INTRODUCCIÓN
El clorhidrato de clembuterol (CCL) [4-Amino-alpha-[(tert-butylamino) methyl]-3.5-diclorobenzil alcohol hidrocloruro] es un b-agonista adrenérgico sintético, sustancia blanca o ligeramente amarilla con peso molecular de 313,65 (1-3). Es usado como broncodilatador en medicina humana y veterinaria. Su uso como anabólico principalmente en bovinos en la actualidad es ilegal. Se ha demostrado que incrementa hasta en 15 % la síntesis proteica, y disminuye 18 % la deposición de grasa corporal (4,5).
El CCL provoca hipertrofia y neoformación del músculo a través de mecanismos de glucogenólisis -acumulación de nitrógeno para conformación de aminoácidos- y glucólisis -degradación de grasa-, lo que genera el incremento en el tamaño de las células musculares, principalmente del músculo esquelético (6-8). Su efecto promotor del crecimiento está mediado por la estimulación directa de los receptores b2 adrenérgicos localizados en el tejido muscular, y la variación de las concentraciones plasmáticas de hormonas catabólicas o anabólicas, como los glucocorticoides, la hormona del crecimiento o la insulina (9,10).
El efecto del CCL en el sistema endocrino ocurre por la liberación hormonal mediante las catecolaminas que liberan insulina, aumentan glucagón y estimulan la liberación de las hormonas adrenocorticotropa, somatotropa y gonadotropinas. Lo anterior disminuye la deposición de grasa al aumentar la actividad metabólica y el gasto energético con un incremento de la termogénesis; parte de la energía ingerida evita la formación de grasa, por el aumento de la concentración del monofosfato de adenosina (AMP) cíclico en el tejido adiposo. El trisfosfato de adenosina (ATP) se transforma en AMP cíclico que activa a las proteínas quinasas, las cuales por fosforilación estimulan a una lipasa intracelular que transforma los triglicéridos en ácidos grasos y glycerol (9-11).
Aunque el uso del CCL se ha prohibido en varios países, incluido México (3,12), la administración en la alimentación del ganado de manera clandestina ha sido un problema de salud pública en el ámbito mundial (3,5,11,13,14), debido al consumo de carne y vísceras (hígado) contaminadas con esta sustancia. Esto ocasiona procesos patológicos en el ser humano que se manifiestan con temblor muscular, sudoración excesiva, adormecimiento de extremidades, cefalea y taquicardia (8,15).
En el informe y análisis de Jiménez y colaboradores (16), en México se notificaron 2130 casos de intoxicación por CCL, entre 2002 y 2008. Jalisco, Distrito Federal, Guanajuato, Zacatecas y Michoacán fueron las entidades que más casos registraron. Jalisco fue el estado con mayor número de casos (35,25 %), seguido del Distrito Federal (23,94 %), y los casos por año se incrementaban significativamente. Sin embargo, no se han observado las cantidades detectadas en los pacientes afectados ni se ha establecido la dosis a la que estuvieron expuestos para provocar anormalidad. Así mismo, no se han valorado las posibles lesiones histológicas en los tejidos en los que el CCL puede acumularse. El objetivo del estudio fue evaluar el efecto del CCL sobre la ganancia de peso y las alteraciones histopatológicas en hígado y corazón en ratones expuestos a carne de conejo con CCL como único alimento.
MATERIALES Y MÉTODOS
En fase previa a este estudio se realizó un modelo biológico con conejos, a los que se les suministró en el agua de bebida una dilución de CCL (presentación en "sal mineral") a una dosis de 16 mg/kg de CCL (1,1815 mg/L/día), por un periodo de 35 días, al cabo de los cuales se sacrificaron; se obtuvo todo el tejido muscular y se determinó que su concentración de CCL fue de 7619 pg g-1.
Animales experimentales
Para este trabajo se utilizaron 20 ratones machos de la línea BAL/C4 de 6 semanas de edad, que se colocaron en jaulas individuales en condiciones de confort y bienestar animal. Se cumplió con los lineamientos de ética, técnicos, científicos y administrativos referidos por la Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación (Sagarpa) (17) para la investigación en animales.
Manejo del experimento
Los ratones se distribuyeron al azar en dos grupos (G1 y G2) y recibieron como única alimentación carne (deshidratada a 80 °C) de conejo, a razón de 3,5 g al día, y agua destilada a libre demanda, según los siguientes grupos:
G1: con carne de conejo conteniendo 7619 pg g-1 de CCL (n = 10).
G2: grupo control, carne de conejo con 0 residuos de CCL (n = 10).
Obtención de muestras y procesos realizados
Treinta y cinco días después del inicio de la experimentación se obtuvo el peso de los ratones. Se sacrificaron de acuerdo con lo establecido por la Sagarpa (18), y se colectó sangre completa en tubos sin anticoagulante. Se realizó el estudio anatomopatológico, para valorar los cambios macroscópicos, y se colectaron muestras de hígado y corazón que fueron fijadas en formol bufferado al 10 % (10:1); para la valoración histológica se usó tinción: hematoxilina-eosina.
Prueba de ELISA
Las concentraciones de CCL se obtuvieron a través de la prueba de ELISA (Ridascreen Clenbuterol Fast®, R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany), utilizando 20 µl del estrato de la muestra de tejido muscular, o de suero sanguíneo. Las absorbancias se leyeron con un filtro de 450 nm en lector de placas BIOTEK, y los valores obtenidos se expresaron en pg g-1 (11,19).
Análisis de datos
Para el análisis de resultados se aplicó un análisis de varianza con un diseño completamente al azar de un camino de clasificación, en el que el tratamiento se consideró como la fuente principal de la varianza, con 2 tratamientos de 10 unidades experimentales cada uno. En aquellas variables en que resultaron diferencias significativas se aplicó la prueba de comparación múltiple de Tukey (p < 0,05) (20).
Los cambios en el estudio anatomopatológico e histológico de los tejidos y órganos de los tratamientos se evaluaron de manera cualitativa y de apreciación con base en el grado de alteración de cada tejido, como lo describen Ke y colaboradores (21).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En el modelo biológico aplicado, con la inclusión de carne como única fuente de alimento con una concentración de 7619 pg g-1 de CCL para el G1, y de 0 residuos para el G2, los animales del G1 mostraron un mayor incremento del peso corporal a lo observado en el G2 (p < 0,05) (tabla 1).
Strydom y colaboradores (22), al valorar el comportamiento productivo y las características de la canal en bovinos al suministrar diferentes P-agonistas (zilpaterol, ractopamina y CCL), encontraron una mejor conversión alimenticia y ganancia de peso con menor deposición de grasa en la canal de los animales tratados con CCL, al compararlos con el grupo control (p < 0,05), seguidos de los animales tratados con zilpaterol. Sin embargo, se ha demostrado que el consumo de carne contaminada con CCL produce efectos adversos a la salud humana, debido a la estimulación del sistema cardiovascular. Sin registrar la concentración exacta, se ha informado que el consumo de carne contaminada con CCL con una dosis "moderada" produce adormecimiento de las manos, temblores musculares, nerviosismo y cefalea, y en dosis "más elevadas", se acentúa la taquicardia, lo que puede ocasionar necrosis del miocardio (14,23,24).
Al ensayo inmunoenzimático, las concentraciones séricas promedio de CCL fueron de 0,00 pg g-1 y de 4378 ± 437,57 pg g-1 para el G2 y el G1, respectivamente (p < 0,05). El suero sanguíneo y la orina son matrices en las cuales la detección de CCL se debe realizar en animales para abasto antes de su sacrificio, lo que permitiría un periodo de cuarentena necesario para su posible eliminación (7,11). Con el uso por tiempo prolongado de CCL en diferentes especies para abasto (bovinos, cerdos y aves), la permanencia de esta sustancia puede detectarse en la retina, el pelo y las plumas, debido a su afinidad por la melanina encontrada en estas estructuras, lo cual tiene un valor indicativo de su uso ilegal (8,25).
Con el precedente de detección de CCL en el tejido muscular de los conejos para alimentar a los ratones y su confirmación en músculo del G1 (5324 pg g-1) se prueba su capacidad de retención biológica y deposición en tejidos blancos. Se ha establecido que el tiempo de permanencia y cinética del CCL en suero sanguíneo se puede determinar en un periodo de cuatro a seis días, el cual va a continuar con concentraciones detectables en dependencia de la dosis y el tiempo en que es administrado. Esto representa un factor de riesgo de intoxicación para los consumidores, tal como se observó en la cadena alimenticia de este experimento al suministrar carne contaminada con CCL; en este punto es importante considerar la particularidad de su estructura química (contenido de cloro), por el tiempo de permanencia en tejidos consumibles que es de 56 a 60 días en hígado, y seis días en el tejido muscular (25).
Además, con los resultados obtenidos se respalda que el CCL es una partícula estable a temperatura de deshidratación (80 °C), con una vida media de acción prolongada. De acuerdo con el Codex Alimentarius (26), que establece una concentración de 2000 pg g-1 como "límite máximo" de residuos para el CCL en suero sanguíneo, en el G1 los valores detectados de CCL se consideran altos, lo que confirma la capacidad de acumulación de esta sustancia en la cadena alimenticia, y su efecto residual al considerar que los animales utilizados se encontraban en el segundo eslabón de la cadena alimenticia.
En la necropsia no se observaron lesiones macroscópicas evidentes en los animales de los dos tratamientos, salvo el aumento de volumen de las masas musculares con una menor deposición de grasa en el G1. El peso promedio del hígado de los ratones fue de 1,79 g y 2,58 g para el G2 y G1, respectivamente (p < 0,05).
En el estudio histopatológico del músculo cardiaco del G1 se observó engrosamiento y rizamiento de fibras musculares (10 de 10), pleomorfismo e hileración nuclear (figura 1). Así mismo, en el hígado de los animales tratados con CCL las lesiones observadas fueron: tumefacción y degeneración hidrópica de moderada a difusa, mitosis, picnosis y megalocitosis con megacariosis de hepatocitos (figura 2).
Los cambios observados en el músculo cardiaco concuerdan con lo referido por Van Vleet y Valentine (27), que consideran a la hileración y engrosamiento de fibras como un proceso de hipertrofia muscular, que de forma consistente mostraron solo los animales tratados con CCL. Las modificaciones observadas en el corazón sugieren que el CCL tiene acción sobre los receptores específicos del tipo β2 que se localizan en este tejido, que inducen a cambios estructurales, y su efecto es mayor en la musculatura esquelética (23,28). Con base en la estructura química, la acción del CCL se ha relacionado a la de las catecolaminas, con capacidad de interactuar con los receptores adrenérgicos del tipo β 2, lo cual activa el sistema proteína Gs asociado a la adenilatociclasa, que tiene un papel importante en la entrada de calcio a la célula y que interviene en la síntesis de proteína celular (3,6,29).
En el hígado de los ratones (10 de 10) expuestos a CCL se observaron alteraciones importantes, que ponen de manifiesto su efecto tóxico (10,28). El CCL en el organismo tiene una acción prolongada, se almacena principalmente en hígado y riñón, y se metaboliza por medio de reacciones de N-oxidación en hidroxiclenbuterol y conjugados glucorónicos (13,28). Zalco, Bories y Tulliez (29) refieren que los metabolitos del CCL, N-hidroxilarilamina y N-nitroso clembuterol, poseen propiedades tóxicas de riesgo tanto para la salud animal como para la del humano.
Badino, Odore y Re (9), al administrar 30 y 50 µg de CCL/kg/día a conejos, observaron efectos fetotóxicos (retraso en la osificación y paladar hendido). En otro trabajo se refiere que el posible efecto tóxico se debe más que nada a un efecto de estimulación adrenérgica y no a efecto de tipo genotóxico (30).
En los animales bajo tratamiento no se observó signología aparente (salvo incremento de actividad o cierto nerviosismo). Sin embargo, los síntomas de intoxicación por el consumo de hígado y carne de res contaminada con CCL en el estudio registrado por Carrola y colaboradores (31), en dos pacientes, estos presentaron tremor muscular, náuseas e incoordinación; a la auscultación mostraron un incremento de la frecuencia cardiaca (90/min), incremento de la presión arterial (140/80 mmHg), y al examen hematológico, leucocitosis 12,1-12,2 x 109 L-1, acompañada de neutrofilia 9,3-10,1 x 109 L-1, hipercalemia (2,7-2,8 mmol L-1) e hiperglucemia (9,5-12,1 mmol L-1).
En bovinos, y tal vez en otras especies para abasto, el uso clandestino e irracional del CCL se sigue dando de manera alarmante (3,11,29,31), por lo que debe actualizarse y aplicarse la normatividad en beneficio tanto de la salud pública como animal, instrumentarse programas permanentes para la vigilancia, el control y la erradicación del uso de esta sustancia y proponer alternativas (32) en las buenas prácticas de producción animal.
CONCLUSIONES
Al utilizar una concentración de CCL tres veces mayor que el máximo registrado como tóxico, el efecto observado fue una mayor ganancia de peso en los ratones expuestos a carne con CCL. El CCL favorece la ganancia de peso en ratones; sin embargo, las alteraciones histopatológicas observadas en hígado muestran un efecto hepatotóxico.