INVESTIGACIÓN ORIGINAL

Una mutación en el gen PARK2 causa enfermedad de Parkinson juvenil en una extensa familia colombiana

Mutation c.255delA in the PARK2 gene as cause of juvenile Parkinson´s disease in a large Colombian family

Nicolás Pineda–Trujillo¹; Andrés Dulcey Cepeda²; William Arias Pérez³; Sonia Moreno Masmela⁴; Amanda Saldarriaga Henao⁴; Diego Sepúlveda Falla⁴; Gabriel Bedoya Berrío³; Francisco Lopera Restrepo⁴; Andrés Ruiz–Linares^3,5

 

1. Grupo Mapeo Genético, Departamento de Pediatría y Puericultura, Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia. Medellín, Colombia.
2. Facultad de Medicina, Universidad del Cauca. Popayán, Colombia.
3. Grupo Genética Molecular –GENMOL– Corporación de Patologías Tropicales, Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia.
4. Grupo de Neurociencias de Antioquia, Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia. Medellín–Colombia.
5. Galton Laboratory, Universidad de Londres. Londres, Inglaterra.
Direcciones : nicolas.pineda@yahoo.com, flopera@epm.net.co, whariasp@yahoo.com, gbedoya@quimbaya.udea.edu.co, a.ruizlin@ucl.ac.uk
Este trabajo se llevó a cabo gracias a la financiación de Colciencias y la Universidad de Antioquia. Proyecto 'Caracterización epidemiológica, clínica y molecular de la enfermedad de Parkinson juvenil' Código: 111504 16385. Contrato # 314–2004.

 

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Resumen

La enfermedad de Parkinson (EP) es común y se debe a degeneración de las neuronas dopaminérgicas en la sustancia nigra y en otras áreas del cerebro. Varios genes y mutaciones han sido implicados en ella y la mayoría de estas últimas han sido identificadas en el gen PARK2. Reportamos la evaluación de este gen PARK2 y de su región flanqueante en una gran familia de origen caucano, al suroccidente de Colombia. Los padres son primos hermanos y cuatro de sus diez hijos resultaron afectados en edad juvenil.

La evaluación molecular incluyó tipificación de microsatélites (STR) y la secuencia directa de los exones del gen. Nuestros hallazgos evidenciaron la presencia en condición homocigota de la mutación c.255delA, en el exón 2 de PARK2. Además, se pudo identificar un haplotipo portado por ambos padres y presente en condición homocigota en los hijos afectados. Del mismo modo se observó una alta tasa de recombinantes en la extensión de la región cromosómica analizada. La mutación c.255delA en PARK2 ya había sido reportada previamente en familias tanto de Francia como de España.

Nuestros resultados reconfirman la participación del gen PARK2 en la etiología de la enfermedad de Parkinson, en particular de la forma juvenil. Además, considerando que la mutación identificada en la familia que presentamos ya había sido previamente encontrada en poblaciones europeas, es probable que haya llegado a Colombia desde allí. Alternativamente, esta mutación pudo ocurrir de manera recurrente en un ancestro más cercano de la familia estudiada; para verificar ambas posibilidades sería necesario evaluar marcadores flanqueantes de la mutación, en los cromosomas europeos y colombianos portadores de la mutación. Tales marcadores pueden ser STR (como se reporta en este estudio) o alternativamente, SNP.

Palabras clave: Enfermedad de Párkinson juvenil, Gen Park2, Genética del párkinson, Mutación c.255delA

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SUMMARY

Parkinson´s is a common disease (PD) caused by degeneration of dopaminergic neurons in the substantia nigra and other brain areas. Several genes and mutations have been implicated in its pathogenesis, the latter have been identified mainly in the PARK2 gene.

We report the evaluation of this gene and of its flanking region in a large family from the southwestern part of Colombia. The parents are first cousins and four out of their ten children were affected at juvenile age.

Molecular evaluation included typing of microsatelites (SSTRs) and direct sequencing of the exons of the gene. Our findings showed the presence, in a homozygous manner, of the mutation c.255delA, at exon 2 of PARK2. In addition, it was possible to identify a haplotype carried by both parents, and present in a homozygous manner in the affected children. A high rate of recombinants was observed in the analysed chromosomal region. Mutation c.255delA in PARK2 had been previously reported in families from both France and Spain.

Our findings reconfirm the role of the PARK2 gene in the etiology of Parkinson´s disease, in particular of its juvenile form. Furthermore, taking into account that the identified mutation had been previously found in European populations, it is likely that it came into Colombia from that continent. Alternatively, this mutation might have occurred in a recurrent manner in a close ancestor of the studied family. In order to verify both possibilities it would be necessary to test flanking markers of the mutation in both European and Colombian chromosomes carrying it. Such markers could be either STRs, as reported in this study, or SNPs.

Key words: Genetics of Parkinson´s Disease, Juvenile Parkinson´s Disease, Mutation c.255delA, Park2 Gene

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INTRODUCCIÓN

La enfermedad de Parkinson (EP) es una alteración del movimiento caracterizada por bradiquinesia, temblor e inestabilidad postural.¹ Los síntomas aparecen por la degeneración de las neuronas dopaminérgicas en varias regiones del cerebro, incluyendo la sustancia nigra, el locus cerúleos y los ganglios basales.² Los cuerpos de Lewy en estos núcleos son la piedra patológica angular de la EP. La muerte celular se acompaña de la aparición de inclusiones citoplasmáticas de cuerpos de Lewy, compuestas de varias proteínas incluyendo a–sinucleína, ubiquitina, parkin, neurofilamentos, etc.^3,4

El párkinson clásico (o tardío) aparece a partir de los 50 años. El parkinsonismo en las primeras décadas de la vida se consideraba, en el pasado, aparte de la EP; estos casos se agrupan ahora en dos categorías: EP de aparición temprana (EOPD, por la sigla en inglés de early onset Parkinson disease) y EP juvenil (JPD, por la sigla en inglés de juvenile Parkinson disease). La EOPD se inicia por debajo de los 45 años, mientras que la JPD lo hace en personas de 25 años o menos. La EP afecta a más del 1% de la población general mayor de 55 años⁵ y es, en frecuencia, la segunda enfermedad neurodegenerativa después de la enfermedad de Alzheimer.

Por varios años se creyó que la causa primaria de la enfermedad eran factores ambientales como infecciones virales⁶ y neurotoxinas (MPTP, metil–fenil–tetrahidropiridina). ⁷ Sin embargo, la identificación de mutaciones en ocho genes diferentes (SNCA,⁸ PARK,⁹ UCHL,¹⁰ DJ1,¹¹ PINK,¹² LRRK2,¹³ HTRA2¹⁴ y MAPT¹⁵) y de otras seis regiones cromosómicas candidatas (PARK,¹⁶ PARK4,¹⁷ PARK9,¹⁸ PARK10,¹⁹ PARK11²⁰ y PARK12²¹) asociadas con la enfermedad resalta la importancia etiológica de los factores genéticos. (Tabla n°. 1).

Se sabe que varios de los genes identificados recientemente interactúan en los mecanismos patogénicos de la EP; también se sabe que la proteína
parkin (codificada por el gen PARK2) tiene función de ligasa de las proteínas ubiquitinadas y que las mutaciones en parkin llevan a la pérdida de función, reduciendo su capacidad de regular la degradación de sustratos.²² También se ha observado que una forma O–glicosilada de la α–sinucleína es ubiquitinada por parkin, sugiriendo que la pérdida de función de esta última lleva a la acumulación de α–sinucleína.²³ Se ha reportado un paciente con mutaciones en parkin y positivo para cuerpos de Lewy.²⁴ Además, la sobreexpresión de a–sinucleína mutante inhibe las actividades proteolíticas asociadas al proteosoma.²⁵

Los pacientes con EOPD frecuentemente presentan mutaciones en el gen PARK2.²⁶ La presentación clínica de los pacientes con mutaciones en este gen es altamente variable y la edad de comienzo oscila entre 7–72 años.^27–29 Las mutaciones en PARK2 comprenden un amplio espectro, incluyendo deleciones y duplicaciones de exones, además de diferentes tipos de mutaciones puntuales que afectan a los doce exones del gen.^{9,27,28,30,31} En Europa se calculó que la frecuencia de estas mutaciones en familias con EOPD era del 50% y en pacientes esporádicos (sin historia familiar), del 18%.²⁸

Entre las numerosas mutaciones reportadas en PARK2 se destaca la c.255delA, que ha sido informada tanto en Francia^24,39 como en España.⁴⁰ Esta deleción afecta al codón 52 que codifica para Asn y en el codón 81 genera un codón prematuro de paro de la traducción³⁹ (por corrimiento del marco de lectura).

En estudios colombianos también se ha encontrado que PARK2 está implicado en la EP. De este modo se pudieron establecer, en 2001, en Antioquia, dos efectos fundadores de dos mutaciones en dicho gen.⁴¹ En ese estudio se identificó la mutación Cys212Tyr que fue reportada por primera vez en dos familias antioqueñas con EOPD; además se identificó la mutación c.321–3232insGT tanto en una familia como en un paciente esporádico.⁴¹ La mutación c.321–322insGT ya había sido informada previamente en una familia de origen francés.³⁹ Más recientemente se logró verificar el extenso efecto fundador de la mutación Cys212Tyr en un grupo de pacientes antioqueños con EOPD y se identificó una segunda mutación que segrega con pacientes portadores de dicha mutación.⁴²

El propósito de nuestro estudio fue analizar el gen PARK2 y su región flanqueante en una gran familia de origen caucano (suroccidente de Colombia) con enfermedad de Parkinson juvenil (JPD).

 

MÉTODOS

Evaluación clínica

Con base en la detección del caso índice se pudo extender la genealogía en la que se detectó que los padres son primos hermanos y que, hasta hoy, 4 de los 10 hijos están afectados (Figura n.º 1).

La edad de inicio osciló entre 14– 25 años. La detección de la familia se hizo en el Servicio de Neurología de la Facultad de Medicina de la Universidad del Cauca. La caracterización clínica la hizo el Grupo de Neurociencias de Antioquia (Tabla n.º 2).

A continuación presentamos los resúmenes de las historias de los cuatro individuos afectados por el párkinson juvenil.

Caso 2243: paciente de 59 años, de sexo masculino. Su enfermedad se inició con una crisis de temblor grave a la edad de 14 años. A partir de ese momento ha sufrido de temblor y rigidez progresiva que lo limita para la marcha independiente desde los 20 años y para el habla y la escritura desde los 30 años. Pudo estudiar y trabajar normalmente sin mayores limitaciones hasta los 18 años. Presenta dependencia para la marcha y para algunas actividades de la vida cotidiana, así como cefaleas y caídas frecuentes; no sufre de depresión y tiene buen sentido del humor. Su enfermedad es sensible a levodopa pero actualmente solo recibe tratamiento con biperideno porque la levodopa le causa movimientos involuntarios.

Caso 2249: paciente de 55 años, de sexo masculino. A la edad de 15 años comenzó a presentar temblor y movimientos distónicos a partir de un día en que al agacharse no se pudo levantar de nuevo con facilidad. Desde entonces aparecieron signos de rigidez en todo el cuerpo que se fueron haciendo más acentuados desde los 27 años. Trabajó parcialmente entre los 15–25 años. Considera que ha tenido más limitaciones por la rigidez que por el temblor. La enfermedad ha sido progresiva y sensible a la levodopa. Se queja de cefaleas frecuentes. Al examen presenta rigidez de moderada a grave en el cuello y las extremidades, postura y marcha parkinsonianas con inclinación del tronco. No tiene temblor ni distonía.

Caso 2248: paciente de 52 años, de sexo masculino. Desde los 25 años empezó a sufrir crisis de temblor en las 4 extremidades con duración de 20 a 30 segundos que se repetían en varias ocasiones al día y se incrementaban con los movimientos voluntarios. El cuadro parkinsoniano completo y permanente se instaló definitivamente a partir de los 30 años de edad. Ha sido sensible a la levodopa. El temblor mejora con levodopa y con biperideno el cual tiene que ingerir incluso en la noche para lograr reducirle la intensidad de modo que le permita dormir; sin embargo, el temblor lo despierta unas cuatro veces en la noche. Considera que el temblor lo ha incapacitado más que la rigidez. Usa apoyo para caminar y es independiente para las actividades de la vida diaria. Cuando no toma la medicación se vuelve totalmente dependiente. Al examen presenta rigidez generalizada, inclinación del tronco, temblor en reposo que se aumenta con los movimientos de intención, rueda dentada izquierda, marcha parkinsoniana y dificultad para frenar la marcha una vez iniciada.

Caso 2246: paciente de 43 años, de sexo masculino. La enfermedad se inició a los 15 años con temblor en las extremidades derechas, que luego comprometió la mano izquierda, pero nunca ha tenido temblor en el miembro inferior izquierdo. Inicialmente el temblor se presentaba por crisis de 10 minutos de duración en especial cuando se sentaba o se paraba; era temblor de reposo pero se acentuaba con los movimientos voluntarios. En los últimos 5 años ha tenido poco temblor. Desde los 25 años ha notado mucha rigidez que le causa dificultad para caminar. Desde esa edad notaba sus piernas como amarradas y comenzó a presentar limitaciones para trabajar. De los 15 a los 28 años trabajó muy poco y desde los 28 en adelante ha tenido muchas limitaciones para la marcha porque se acentuó la rigidez: 'Al caminar no paraba donde él deseaba sino donde el cuerpo quisiera'. Actualmente sufre muchas caídas en sus intentos de marcha. Es independiente para el autocuidado excepto cuando no toma los medicamentos. Su cuadro es sensible a levodopa. Ha tenido disartria desde los 15 años. Se controla con biperideno y levodopa. Presenta signos distónicos francos, temblor de reposo y rigidez.

Los seis hermanos restantes son asintomáticos y normales desde el punto de vista de la evaluación médica general y neurológica.

Evaluación molecular

Previo consentimiento informado, se tomaron muestras de sangre venosa a la madre y a sus 10 hijos. El padre ya había fallecido. El ADN se extrajo mediante procedimientos estándares. Se evaluaron 10 marcadores genéticos tipo STR (por la sigla en inglés de short tandem repeat) (microsatélites) de los cuales cinco se localizan dentro del gen PARK2 (Figura n°. 2).

Estos marcadores se amplificaron mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los doce exones del gen PARK2 se amplificaron por PCR9 y luego se secuenciaron en un ABI–310 (Applied Biosystems) utilizando el estuche de secuencia Big dye terminator (Perkin–Elmer). Las PCR se hicieron en un termociclador PE9700 (Perkin–Elmer), en volúmenes de 15 µL y 25 µL para los STR y los exones, respectivamente. Las temperaturas de alineamiento oscilaron entre 50–61 ºC. Se usó buffer a una concentración final 1X, 1,5 mM de MgCl2, 0,33 µM de cada primer, 1 unidad de Taq polimerasa, 10 pmol de cada deoxinucleótido (dNTP) y 50–100 ng de ADN genómico. La mutación c.255delA se analizó mediante PCR–RFLP (polimorfismo de longitud pleomórfica aleatoria), utilizando 5 unidades de la enzima de restricción BtsCI a 50 ºC, toda la noche. Los productos de restricción se analizaron en gel de agarosa al 2,5% y se tiñeron con bromuro de etidio.

Análisis de haplotipos

Una vez obtenidos los genotipos para todos los individuos de la familia, se introdujeron en una base de datos que posteriormente fue convertida al formato linkage. Los datos se procesaron con el paquete MEGA2⁴³ para luego analizarlos con las cadenas de Montecarlo implementadas en la aplicación Simwalk2.⁴⁴ Se dibujaron los haplotipos utilizando el programa Haplopainter.⁴⁵

 

RESULTADOS

La edad de inicio en los pacientes analizados (14–25 años) corresponde a la forma juvenil de la enfermedad (JPD). Todos los individuos afectados han presentado en algún momento de su vida temblor, rigidez y trastornos de la marcha. Sin embargo, mientras en uno predomina el temblor en otro lo hace la rigidez. Por lo menos dos de ellos han tenido movimientos distónicos asociados a la rigidez y el temblor. Llama la atención que en tres casos el temblor se inició de manera relativamente súbita y en forma de crisis antes de que se instalara un cuadro parkinsoniano persistente. En uno de ellos, incluso, las crisis de temblor le interrumpían con frecuencia el sueño. Tres de los cuatro afectados estaban en el estadio 4 de la escala de Hoehn Yar; el otro, en el estadio 3. En la escala unificada de párkinson tenían puntajes entre 69 y 121 mientras que todos los hermanos no afectados tenían un puntaje de cero, excepto una hermana asintomática con un puntaje de 1 que tenía leve rigidez en rueda dentada detectada con maniobras de sensibilización pero sin importancia clínica. Ninguno de los afectados presentaba demencia pese a que en el minimental puntuaban entre 20–26 y tenían alteraciones cognitivas leves. Todos tenían algunas limitaciones en las escalas funcionales por causa de la rigidez o el temblor. Todos eran sensibles a levodopa y consumidores de altas dosis de biperideno. La mayor consistencia se obtuvo para la escala Hoehn Yar y la menor discriminación, para el minimental (Tabla n°. 2).

El análisis de haplotipos reveló que los cuatro afectados comparten, en condición homocigota, toda la región evaluada, con excepción del marcador D6S386. Esta observación evidencia que los padres fueron portadores de un cromosoma idéntico por descendencia. Los individuos 2241 y 2465 presentaron cromosomas recombinantes en el intervalo D6S305–D6S980. Similarmente, los individuos 2242, 2244 y 2245 presentaron recombinaciones en el intervalo D6S437–D6S1581. Considerando las recombinaciones observadas en 2241 y 2465 junto con la extensión del haplotipo presente en los afectados, se pudo notar que el cromosoma mutante se caracterizaba por los alelos 1–2–2 en los marcadores D6S980–D6S1599–D6S1277, respectivamente (Figura n°. 1).

El individuo 2247 no estuvo disponible para esta parte del análisis. Se amplificaron los 12 exones del gen PARK2 a partir de muestras correspondientes a individuos afectados, excluyendo las deleciones homocigotas como la causa de la enfermedad en la familia estudiada.

El análisis de secuencia reveló una deleción homocigota de c.255delA (Figura n.º 3A) en el exón 2 de PARK2.

El análisis de restricción de este exón permitió identificar la cosegregación de esta mutación con el haplotipo que se encuentra en condición homocigota en los afectados. Los individuos sanos de la familia son portadores de dicha mutación. Esta deleción se localiza en el exón 2 de PARK2 y segrega con el haplotipo mínimo identificado 1–2–2 (Figuras n.º 1 y 3B).

 

DISCUSIÓN

El propósito de este estudio fue evaluar el gen PARK2 y su región flanqueante en una gran familia de origen caucano con enfermedad de párkinson juvenil (JPD). El gen con mayor implicación en la etiología de formas familiares y aun esporádicas de JPD y EOPD es PARK2.^28,42 En nuestro medio se han adelantado estudios previos en los que se han identificado al menos tres variantes genéticas en PARK2.^41,42 No obstante, el presente es el primer reporte de mutaciones en PARK2 en una familia colombiana de una región diferente a Antioquia.

La edad de inicio fue similar (14–15 años) en tres de los cuatro individuos afectados; en el cuarto los síntomas comenzaron a los 25 años. Se halló que los individuos con un inicio más temprano de la enfermedad eran fumadores. La observación de rigidez detectada con pruebas de sensibilización y la presencia del signo de la rueda dentada en un individuo sano (2244) pueden aportar a la controversia sobre la presentación de síntomas o signos en portadores de mutaciones en PARK2.^26,42 Sin embargo, esta persona era clínicamente asintomática y por lo tanto no hubo ninguna dificultad en considerarla como no afectada.

Llama la atención que esta forma de enfermedad de Parkinson juvenil se inicia con frecuencia en forma de crisis de temblor antes de instalarse un cuadro parkinsoniano persistente, al igual que la presencia de movimientos distónicos en por lo menos dos de ellos. La enfermedad es progresiva, afecta tempranamente la vida laboral y evoluciona con alteraciones cognitivas leves.

El análisis de haplotipos reveló que ambos padres comparten en una gran extensión el cromosoma analizado. Esto es compatible con su relación biológica cercana (primos hermanos). Este cromosoma se encontró en condición homocigota en los hijos afectados. Los hijos clínicamente sanos son portadores del cromosoma asociado con la enfermedad.

El secuenciamiento directo de los exones reveló la deleción en condición homocigota, solo en los individuos afectados, de una adenina (A) en la posición 255 del cDNA de PARK2 (c.255delA). Esta mutación causa el cambio del codón 52 (Asn) y en el codón 81 aparece un codón prematuro de paro de la traducción.³⁹ Esta proteína truncada carece de 385 aminoácidos que sí están en la proteína normal, la cual tiene 465 residuos.⁹

En el extremo carboxi de parkin se localiza un dominio ligasa de ubiquitina,²² que es esencial para la función normal de la proteína codificada por PARK2. De esta forma se asume que la condición heterocigota protege contra el desarrollo del proceso de enfermedad, pues el alelo normal es suficiente para proteger la célula de la acumulación de productos que deberían ir al proteosoma.²² Es decir, el alelo normal es dominante sobre el alelo mutante.

Considerando que la mutación c.255delA ya ha sido reportada previamente en Europa^24,39,40 y que los ancestros de la mezcla racial que se produjo en nuestro país en tiempos de la Colonia incluyeron un alto porcentaje de personas provenientes de España, es posible que esta mutación haya llegado a Colombia desde allí. Alternativamente, puede pensarse que esta mutación haya ocurrido en un cromosoma diferente en nuestro país. Para verificar si esta es una mutación recurrente o no, es necesario evaluar tanto los cromosomas europeos como los colombianos que portan la misma mutación con STR o SNP (polimorfismos de un solo nucleótido) cercanos físicamente a dicha variante genética. Si se observara un mismo haplotipo entre los diferentes cromosomas europeos y colombianos, se confirmaría que la mutación llegó a Colombia desde Europa.

 

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Recibido: mayo 23 de 2008
Aceptado: octubre 13 de 2008