INTRODUCCIÓN
Los granos andinos, como quinua (Chenopodium quinoa Willd) y Tarwi (Lupinus mutabilis sweet) son alimentos originarios de la zona andina de Sud América [1,2], la quinua, es el grano, cuyo alto valor nutritivo ha generado un alto nivel de exportación del grano beneficiado, particularmente de Bolivia y Perú, actualmente toda la región andina, desde Colombia hasta el norte de Chile y Argentina, han incentivado su producción [3], ingresando a una competencia inusual. La demanda de mercado internacional ha favorecido la producción de 4 variedades de quinua real en Bolivia: Real Blanca, Toledo, Phisanqalla (grano rojo o café), y C´hiara (grano negro) [4]. Por otro lado, el Tarwi (Lupinus mutabilis sweet) que presenta alto valor nutritivo, tiene menor grado de estudio, lo que ha limitado su comercialización. Se debe destacar que el proceso de des-amargado de Tarwi y el proceso de beneficiado de la quinua son factores que elevan los costos de su comercialización.
Se han realizado muchos estudios sobre el efecto de consumo de quinua en la reducción del riesgo de enfermedades crónicas, entre las más reportadas están sus propiedades anti-oxidantes [5-7], anti-inflamatoria [8,9], inmunomodulador [10], anticancerígenas [11], hipo-colesterolemiante y antihipertensivo [12,13]. En base a estos estudios científicos se prevén perspectivas nutracéuticas de la quinua y aplicaciones funcionales beneficiosas para la salud humana [14]. Por lo que actualmente está siendo cultivada en América del Norte, Europa, regiones subtropicales de África y Asia, más de 50 países han iniciado su cultivo [3,15].
La quinua y el Tarwi presentan alta concentración de lisina, que repercute en el contenido de proteínas de alta calidad [14,16], característica poco frecuente en alimentos vegetales. Otra característica común es su Indice Glucémico Bajo [14], que hace que estos granos sean propicios para desarrollar alimentos modificados con alta propiedad nutricional que puedan ser administrados como aditivos nutricionales específicos.
Muchas de las enfermedades crónicas que afligen a la sociedad de un modo particular (cáncer, obesidad, hipertensión, trastornos cardiovasculares) se relacionan de un modo muy estrecho con la dieta alimenticia [17], por lo que, el buscar nuevas formas de consumo de alimentos altamente nutritivos como los granos andinos son necesarios, para incrementar su consumo en diversas formas.
En el presente estudio se identificó el porcentaje de hidrolisis biológica por aplicación de a-amilasa Termamyl Sc en harinas desengrasadas de granos andinos: quinua real blanca, quinua real negra (C´hiara) y Tarwi, con todos los componentes que forman parte natural de los granos, sin introducir compuestos que alteren el pH natural, para establecer las bases de obtención de aditivos nutricionales de mejor digestión.
MÉTODO
Materia prima
Los granos orgánicos certificados de Quinua Real Blanca, Quinua Real Negra y Tarwi fueron entregados por la empresa de alimentos Irupana Organic Andean Food S.A.
Obtención de harina de quinua blanca (QB), quinua negra (QN) y Tarwi (T)
Los granos fueron molidos en una moledora de granos BOSCH por 10 minutos, para luego ser tamizado en tamices de acero norma ASTME 11 [18], obteniéndose la harina compuesta.
Análisis proximal
El análisis proximal se determinó de acuerdo a métodos AOAC establecidas en la Norma Boliviana. Humedad, ceniza, fibra, lípidos, proteínas (N x 6,25) [19], los carbohidratos por determinación indirecta.
Cuantificación de azucares libres y totales
La cuantificación de azucares libres en harina de granos completa y desengrasada, se realizó por el método Dubois (Método fenol sulfúrico) por triplicado [19,20]. Las lecturas se realizaron en un espectrofotómetro Génesis 10S UV-VIS a 490 nm. Para azucares libres (QB y QN) se pesaron 100 mg llevando a 100 mL con agua destilada (100 mg.dL-1) se mezcló por 5 minutos, se centrifugo por 5 min a 3500 rpm, se tomó la muestra del sobrenadante. Para el Tarwi, se procedió por el método DNS después de una hidrolisis ácida en base a una curva patrón [21].
Almidones
La determinación de almidones se realizó por el método AOAC 996.11 [22], utilizando curva patrón de glucosa.
Enzima
Termamyl Sc, una a-amilasa termo estabilizable de Bacillus licheniformis, se utilizó para la licuefacción de almidones contenido en harina desengrasada de granos andinos. La actividad enzimática de la enzima de 120 KNU g-1, donde cada unidad de kilo novo a-amilasa (KNU) descompone 5,26 g de almidón por hora en condiciones normales, pH recomendado 5,4 - 5,8, dosaje recomendado de 0,15 - 0,45 Kg/ton de almidón [23], equivalente a una relación enzima/sustrato (E/S) 0,015 - 0,045.
Hidrolisis enzimática
Sobre la base de pruebas preliminares, tomando en cuenta la dificultad en la agitación por la consistencia provocada por la gelatinización de las diferentes muestras de quinua real blanca (QB), quinua real negra (QN) y Tarwi (T), se establecieron diferentes concentraciones de sustrato (almidón), en las quinuas y oligosacáridos en el tarwi (Cuadro 1), se realizó la hidrolisis de almidones en harina de los granos desengrasados por aplicación de la enzima Termamyl Sc, en reactores preparados con balones de 3 bocas de 500 mL conectado a refrigerante, en baño maría sobre platos térmicos con agitación y temperatura regulables, considerando que los granos contienen componentes propios que forman una matriz adecuada para la hidrolisis, no se utilizaron soluciones tampón ni adición de calcio. Se homogenizó a agitación constante, dejando ebullir por 5 min para la gelatinización, se trabajó a 85°C. Con base en datos de la ficha técnica de Termamyl Sc, con 20 uL (0,0252 g) de enzima por triplicado. Previa cuantificación de azucares reductores se inactivo con HCl 0,5 N para el seguimiento del proceso enzimático se utilizó el método de Fehling [24], realizando una dilución 1:6 para la QB, 1:2,5 para QN, para el Tarwi se utilizó el método Dubois con dilución 1:10.
Los parámetros cinéticos de Km y Vmax para Termamyl Sc en una matriz de harina de granos (QB, QN y T) sin grasas fueron estimados, en condiciones de pH propios de cada grano: QB, pH 5,6; QN, pH 5,5; T pH 5,0. Se utilizó la doble reciproca de Lineweaver Burk en base a la cinetica de Michaelis - Menten, con la siguiente ecuación.
Análisis estadístico
Las determinaciones se realizaron por triplicado y los resultados se expresaron como la media ± desviación estándar (DS). Se realizó el Análisis de Varianza (ANOVA) con el programa SPSS Statistics. Se utilizó la prueba de Duncan para el análisis proximal y Tukey para las demás evaluaciones.
RESULTADOS
Análisis proximal de Quinua Real Blanca, Quinua Negra y Tarwi
Los valores obtenidos del análisis proximal (Cuadro 2), se encuentran dentro rangos encontrados en otros estudios, particularmente de los carbohidratos totales en la quinua que varía desde 54,5 hasta 66,8 [25-27], está determinación de carbohidratos por diferencia incluye la fibra total dietética [28], factor que debe considerarse cuando se quiere valorar almidones u otro tipo específico de carbohidratos.
Como se puede observar, los carbohidratos en lupinus mutabilis representan 16,41 %, similar a otros reportes [29,30], la composición de carbohidratos según Gross R. et al (1988), corresponde a 15% de oligosacáridos consta de estaquiosa 70%, rafinosa 17%, sacarosa 10%, verbascosa 6% en 2 variedades de lupinus mutabilis, carbohidratos no digeribles a excepción de la sacarosa [30], la determinación de carbohidratos por diferencia en lupinus mutabilis llega hasta un 28,2% [31]. En relación a las proteínas los valores encontrados se encuentran dentro de los de referencia [25,30]. La alta concentración de proteínas da lugar a diferentes propuestas de consumo, el contenido de lisina (aminoácido esencial) de lupinus mutabilis se encuentra en nivel superior al recomendado FAO [32], con bajo contenido de aminoácidos azufrados por lo que se recomienda hacer combinaciones con cereales u otros [33], por las características cuantitativas y cualitativas es importante desarrollar diversos productos, artesanales y biotecnológicos para mejorar el consumo de los granos andinos estudiados.
Con respecto al valor de significancia (p=0,000), se concluye que la variables que influye en el análisis estadístico, son los componentes de los tres granos. Hubo diferencias estadísticamente significativas entre las dos variedades de quinua real negra y quinua real blanca en, grasa, fibra cruda y proteína, en relación a los componentes del tarwi las diferencias son significativas en todos los componentes.
Almidones
El contenido de almidones en quinua real blanca y negra (C´hiara) (Cuadro 3) son similares a los reportados por USDA (2013) de 52,2%. Los almidones de quinua han sido valorados por sus características particulares, entre las cuales resalta la alta estabilidad al congelamiento resistente a la retrogradación y deshidratación [34,37], su consumo es recomendado para un buen rendimiento y recuperación en el deporte [2]. El almidón de quinua es altamente ramificado y consiste en pequeños gránulos (partículas tamaño menor que 2 μm de diámetro), más pequeños que las partículas de cereales comunes [35], los almidones de la quinua han sido estudiados para su extracción por su alta estabilidad [36].
Azucares libres y totales
Como se puede observar en el Cuadro 4, nuestros resultados revelan alto contenido de azucares libres en la quinua real blanca y en la quinua real negra, coincidiendo con los reportados anteriormente [36]. En otro estudio, se reportó 2,9% de sacarosa, 1,4% de maltosa, 1,7% de glucosa y 0,2% de fructuosa, como parte de azúcares libres, en materia seca [37], un reporte anterior muestra el contenido de azucares libres hasta un 15% en la variedad Sajama con un contenido de glucosa 4,55%, fructuosa 2,41% y sacarosa 2,39% [38]. Se debe considerar que el método Dubois es sensible a todo tipo de carbohidratos, en este sentido la cuantificación de azucares libres incluye a compuestos fenólicos glucosilados, saponinas y otros compuestos unidos a carbohidratos [38]. La presencia de azucares libres probablemente sea variable, en relación a la época de cosecha, almacenamiento y condiciones ambientales en que se encuentren los granos. Los azucares totales encontrados fueron de 61,82% para QB, 59,65 para QN y 17,2 para T, valores cercanos a los obtenidos por diferencia en el análisis proximal. Los azúcares libres en el Tarwi se encuentran en cantidades insignificantes, sin duda debido al proceso de des-amargado exhaustivo.
Puesto que el valor-p es menor que 0,05, existe una relación significativa de todos los factores con un nivel de confianza del 95%. Se observa diferencia significativa (p=0,999) entre los subconjuntos 1, 2 y 3, azucares libres y azucares totales en harina compuesta y desengrasada de QB, QN y T
El valor de significancia por Tukey (p=0,999) muestra claramente que hay diferencias significativas entre los tres granos con respecto a los azúcares libres y totales en harina compuesta y desengrasada.
Hidrólisis enzimática
El proceso de hidrolisis de almidones por efecto de Termamyl Sc concluye aproximadamente a los 40 minutos para la quinua real blanca (QB) y a los 30 min para la quinua real negra (QN), a diferentes concentraciones de sustrato (almidón) establecidos en el Cuadro 1, la consistencia de la quinua negra en su gelatinización es muy densa, mostrando una gelificación a menor concentración que la quinua real blanca por lo que las concentraciones de trabajo fuerón diferentes, este aspecto indica una diferencia en las características físicas de los almidones de quinua real blanca y quinua real negra (C´hiara). Para el tarwi el proceso de hidrolisis a las concentraciones indicadas de oligosacaridos en harina de tarwi concluye cerca de los 60 min, los oligoscaridos contenidos en harina de tarwi sometidos a Termamyl Sc dan una producción de azucares reductores baja por lo que resulta despreciable el someter el sustrato a la enzima a-amylasa (cuadro 5), este resultado respalda un alto contenido de oligosacaridos tipo estaquiosa, rafinosa y verbascosa (30), oligosacáridos no digeribles, sin embargo se evidencia la posible presencia de malto oligosacaridos que contienen enlaces (1-4) entre glucosas que da lugar al resultado encontrado. Los resultados, junto a las referencias encontradas, indican que el tarwi es un alimento adecuado para personas que no quieren consumir carbohidratos, en especial para los que sufren de obesidad y diabetes.
Por cada 100 g de almidón contenido en harina de quinua desengrasada se observa cerca del 26% de hidrolisis expresados en equivalente de dextrosa (DE) por efecto de Termamyl Sc, lo que se traduce en que por cada 100 g de harina de quinua real se hidroliza alrededor de 13 g de sus almidones, considerando que en ambos casos (quinua real blanca y negra) el contenido de almidones es alrededor del 50%.La enzima Terammyl Sc tiene amplia aplicación en alimentos para la licuefacción, particularmente en la producción de siropes, así como en la industria alcohólica por lo que se la eligió para realizar este estudio siendo que requiere condiciones de pH ligeramente acidas y contenido de calcio bajo (40ppm) (39), la quinua por referencias contiene cerca de 47 mg% (40), en Lupinus mutabilis se reporta 370 mg% (41), razón por la que se trabajó sin adicionar calcio al proceso de hidrolisis.
Manteniendo la dosis constante de enzima Termamyl Sc de 0,0252 g, a diferentes concentraciones de sustrato (Cuadro 1), se obtuvo diferentes relaciones enzima/sustrato (E/S), encontrándose la constante de Michaelis- Menten (Km) y la velocidad máxima (Vmax) por la doble recíproca de Line-Weaver Burk (Cuadro 6), según los datos encontrados, la afinidad del sustrato a la enzima en las condiciones citadas es mayor en la quinua real blanca en relación al sustrato que se encuentra en la quinua real negra.
Para cada enzima, se considera eneralmente el Km y Vmax con sustrato libre, existen varios estudios de los parámetros cinéticos de a-amilasa de Bacillus licheniformis, se ha reportado un Km de 10,97 mg/mL y Vmax de 44,54 U/mL de la enzima aislada [42]. En el estudio de Ul-Haq et al (2010) a concentración fija de enzima después de su purificación de la amilasa a partir de Bacillus licheniformis EMS-6 se obtuvo un Km de 8,3 mg/mL y 2778 U/mg min-1 de Vmax con almidón de 0,1 a 1,2% [43], la comparación de Km y Vmax es difícil de realizar ya que depende del sustrato utilizado, condiciones de la reacción, cantidad de enzima, en nuestro caso no utilizamos el sustrato libre. En otro estudio de a-amilasa de Bacillus licheniformis inmovilizada utilizando 500 μg/mL de proteína (enzima) se obtuvo una Vmax de alrededor de 506 U/mg y un Km aproximado de 5 μM, consistente con el de alfa-amilasa libre [44]. Cuanto más pequeño el Km mayor la afinidad de la enzima siempre que se de en las mismas condiciones.
El proceso de hidrolisis para cada preparado se dio a diferentes consistencias, en el caso de las quinuas, la viscosidad es muy alta en la gelatinización, coincidiendo con datos de Ahamed et al. (1996) que reporta, una alta viscosidad sobre el 5% de almidón, llegando a su máximo entre el 7 y 10% [34], en nuestro estudio se evidenció que la quinua negra presenta mayor gelatinización a menor concentración de almidón, lo que indica diferencias en cuanto al tipo de almidones que constituyen estas 2 variedades, quinua real blanca (QB) y quinua real negra (QN), que podrían repercutir en la digestibilidad in vivo.
Con la quinua real blanca es factible trabajar hasta 10% de sustrato y con la quinua real negra hasta el 5% de sustrato por sus características de gelatinización en condiciones de laboratorio.
CONCLUSIONES
Se demostró que la aplicación de a-amilasa (Termamyl Sc) en una matriz de almidón contenido en harina de quinua desengrasada, de las variedades quinua real blanca y quinua real negra sin añadir ningún componente adicional origina cerca de 26% de azúcares reductores expresados en equivalentes de dextrosa, el efecto de a-amilasa en los oligosacáridos del Tarwi es muy bajo. Se obtuvieron los valores de Vmax y Km a dosis constante de enzima con variación de la concentración de sustrato.