir la transmisión de los virus de la poliomielitis; a fortalecer los programas de inmunización, a retirar la vacuna oral trivalente por la bivalente oral (serotipos 1 y 3); así como a contener los virus de la polio mielitis existentes en los laboratorios del mundo14.
Ahora bien y pese a los grandes avances frente al tema, el Gru po Técnico Asesor de la Organización Panamericana de la Salud sobre Enfermedades Prevenibles por Vacunación en su reunión en el año 2017 en Panamá hizo énfasis en que debemos con tinuar vigilantes. Debido a ello, se exhortó a seguir trabajando aún más fuerte debido a que los crecientes movimientos mi gratorios, los eventos internacionales y el turismo representan un riesgo de reintroducción de enfermedades, incluso las ya erradicadas15. Aunque la región de las Américas continúa libre de la circulación de poliovirus salvaje, a nivel regional en 2017 se reportó un descenso en las coberturas de vacunación contra la polio, lo que lleva a que los niños no vacunados se hallen en riesgo y para lo cual se debe estar preparado16.
La Estrategia para la fase final de la erradicación de poliomie litis 2019-2023 manifiesta que se siguen presentando riesgos para lograr la erradicación a nivel mundial, los cuales com prenden: 1. La inseguridad y conflicto de las zonas afectas por la poliomielitis, la cual lleva a desplazamiento masivo 2. Sistemas de salud débiles: pues la pobreza extrema y el bajo acceso a servicios básicos lleva a encontrar niños no vacuna dos, lo que implica un riesgo para la circulación continua y los brotes derivados de la importación de poliovirus o la apa rición de poliovirus derivada de la vacuna (VDPV) 3. Riesgos operacionales, de gestión y de recursos1.
Es así como el reporte durante los últimos 5 años en algunos países se puede visualizar en (tabla 2).
Tabla 2 Reporte de casos en el periodo 2015-2020 por virus polio (virus salvaje y virus derivado de vacunal)
Fuente. Tomada y modificada de https://vacunasaep.org/profesionales/noticias/polio-parte1-situacion-general-y-casos-por-virus-salvaje-VP1
Los reportes de casos de virus polio evidencian el riesgo que amenaza el éxito de la erradicación definitiva del virus polio a nivel mundial y la posibilidad de la reintroducción de virus polio en el país, derivado de la migración.
Es por ello que el presente estudio realizó la vigilancia am biental en tres municipios con alto tráfico de migrantes, como lo son Calí, Cucuta y Turbo Antioquia; para ello tomo aguas residuales de puntos especificos en dichos municipios, realizo cultivo y pruebas moleculares que permitian la identi ficación de enterovirus no polio y poliovirus salvaje y vacunal. Dicha metodología permitio identificar enterovirus no polio en los tres municipios evaluados lo cual sustenta la capaci dad del método empleado para la detección viral en el am biente; y no se encontro amplificación tanto para poliovirus salvaje como vacunal; sin embargo en dos estudios previos y publicados por Gonzalez y col con una metodologia similar en el año 2005 y 2019 evaluando las aguas residuales de la ciudad de Armenia-Quindio; se logro identificar la presencia de virus derivados de vacuna y con resultados negativos para poliovirus salvaje17,18.
El hallazgo de la no circulación de poliovirus vacunal para el periodo 2017-2019, puede ir en consonancia con uno de los objetivos del gobierno colombiano la cual consistia en aplicar una dosis de vacuna inactivada contra la poliomielitis, a todos los niños y niñas nacidos a partir del 1 de diciembre de 2014 en el 100% de los municipios del país y a los sus ceptibles que iniciaban esquemas que fueran menores de 6 años14. Lo que explica una menor probalidad de hallar virus vacunal en las muestras de aguas residuales evaluadas en este periodo, dado que la IPV se administra por vía intramus cular lo que no permite la expulsión de virus en la materia fecal por ser un virus inactivado, comparado con la vacuna oral (OPV) que es un virus atenuado y que se excreta en las heces contaminando las aguas residuales.
Por su parte el Instituto Nacional de Salud (INS), en su boletin epidemiologico del año 2019, presento un mapa de ponde ración de riesgo de importación o reemergencia de polio en Colombia (ver figura 3); el cual pretendia evaluar el riesgo ante importación o reemergencia de brotes por virus polio, evidenciando que: el 64,4% de las entidades territoriales se clasifican como de riesgo alto, el 8,1% (3 departamentos) riesgo medio y el 27% (10 departamentos) de riesgo bajo7.
La figura anterior evidencia que los tres municipios evalua dos en el periodo 2017-2019 se encuentran entre las entida des territoriales de riesgo de importación o reemergencia de polio con un riesgo alto, sin embargo; para el año 2020 el INS presento una disminución del porcentaje de las entidades te rritoriales con dicho riesgo pasando de 64,4% para el 2019 a 51% en el 2020. Asi mismo documenta los factores de riesgo de importación a los que nos vemos expuestos como son: el riesgo de propagación internacional de WPV1 y cVDVP dado por el aumento de casos en países en conflicto o con bajas coberturas vacunales; la disminución de la inmunidad contra polio vacunal 2, al aumentar el número de niños nacidos des pues del retiro de la vacuna de polio oral 2 y la deficiencia de cobertura con la vacuna de polio inactivada, y finalmente los sistemas de inmunización débiles dados por diversas emer gencias humanitarias, entre estas la aparición de la pandemia mediada por el virus SARS-CoV2.
En conclusión los hallazgos indican que el sistema de mo nitoreo utilizando aguas residuales con el fin de determinar la presencia de virus, es una herramienta util para realizar vigilancia ambiental.
