INTRODUCCIÓN
Las especies de la subfamilia Lemnoideae (Araceae), conocidas también como lentejas de agua, son las plantas vasculares acuáticas más simples y diminutas a nivel estructural y reproductivo en el mundo (Cross, 2002). Se reconocen 37 especies y cinco géneros: Spirodela, Landoltia, Lemna, Wolffiella y Wolffia (Stevens, 2001). Estas macrófitas flotantes de distribución cosmopolita se presentan principalmente en los sistemas acuáticos lénticos, y se caracterizan por un rápido crecimiento de sus frondas (o talos) de forma vegetativa, llegando a cubrir gran parte de los espejos de agua (Armstrong, 2011). Lemna minuta Kunth es una pequeña macrófita conformada por una o varias frondas (2-6) que forman una colonia. La fronda es una estructura compleja que representa al tallo y la hoja, que presenta una corta vena (o ausencia) y una sola raíz (Landolt, 1986). La floración de L. minuta es muy rara, al igual que la mayoría de las lentejas de agua, aunque esta puede ocurrir frente a cambios abruptos en diferentes condiciones ambientales, como fotoperíodos de 12 a 16 horas de luz y temperaturas de 22°C a 32°C (Landolt & Kandeler, 1987).
A causa de su amplia distribución mundial en ecosistemas lénticos, varias especies del género Lemna L., especialmente Lemna minor, han sido usadas a nivel experimental ecológico y toxicológico por su alta sensibilidad frente a las concentraciones de nutrientes en el agua y su rápida respuesta fisiológica a la presencia de sustancias o materiales que pueden ser dañinos para su crecimiento (Hillman, 1961; Wang, 1990; Wang & Freemark, 1995). Debido a esto, dentro del área ecotoxicológica, se han desarrollado diversos protocolos para evaluar, monitorear y determinar la calidad de agua mediante especies del género Lemna, por entidades internacionales como: el Instituto Sueco de Investigación Aplicada del Medio Ambiente (ITM, 1990), el Instituto Sueco de Normalización (SIS, 1995), la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (USEPA, 1996), la Asociación Francesa de Normalización (AFNOR, 1996), la Organización Internacional de Normalización (ISO, 2005), la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos (OECD, 2006), el Ministerio del Medio Ambiente de Canadá (EC, 2007), y la Asociación Americana de Salud Pública (APHA et al., 2011).
L. minuta puede ser una potencial macrófita nativa para la realización de bioensayos, biomonitoreos y fitorremediación, así como para otros estudios ecotoxicológicos, fisiológicos y bioquímicos (Caris et al., 2006; Ramírez, 2011; Van Echelpoel et al., 2016). Su pequeño tamaño, rápido crecimiento y su fácil mantenimiento en condiciones de laboratorio, podrían posibilitar la formación de un cultivo axénico a partir de individuos colectados en campo, con miras a desarrollar investigaciones experimentales. Por otra parte, para iniciar un cultivo de cualquier especie de Lemna, una de las principales referencias para la esterilización de las frondas en los últimos años ha sido el método propuesto por la Dra. Judy Acreman (2007), donde se describe paso a paso los requerimientos para la obtención de un cultivo axénico. Este método puede presentar altos índices de mortalidad en las frondas durante su ejecución, debido al tiempo de exposición (60 s) y la sensibilidad al desinfectante (solución de hipoclorito de sodio al 0,5 %).
El uso experimental de L. minuta ha sido reportado en el país por Valderrama et al., (2002), Gómez (2002) y Ramírez (2011) para tratamientos de sistemas de aguas residuales o como propuesta para bioensayos de ecotoxicidad acuática; sin embargo, debido al enfoque de estos estudios, no se describen detalles sobre un método de limpieza de frondas de esta macrófita en Colombia. La distribución de las frondas de L. minuta ha sido reportada en lagunas y humedales de la región andina, entre los 1800 hasta los 3300 msnm, principalmente en temporada de secas, debido a su abundancia en el espejo de agua (Schmidt-Munn, 1998). Por otra parte, el estado de eutrofización del cuerpo de agua puede aumentar la presencia de organismos en las frondas, lo que dificulta la selección de ambientes acuáticos y de frondas menos contaminadas para la aplicación de técnicas de limpieza. El objetivo de este trabajo es establecer el proceso de desinfección adecuado para las frondas de L. minuta, mediante modificación del método de limpieza propuesto por J. Acreman, y así promover la formación y desarrollo de cultivos axénicos para aplicaciones experimentales en laboratorio.
MATERIALES Y MÉTODOS
Selección de fronda madre
Las colonias de Lemna minuta fueron colectadas en el humedal de Santa María del Lago en Bogotá D.C., a partir de la revisión de las plantas acuáticas en la sabana de Bogotá de Schmidt-Mumm (1998). La macrófita se identificó mediante la clave taxonómica de Landolt y Schmidt-Mumm (2009). Para formar el cultivo base o stock de limpieza, todas las plantas deben provenir de una única fronda o clon, conocida como fronda madre (Landolt, 1986). Para esto, se seleccionó una fronda sin clorosis, necrosis, y con baja presencia de algas y cianofíceas en talo y raíz (evidente a simple vista). Las colonias de la fronda madre, conformadas generalmente por dos a cuatro individuos, se mantuvieron durante dos meses en vasos de precipitado de 2 L con 1,5 L de agua del humedal para su aclimatación, con una renovación semanal del agua sin ningún tratamiento (EC, 2007).
Tratamientos para limpieza de frondas
El método Acreman (2007) consiste en la obtención de un cultivo axénico mediante la esterilización de las plantas de Lemna usando hipoclorito de sodio al 0,5% (Clorox® 10%), con exposiciones repetidas durante más de un minuto, para asegurar la eliminación de agentes contaminantes como bacterias y hongos (tabla 1). Para aplicar este método de limpieza, se dispuso inicialmente de 100 frondas, ya que cerca del 1-10% sobrevive la desinfección. Cuando el cultivo stock alcanzó un aproximado de 400 frondas (ca. dos meses), se aplicó a 10 frondas tres tratamientos con dosis de 0,125%, 0,25 % y 0,5 % de hipoclorito de sodio (Clorox® 4,5 %). Se realizaron tres réplicas, separando las frondas de sus colonias con pinzas entomológicas y sumergiéndolas en cada tratamiento durante 15 s, 30 s, 45 s y 60 s por separado. Posteriormente se lavaron en agua destilada, y cada grupo se traspasó al medio de cultivo sin nutrientes orgánicos (APHA) para su seguimiento (EC, 2007). Transcurridas 48h, se contaron los individuos que presentaban coloración verde en el centro de la fronda para calcular la supervivencia a cada tratamiento. Asimismo, para comprobar la efectividad del método, se revisó la presencia/ausencia de algas y cianofíceas en los talos en cada tratamiento utilizando un aumento de 400x bajo microscopio óptico Nikon® (modelo Eclipse E200). Todas las manipulaciones y transferencias de las frondas se realizaron en un ambiente aséptico generado por una cámara de flujo laminar.
Análisis estadístico
Se utilizó un análisis de varianza de dos factores (ANDEVA) para analizar del porcentaje de supervivencia entre los tiempos de exposición de las frondas y el nivel de concentración de hipoclorito, seguido de una prueba post hoc de Tukey para comparar los tratamientos. Un valor de p<0,05 fue utilizado como criterio para considerar diferencias significativas. Los análisis se desarrollaron con el software RStudio (2015, versión 0.98.501).
RESULTADOS Y ANÁLISIS
Para la obtención de un cultivo axénico de L. minuta es indispensable adecuar un método de limpieza para sus frondas que sirva como referencia para cualquier uso experimental o en la utilización de cultivos con fines de investigación bajo condiciones controladas de laboratorio (Ramírez-Babativa & Espinosa-Ramírez, 2018).
Efecto del hipoclorito sobre las frondas de L. minuta
El porcentaje de supervivencia de frondas de L. minuta presentó diferencias significativas entre los tratamientos con diferentes tiempos de exposición y concentraciones de hipoclorito (tabla 2). Los mayores valores de supervivencia se presentaron en las frondas limpiadas con hipoclorito al 0,125 % durante 15s y 45s, con 83 % cada uno, mientras los menores valores (< 3 %) se presentaron con hipoclorito al 0,5% durante 45 s y 60 s (figura 1). No se presentó supervivencia de fondas en el tratamiento con 0,5 % de hipoclorito durante 60 s. En general, se observó una tendencia con mayor supervivencia en las frondas limpiadas con hipoclorito al 0,125 %, mientras las frondas con menor supervivencia se presentaron en el tratamiento con hipoclorito al 0,5%.
Por otra parte, se evidenció la presencia de algas o cianofíceas en fronda y raíz posterior a la limpieza en todos los tratamientos con hipoclorito al 0,125 % y 0,25 %, a excepción del tratamiento a 60 s. A su vez, en los tratamientos con hipoclorito al 0,5% se registró la presencia de estos microorganismos durante el tiempo de exposición de 15 s. Asimismo, la alta mortalidad de frondas en hipoclorito 0,5% durante 60s y 45s, sugieren que esta concentración es muy alta para la limpieza de la planta, por lo cual deben utilizarse tiempos o concentraciones menores a las recomendadas por el método Acreman.
Para la obtención de un monocultivo de L. minuta, sin presencia de algas u otros microorganismos en fronda y raíz, estos resultados sugieren que podría utilizarse hipoclorito de sodio en concentraciones menores al 0,5 % y con tiempo de exposición menor a 60 s, valores menores a los recomendados por el método Acreman (2007). Adicionalmente, se propone repetir este proceso de limpieza cada cuatro meses en el cultivo axénico, para evitar una propagación de algas resistentes a la limpieza por hipoclorito o una contaminación de frondas por una manipulación experimental inadecuada. Independiente del uso experimental de Lemna, la limpieza de las frondas de manera temporal permitiría disponer de un cultivo stock de crecimiento continuo en laboratorio. Finalmente, se recomienda modificar el método de desinfección de frondas de Acreman para obtener un cultivo axénico de cualquier otra especie del género Lemna, ya que estas pueden requerir diferentes concentraciones y tiempos de exposición para desinfectar sus frondas.
CONCLUSIONES
La modificación del método de limpieza de Acreman para L. minuta fue efectiva en la obtención de un monocultivo axénico a partir de una planta nativa de humedal urbano. La descontaminación fue posible en hipoclorito 0,5 % durante 45 y 30 segundos, o en concentración de hipoclorito 0,25 % a 60 segundos, debido a la baja mortalidad de las frondas y la alta efectividad en la remoción de algas y otros microrganismos.