Anopheles triannulatus (Neiva y Pinto, 1922) pertenece al grupo Oswaldoi del subgénero Nysorhynchus, y se encuentra distribuido en Argentina, Bolivia, Brasil, Colombia, Costa Rica, Ecuador, Guayana Francesa, Guatemala, Guyana, Nicaragua, Panamá, Paraguay, Perú, Puerto Rico, Surinam, Trinidad y Tobago, y Venezuela 1-3.
En Colombia, esta especie se distribuye en 29 de los 32 departamentos 4. Su importancia como vector en la transmisión de la malaria o paludismo es relativa, pues se basa en evidencia circunstancial o en la identificación de la proteína del circumsporozoíto (Circumsporozoite Protein, CSP) de Plasmodium vivax (genotipos VK210 y VK247), Plasmodium falciparum y Plasmodium malariae en hembras 5,6. Se ha considerado como un vector secundario local de la malaria en varias zonas de Brasil 7,8 y como vector dominante en el este de Loreto, Perú 9. Recientemente, se detectó An. triannulatus infectado con el genotipo VK247 de P. vivax en El Bagre, Antioquia, y con P. falciparum en Puerto Libertador, Córdoba, con una abundancia significativa de la especie en este último sitio (28 % del total de Anopheles spp.) 10,11. Sin embargo, a pesar de los reportes de infección natural con especies de Plasmodium, en Colombia no se ha incriminado como vector.
Anopheles triannulatus se considera un complejo de tres especies (Anopheles triannulatus s.s., Anopheles halophylus y Anopheles triannulatus C) por la amplia diversidad morfológica en los genitales masculinos, los huevos y las larvas. Además, se han reportado algunas diferencias en los patrones de distribución, en su ecología y su comportamiento 12-14. Asimismo, se conocen algunos resultados y datos moleculares sobre aloenzimas que permitieron diferenciar entre An. halophylus y An. triannulatus15 con base en el gen intemporal y el gen CPR; con el primero, no se pudieron diferenciar las tres especies que conforman el complejo An. triannulatus, en tanto que con el segundo se diferenciaron claramente 16. Esta amplia diversidad implicaría diferencias en la transmisión de Plasmodium spp. y en el comportamiento de picadura (antropofílico y zoófilo) según la distribución geográfica, como se ha propuesto para otras especies 17-20. En Colombia, solo se ha reportado la presencia de An. triannulatus s.l., pero las otras dos especies que conforman el complejo no se han encontrado en el país 10,21.
En Colombia, hay pocos estudios de genética de poblaciones y estructura genética de An. triannulatus s.l. encaminados a resolver el estatus taxonómico de la especie, lo cual permite estudiar los linajes y especies del complejo. En este sentido, el estudio de Rosero, et al. 21, es el más relevante, ya que los autores diferenciaron dos linajes (sureste y noroccidente) con flujo génico limitado y una estructura genética divergente con base en las secuencias del COI y del ITS2 (Internal Transcribed Spacer 2).
En esta investigación, los especímenes de An. triannulatus recolectados en Puerto Libertador, se agruparon en el clado noroccidente y se relacionaron filogenéticamente con individuos del Bajo Cauca (El Bagre) y el Urabá antioqueño (San Pedro de Urabá), y en el linaje sureste se agruparon los individuos recolectados en los departamentos del Meta y Amazonas (Leticia, Puerto Nariño y Tarapacá) 11, linajes que concuerdan con su ubicación geográfica.
A pesar de este hallazgo, persisten algunos vacíos, pues el estudio se restringió a cuatro departamentos y, en el caso del departamento de Córdoba (con muchas áreas de alta y baja endemia para malaria), solo se estudió la población de Puerto Libertador. Por ello, sería de gran importancia ampliar la recolección a todos los departamentos y municipios donde se encuentra distribuida la especie, para recabar información sobre el estatus real de An. triannulatus en Colombia. Además, se requieren otras herramientas moleculares para complementar el estudio de la morfología de los estadios inmaduros, los genitales de los machos y la morfometría geométrica, con el fin de acopiar información confirmada sobre este complejo en el país.
En objetivo del presente estudio fue establecer cómo se relacionaban las poblaciones de An. triannulatus de tres municipios endémicos para malaria y otros dos no endémicos en el departamento de Córdoba, estimando la distribución y la diversidad de haplotipos, calculando el flujo génico y haciendo la diferenciación genética de las poblaciones muestreadas, así como la relación filogenética de los individuos recolectados en el departamento de Córdoba con los de otras áreas de Colombia mediante el método de código de barras (barcoding) de ADN del gen de la citocromo oxidasa I (COI).
Materiales y métodos
Recolección y procesamiento de los mosquitos
Las recolecciones se hicieron entre agosto y noviembre del 2016 en cinco municipios del departamento de Córdoba utilizando trampas Shannon y CDC durante tres días, entre las 18:00 y las 00:00 horas (figura 1) (cuadro 1). La identificación taxonómica de las hembras de An. triannulatus s.l. se basó en la clave dicotómica para la identificación de anofelinos en Colombia 4. El ADN se extrajo del abdomen del insecto utilizando el método de altas concentraciones de sales descrito por Collins, et al.22, modificado por Atencia, et al.23.
Amplificación de la región de código de barras del gen COI
En la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utilizaron los cebadores universales LCO1490: 5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’ y HCO 2198: 5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’, en un volumen final de 30 μl y usando 1,5 mM de MgCl2, 0,2 mM de cada dNTP, 0,3 μM de cada cebador, 1X de solución tampón (con 1,5 mM de MgCl2), 2 unidades de Taq polimerasa (TopTaq™, Qiagen) y 2 μl de ADN, todo ajustado con agua ultrapura estéril 24.
El perfil térmico consistió en un primer ciclo de desnaturalización a 95 °C durante cinco minutos, seguido de 35 ciclos de desnaturalización durante 30 segundos a 94 °C, un alineamiento a 46 °C durante un minuto, una extensión a 72 °C durante un minuto y un paso final de extensión a 72 °C durante 10 minutos. Los productos amplificados, teñidos con bromuro de etidio, se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 %. La secuenciación de los productos de la PCR se hizó con el sistema de Macrogen, Inc., en un secuenciador ABI PRISM™ (Applied Biosystems).
Análisis de los datos
Las secuencias obtenidas se editaron y alinearon con el programa MEGA, versión 7.0 25 y, el alineamiento múltiple, con el programa CLUSTAL W 26. A cada secuencia de consenso se le hizo el alineamiento con el programa BLASTn 27, con el fin de comparar las secuencias de An. Triannulatus s.l. almacenadas en el GenBank y en Barcode of Life Data System (Bold Systems) 28.
El número de haplotipos y su frecuencia, el número de sitios polimórficos (S), el número promedio de diferencias de nucleótidos (k), la diversidad de haplotipos (DH) y la diversidad de nucleótidos (π), la prueba D de neutralidad de Tajima y la distribución de diferencias (mismatch), se calcularon con el programa DnaSP, versión 5 29. Los estimadores de estructura genética (FST) y de flujo génico (Nm) se estimaron en el programa Arlequin, versión 3.5 30.
Red de haplotipos y análisis filogenético
La red estimada entre los haplotipos caracterizados se graficó con el programa Network, versión 5.0 31 y el algoritmo median-joining32. El modelo evolutivo se infirió con base en los criterios de información Akaike (AIC) incluidos en el programa jModelTest, versión 2 33. Esta información se utilizó para la inferencia filogenética bayesiana con el programa MrBayes, versión 3.2 34.
Con la cadena de Markov-Monte-Carlo se obtuvieron 10 millones de generaciones. Para la construcción del árbol se utilizaron secuencias de An. triannulatus s.l. de Colombia reportadas en el GenBank: JX205111.1 - JX205113.1, HM022387.1-HM022389.1 y KY921784.1.
Resultados
Análisis de la región de código de barras del COI
Se recolectaron 148 hembras de An. triannulatus s.l. en las cinco localidades muestreadas (cuadro 1). La longitud de las secuencias del gen COIobtenidas de cada individuo fue de 655 nucleótidos, con un contenido promedio de A+T de 69 %. Se encontraron 44 haplotipos mitocondriales del gen COI (GenBank NA MF043261 a MF043304) (cuadro 2). Las secuencias presentaron 620 sitios conservados y 35 posiciones variables (21 sitios fueron parsimoniosamente informativos y 14 sitios de mutaciones únicas); se distinguieron 158 transiciones y 9 transversiones (cuadro 3). Las distancias genéticas intraespecíficas alcanzaron un valor máximo de 0,016, observado entre los pares de los haplotipos H32-H40 y H37-H40.
Diversidad genética, prueba de neutralidad y estructura genética
Los valores de los índices de diversidad genética y la prueba de neutralidad para las cinco poblaciones de An. triannulatus s.l. se muestran en el cuadro 4. Los promedios más altos en K, DH y π fueron los correspondientes a La Bonga (Puerto Libertador) y Santiago Abajo (Sahagún). La prueba de neutralidad arrojó valores negativos, con excepción de los especímenes de Arenoso (Planeta Rica), en los que fue positiva, pero no significativa (p>0,10). La distribución de diferencias fue unimodal, es decir, que había expansión poblacional (figura 2). Las distancias genéticas entre las poblaciones fueron bajas, en un rango de 0,00387 a 0,00516.
En general, los valores pareados de la estructura genética fueron de FST=0,01427 y los del flujo génico de Nm=17,27 para todas las poblaciones muestreadas, lo cual implica una diferenciación genética nula entre las poblaciones y un elevado intercambio de migrantes (cuadro 5).
Red de haplotipos y análisis filogenético
En la figura 3 se muestra la red inferida para las poblaciones de An. triannulatus s.l. El torso de la red está estructurado por los haplotipos 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 11, 16, 18, 19, 21, 23, 25, 29, 31 y 35; los haplotipos más frecuentes fueron H2 (25 %) y H21 (13,5 %). Estos dos haplotipos se establecieron en todas las poblaciones. El árbol filogenético obtenido con inferencia bayesiana evidenció un único clado monofilético para todos los haplotipos caracterizados de An. triannulatus s.l. en Córdoba; la segregación geográfica no se evidenció o no se definieron linajes dentro del clado estimado (figura 4).
Discusión
Según la inferencia filogenética bayesiana efectuada en el presente estudio, los ejemplares de An. triannulatus s.l. en Córdoba correspondían exclusivamente a un linaje monofilético agrupado en un clado. Los datos del código de barras evidenciaron una diferenciación genética nula entre las poblaciones sometidas a prueba, pertenecientes a áreas con una mayor transmisión de malaria en el contexto microgeográfico para el departamento de Córdoba.
En esta área se han establecido patrones similares para otras especies como An. darlingi35, An. albimanus19 y An. nuneztovari s.l. 36. Todas estas especies mostraron una gran diversidad genética homogénea en este nivel geográfico, donde no hay aislamiento por distancia o segregación genética (figura 4). Curiosamente, a pesar de las barreras importantes que son los ríos Sinú y San Jorge, y de las diferencias ecológicas y climáticas entre las zonas muestreadas (bosque húmedo tropical en Tierralta y Puerto Libertador, y bosque seco tropical en Montelíbano, Planeta Rica y Sahagún), Tierralta, Puerto Libertador y Montelíbano son localidades con gran endemia de malaria, y hubo pocos o ningún caso en Sahagún y Planeta Rica.
La diversidad de haplotipos fue significativa y la red permitió observar muchos compartidos por todas las localidades, lo que sugiere una historia evolutiva similar para esta especie en el departamento de Córdoba (figura 3). Otra evidencia de esta hipótesis es la agrupación de especímenes recolectados en Puerto Libertador con poblaciones de Antioquia (El Bagre, Zaragoza y San Pedro de Urabá), lo cual estructuraría el linaje noroccidente para An. triannulatus s.l. con base en marcadores moleculares como el COI y el ITS2 21.
Los valores estimados para FST y Nm sugieren un gran flujo génico entre las poblaciones muestreadas y una estructura genética nula; en este sentido, la diversidad genética de haplotipos y los valores de la prueba D de Tajima corresponden a una expansión de la población y no a la presión selectiva, lo cual implica que An. triannulatus s.l. comprende una sola población; estos resultados son similares a los de poblaciones de An. triannulatus s.l. estudiadas con base en secuencias del COI (no código de barras) en el río Amazonas, y el centro y el sur de Brasil 37. En Colombia, la distribución desigual de los linajes noroccidente y sureste evidenció una distribución bimodal, lo cual sugiere un cuello de botella o eventos de colonización entre las localidades muestreadas 21.
La expansión poblacional evidenciada por la prueba D de Tajima y la distribución de diferencias podría deberse a la presencia de haplotipos únicos en cada una de las poblaciones muestreadas, lo cual coincide con una gran diversidad genética (DH=0,90182). Valores similares se han registrado en especies como Anopheles punctimacula s.l. (DH: 0,6444 y 0,7222) 38, Anopheles sinensis (DH, 0,99) 39, Anopheles nuneztovari40 y Anopheles marajoara de linaje 1 (DH: 0,828) y de linaje 2 (DH: 0,780) 41.
Algunos de los haplotipos encontrados en este estudio ya fueron reportados en un trabajo realizado en Córdoba por Ahumada, et al., en el cual los haplotipos H2, H19, H21, H25 y H43 se nombraron como haplotipo 2; los H8 y H39, como haplotipo 8; el H10, como haplotipo 15; el H17, como haplotipo 6, y los H23 y H28, como haplotipo 3 42. Sin embargo, es importante destacar que las secuencias reportadas por estos autores registraron una longitud de 607 nucleótidos, cuyo primer nucleótido tiene correspondencia con el nucleótido 6 y, el último, con el de la posición 612 de las secuencias obtenidas en este estudio, razón por la cual un haplotipo de los reportados por ellos es similar a varios de los de este estudio 42.
El árbol filogenético evidenció dos clados: uno conformado por secuencias de individuos pertenecientes al municipio del Meta y el otro formado por dos subclados correspondientes a las secuencias de Córdoba y de Turbo, Antioquia, y el otro, por secuencias de Putumayo, aunque con un soporte de rama bajo; estos resultados también coinciden con los obtenidos por Rosero, et al.21.
Puede observarse que las secuencias de Córdoba y de Turbo, Antioquia, pertenecerían al linaje noroccidente y, las secuencias de Meta, al linaje sureste. Sin embargo, como ya se mencionó, el subclado correspondiente a las secuencias de Putumayo, que por ubicación geográfica debería haberse agrupado con los individuos del Meta para formar el clado sureste, se agrupó en un clado independiente con las secuencias de Córdoba.
Ello indicaría que hay más de dos linajes de An. triannulatus s.l. en Colombia, hipótesis que deberá corroborarse ampliando las recolecciones a otros departamentos donde se distribuye la especie y, también, aumentando el número de ejemplares.
En conclusión, según nuestros resultados, las poblaciones de An. triannulatus s.l. de Córdoba se comportan como una gran población, con un gran flujo de migrantes entre las localidades en estudio.