Introducción
Hypothenemus hampei (Ferrari, 1867) (Coleoptera: Curculionidae: Scolytinae), es el insecto plaga más perjudicial en muchos países productores de café (Coffea spp.) (Vega et al. 2015; Infante 2018). Este insecto es originario de África Central y fue introducido a Brasil en 1913, de donde se dispersó a los demás países productores de café de América y el Caribe (Infante et al. 2014). En 1978, la broca del café ingresó a México desde Guatemala a través del Soconusco, Chiapas (Baker 1984), dispersándose a todas las áreas productoras de café en el país. En el estado de Tabasco, H. hampei se registró por primera vez en el año 2004 (Ramírez-Del Ángel et al. 2007) y se ha convertido en el principal insecto plaga del café en la entidad.
Hypothenemus hampei utiliza los frutos de café como hábitat y para alimentación de estados inmaduros y adultos (Le Pelley 1968). Para ello, las hembras adultas perforan el fruto del café y colocan sus huevos en el endospermo. Cuando nacen las larvas se alimentan de la semilla del café, provocando disminución del rendimiento hasta de un 50 % (Mathieu et al. 1999). La broca del café pasa la mayor parte de su vida dentro del fruto de café, lo cual dificulta su control (Murphy y Moore 1990).
Muchas especies de Scolytinae presentan relaciones mutualistas con hongos, los cuales les sirven de alimento (Nakashima 1971). En otros casos, los hongos asociados se comportan como patógenos para la planta hospedera del insecto o pueden ser patógenos del insecto plaga (Posada et al. 1993). En Chiapas, México, Pérez et al. (2003), reportaron 15 hongos asociados a H. hampei; así también, Carrión y Bonet (2004) registraron 11 especies asociadas a H. hampei en plantaciones de café del estado de Veracruz. En Brasil, Gama et al. (2006), reportaron 10 géneros de hongos asociados con H. hampei.
El estudio de los hongos asociados a H. hampei contribuye al conocimiento de la biodiversidad y en el caso de hongos entomopatógenos podría resultar en una alternativa sustentable para el control de esta plaga. Al respecto, Bustillo et al. (1999) registraron a Paecilomyces lilacinus (Samson, 1974) atacando a H. hampei. Carrión y Bonet (2004) reportaron a Beauveria bassiana (Balsamo, 1835) asociada a la broca del café, y este hongo se considera el principal controlador de la broca del café (Bustillo 2004). Debido a que la micobiota de la broca del café no ha sido estudiada en Tabasco, el objetivo de la presente investigación fue identificar los hongos asociados a la cutícula de los adultos de H. hampei, recolectados en agroecosistemas de café del estado de Tabasco, México.
Materiales y métodos
Los sitios de muestreo se ubicaron en los tres municipios que concentran la producción de café en el área: Teapa, Tacotalpa y Huimanguillo. En cada municipio se establecieron seis sitios de muestreo (Tabla 1). El muestreo se realizó de octubre a diciembre de 2015. En cada parcela se recolectaron 100 cerezas brocadas. Las cerezas se disecaron para buscar y recolectar todos los adultos (vivos y muertos) en el interior de la cereza.
Municipio | Localidad | Georreferenciación | Altitud (m) | Aislamientos obtenidos | |
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Huimanguillo | R/a. Arena 1ª sección | N17º24’11” | O093º33’06” | 46 | Hh1, Hh2, Hh3, Hh4, Hh5, Hh6 |
R/a. Pedregalito 1ª sección | N17º27’35” | O093º32’48” | 59 | Hh7, Hh8, Hh9 | |
Ejido Chimalapa 2ª sección | N17º24’43” | O093º37’47” | 91 | Hh10, Hh11, Hh12, Hh13, Hh14 | |
Francisco J. Mujica | N17º22’31” | O093º38’49” | 407 | Hh15 | |
Malpasito | N17º20’23” | O093º36’03” | 238 | Hh16 | |
Chimalapa | N17º26’52” | O093º34’31” | 203 | Hh17, Hh18, Hh19, Hh20 | |
Tacotalpa | Ejido Tapijulapa | N17º27’30” | O092º45’41” | 200 | Hh21, Hh22, Hh23, Hh24, Hh25, Hh26, Hh27, Hh28, Hh29, Hh30, Hh31, Hh32, Hh33 |
Ejido Cerro Blanco 4ª sección | N17º25’60” | O092º48’52” | 456 | Hh34, Hh35, Hh36, Hh37, Hh38, Hh39, Hh40 | |
Ejido Cerro Blanco 2ª sección | N17º25’04” | O092º48’17” | 371 | Hh41, Hh42, Hh43, Hh44, Hh45, Hh46, Hh47, Hh48, Hh49, Hh50 | |
Ejido Cerro Blanco 5ª sección | N17º26’55” | O092º49’16” | 194 | Hh51, Hh52, Hh53, Hh54, Hh55, Hh56, Hh57 | |
Ejido Palo Quemado | N17º25’08” | O092º50’09” | 947 | Hh58, Hh59 | |
Ejido Zonu y Pastatal | N17º28’08” | O092º49’09” | 188 | Hh60, Hh61, Hh62, Hh63, Hh64, Hh65 | |
Teapa | Vicente Guerrero | N17º31’42” | O092º55’57” | 93 | Hh66, Hh67 |
Arcadio Zentella | N17º31’56” | O092º51’36” | 45 | Hh68, Hh69, Hh70, Hh71 | |
Nicolás Bravo 2ª sección | N17º29’46” | O092º57’27” | 473 | Hh72, Hh73, Hh74 |
Obtención de aislamientos
Las brocas que se extrajeron de las cerezas se desinfestaron superficialmente en una solución de hipoclorito de sodio al 0,5 %, durante 5 min, y se enjuagaron tres veces con agua destilada estéril. Posteriormente, los insectos se colocaron individualmente en cámara húmeda a 25 °C, durante 8 días, para permitir la expresión de hongos sobre los cadáveres. Los hongos que se desarrollaron sobre la cutícula de H. hampei, se aislaron y se multiplicaron en medio de cultivo agar-dextrosa de Sabouraud + 0,1 % de extracto de levadura (ADS + EL) (Feng-Yan y Quing-Tao 1991).
Caracterización morfológica
Las especies de hongos se identificaron con base en las estructuras reproductivas, según Samson (1981), Humber (1997), Watanabe (2002) y el manual de laboratorio de Fusarium de Leslie y Summerell (2006). Para ello, los aislamientos se crecieron en cajas de Petri con medio ADS + EL durante 14 d, para determinar las características de la colonia: tamaño, forma y conidiación. Además, una suspensión de esporas fue inoculada sobre discos de ADS + EL de 0,5 cm de diámetro, bajo un cubre objetos, para obtener estructuras microscópicas de cada aislamiento. Todos los discos inoculados se incubaron a 25 °C en cámara húmeda durante 5 d. Las características microscópicas de conidióforos, conidios y clamidosporas se observaron bajo el microscopio de campo claro y foto documentadas mediante digitalización de imágenes. La morfometría se realizó con el software Image Tool® (Wilcox et al. 2002). Los aislamientos “voucher” o comprobantes se depositaron en la colección de hongos entomopatógenos de la Universidad Juárez Autónoma de Tabasco (UJAT), en Villahermosa, Tabasco. La sinonimia aceptada está basada en la información ofrecida en Index Fungorum (2018), MycoBank (2018) y EOL (2018).
Caracterización molecular
Dos aislamientos de cada especie morfológica se caracterizaron molecularmente. El ADN de los hongos estudiados se obtuvo de acuerdo con Ahrens y Seemüller (1992). La amplificación de las regiones ITS1 e ITS2 de los genes ribosomales (RNAr) se efectuó mediante la técnica de PCR, utilizando los iniciadores universales ITS4 (TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC) e ITS5 (GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G) (White et al. 1990). La amplificación y visualización de los productos finales se realizó según el protocolo de Ahrens y Seemüller (1992). Los productos amplificados se purificaron con el kit Wizard (Promega®) y se enviaron para secuenciación a Macrogene®. Las secuencias se compararon con la base de datos del banco de genes del National Center for Biotechnology Information (NCBI 2015). Para la comparación de los valores generados con la secuencia de estudio se consideró una similitud ≥ 97 % (Stackebrandt y Goebel 1994).
Resultados
Un total de 74 aislamientos de micromicetos fue obtenido de la cutícula de H. hampei. De ellos, 52 presentaron afinidad morfológica con Fusarium solani (Martinus) Saccardo, 1881; cinco con F. oxysporum (Schlechtendahl) Snyder y Hansen, 1940; cinco con F. verticillioides (Saccardo) Nirenberg, 1976, (Fig. 1); uno con Geotrichum candidum (Link, 1809) y 11 con Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin, 1912 (Fig. 2, Tabla 2).
Aislamiento | Especie morfológica |
---|---|
Hh6, Hh10, Hh11, Hh12, Hh13, Hh14, Hh15, Hh17, Hh18, Hh21, Hh22, Hh23, Hh24, Hh25, Hh26, Hh27, Hh28, Hh29, Hh30, Hh31, Hh32, Hh33, Hh34, Hh35, Hh36, Hh38, Hh41, Hh43, Hh44, Hh45, Hh49, Hh50, Hh51, Hh53, Hh54, Hh55, Hh56, Hh57, Hh58, Hh59, Hh60, Hh61, Hh62, Hh63, Hh64, Hh66, Hh67, Hh70, Hh71, Hh72, Hh73, Hh74 | Fusarium solani |
Hh37, Hh39, Hh42, Hh68, Hh69 | Fusarium oxysporum |
Hh5, Hh19, Hh47, Hh48, Hh52 | Fusarium verticillioides |
Hh20 | Geotrichum candidum |
Hh1, Hh2, Hh3, Hh4, Hh7, Hh8, Hh9, Hh16, Hh40, Hh46, Hh65 | Beauveria bassiana |
La región amplificada de los aislamientos Hh7 y H16, especie morfológica B. bassiana, presentó un tamaño de 581 pb. La región de los aislados H12 y H61, especie morfológica F. solani, obtuvo un tamaño de 568 pb. Así también, las cepas Hh37 y Hh69, especie morfológica F. oxysporum, mostraron un tamaño de 556 pb. Las cepas Hh19 y Hh48 obtuvieron 563 pb y el aislamiento Hh20, especie morfológica G. candidum, presentó 361 pb. Las secuencias de estudio mostraron similitud con secuencias del GenBank, con homologías del 99 y 100 %, las cuales coincidieron con especies correspondientes a la especie morfológica, confirmando que los hongos aislados de la cutícula de H. hampei corresponden a cinco especies mencionadas (Tabla 3).
Cepa | Identificación morfológica y molecular | Homología (%) | Cepa de referencia (GenBank) |
---|---|---|---|
Hh7 | Beauveria bassiana | 100 | JQ266172 |
Hh16 | B. bassiana | 99 | JQ320361 |
Hh12 | Fusarium solani | 99 | JQ723750 |
Hh61 | Fusarium solani | 99 | KX078455 |
Hh37 | Fusarium oxysporum | 99 | KJ715962 |
Hh69 | Fusarium oxysporum | 99 | EU839381 |
Hh19 | Fusarium verticillioides | 99 | KP003945 |
Hh48 | Fusarium verticillioides | 99 | KX196811 |
Hh20 | Geotrichum candidum | 99 | KJ579946 |
La especie más abundante fue F. solani (70,2 %), seguida de B. bassiana (14,8 %). Fusarium verticillioides y F. oxysporum representaron cada una el 6,7 % respectivamente. La especie menos abundante fue G. candidum (1,3 %) (Fig. 3).
Discusión
Este trabajo se constituye el primer estudio de los hongos micromicetos asociados a la cutícula de H. hampei a partir de brocas recolectadas en los municipios que concentran la producción de café en Tabasco. En plantaciones de café del estado de Chiapas, Pérez et al. (2003) reportaron 15 especies fúngicas en las que se incluye F. solani. Así también, Carrión y Bonet (2004) en Veracruz encontraron 11 especies, en las que se incluyen F. solani. F. oxysporum y B. bassiana. Para Brasil, Gama et al. (2006), registraron 10 géneros de hongos asociados con H. hampei, en las que se mencionan Fusarium, Geotrichum y Beauveria, los cuales también son reportados en la presente investigación. En nuestro estudio, la abundancia de especies encontradas sobre H. hampei fue menor a la encontrada por otros autores, lo cual pudo obedecer a diferencia de los métodos utilizados. También es importante señalar que, en esta investigación, el muestreo se realizó solamente en la época de lluvias, por lo que la micobiota asociada a H. hampei puede variar con respecto a otras épocas del año.
De las especies aisladas sobre H. hampei, F. solani fue la especie más abundante, lo cual fue similar a lo encontrado por Pérez et al. (2003) en el estado de Chiapas y por Gama et al. (2006), en Brasil. Morales et al. (2000), reportaron que F. solani mantiene una relación simbiótica mutualista con H. hampei; sin embargo, Pérez et al. (2005) concluyeron que no existe dicha relación. Fusarium solani también ha sido descrito como causante de la muerte descendente de ramas de café (Wellman 1977). Esta especie causa diversos tipos de enfermedades en al menos 111 especies de 87 géneros de plantas (Kolattukudy y Gamble 1995). Otros autores lo han descrito como parásito de diferentes insectos (Feng-Yan y Quing-Tao 1991) y como agente causal de enfermedades en humanos (Hernández et al. 2011).
Del género Fusarium también se identificaron las especies F. oxysporum y F. verticillioides. La presencia de F. oxysporum asociada a H. hampei coincide con los resultados de Carrión y Bonet (2004), en plantaciones de café de Veracruz. De acuerdo con estos autores, la presencia de F. oxysporum y F. solani en la cutícula de H. hampei y en sus galerías, puede tener repercusiones en la salud de la planta. Al respecto, Wellman (1977) reportó a F. oxysporum como agente causal de marchitez en plantas de café. F. oxysporum es cosmopolita y parasita más de 100 especies de plantas, gimno y angiospermas, en diferentes formas especiales (Bosland 1988). Otros autores lo han descrito como parásito de insectos (Sumling et al. 2013; Feng-Yan y Quing-Tao 1991). Por su parte, F. verticillioides no había sido asociado a H. hampei; sin embargo, se le ha reportado como entomopatógeno de Tropidacris collaris y Ronderosia bergi (Orthoptera: Acridoidea) (Pelizza et al. 2010). Por otro lado, F. verticillioides es considerado el principal patógeno de Zea mays, ya que es capaz de provocar pudriciones en la raíz, el tallo y la mazorca (Desjardins 2006).
Geotrichum candidum fue la especie menos abundante y no había sido reportada asociada a H. hampei; aunque Gama et al. (2006), habían registrado al género asociado a la broca. Así también, se tienen reportes de G. candidum como patógeno de plantas, causando pudrición en frutas y hortalizas (Trigos et al. 2008) aunque se desconoce su efecto sobre las cerezas de café. Por otro lado, G. candidum, agente causal de la geotricosis en humanos (Caretta 1959), no presenta registro alguno como entomopatógeno. Esta especie y F. verticillioides se suman a la lista de micromicetos asociados a H. hampei, junto con aquellos reportados por Pérez et al. (2003) y Carrión y Bonet (2004).
Beauveria bassiana fue la especie más abundante, después de F. solani y se encontró en el 40 % de los sitios muestreados. B. bassiana es el hongo entomopatógeno más utilizado en el control biológico de H. hampei. Al respecto, Bustillo (2004) reportó que, bajo condiciones de campo, B. bassiana (1 x 109 conidios/árbol) mostró el 30 % de efectividad sobre la broca, a los cinco días después de la aplicación. Por otro lado, B. bassiana es usado para el control de otros insectos plaga y es la especie de entomopatógeno más utilizada en el mundo (Alves et al. 2003).
Conclusiones
Se identificaron cinco especies de hongos asociados a cadáveres de H. hampei. Cuatro de ellas registradas como especies fitopatógenas de diferentes cultivos de las cuales, F. solani y F. oxysporum se han reportado como fitopatógenos del café y otras plantas tropicales. Las tres especies de Fusarium, identificadas en esta investigación, han sido descritas como parásitos de otros insectos; sin embargo, se desconoce el papel que desempeñan sobre H. hampei. La abundancia de especies asociadas a H. hampei, obtenida en cámaras húmedas, fue menor a la de otros autores. Las especies F. verticillioides y G. candidum son nuevos reportes de hongos micromicetos asociados a H. hampei. Se detectó la presencia de B. bassiana parasitando a H. hampei en el 40 % de los sitios de muestreo. Este estudio es un aporte al conocimiento de la diversidad de hongos asociados a H. hampei.