Monica Baquero Parra^* / Arlen Patricia Gómez^** / Patricia Hernández Rodríguez^***

^* Médica Veterinaria, Universidad de La Salle, M.Sc.(C) en Ciencias Veterinarias, Universidad de La Salle. Correo electrónico: mbaquero04@unisalle.edu.co

^** Médica Veterinaria, Universidad Nacional de Colombia, Ph.D. en Salud Animal, Universidad Nacional de Colombia-Universidad de Santiago de Compostela. Profesora Asociada de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad de La Salle. Correo electrónico: agomez@unisalle.edu.co

^*** L. Biología, Universidad Distrital, Especialista en Epidemiología, Universidad del Rosario. M. Sc en Biología, énfasis Genética Molecular, Pontificia Universidad Javeriana. Directora Grupo de Investigación Biología Molecular e Inmunogenética (BIOMIGEN). Docente Investigador, Departamento de Ciencias Básicas, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de la Salle. Correo electrónico: phernandez@unisalle.edu.co

Fecha de recepción: noviembre 26 de 2009.

Fecha de aprobación: febrero 26 de 2010.

La leptospirosis es una zoonosis ampliamente difundida, que afecta cerca de 160 especies salvajes y domésticas, las cuales se constituyen en reservorios latentes y son fuente primaria de contaminación para el hombre. Esta zoonosis es causada por la Leptospira sp., bacteria Gram negativa que tiene la capacidad de sobrevivir en la orina. Esto, sumado a la presencia de charcos, lagunas y aguas estancadas que se contaminan fácilmente y se convierten en un foco permanente de transmisión, hace de la leptospirosis una enfermedad de impacto en salud pública. La leptospirosis se diagnóstica utilizando la técnica convencional por microglutinación (MAT). Sin embargo, no existen criterios unificados respecto a los títulos considerados como positivos, originando un número relevante de falsos positivos y negativos. Por consiguiente, es necesario evaluar nuevas estrategias diagnósticas altamente sensibles y específicas para lograr un diagnóstico preciso y confiable. Con este artículo se busca hacer una revisión sobre el papel de las proteínas asociadas con patogenicidad y la utilidad de estudios de expresión génica, en la implementación de nuevas técnicas diagnósticas que permitan postular marcadores moleculares de infección.

Palabras clave: leptospirosis, proteínas de patogenicidad, marcadores moleculares, expresión génica.

Leptospirosis is a zoonosis disseminated around the world, affecting about 160 wild and domestic species, which are latent reservoirs and a main source of contamination for humans. This zoonosis is caused by Leptospira sp., Gram-negative bacteria have the ability to survive in the urine. In addition, the impact in Public Health is given for the presence of puddles, ponds and standing water that are easily contaminated and that is become a permanent focus of transmission. Leptospirosis is diagnosed by using the conventional technique microglutinacion (MAT). However, there are no standardized criteria of titles considered positive, resulting in a significant number of positives and negatives false. Therefore, it is necessary to evaluate new diagnostic strategies highly sensitive and specific to achieve a reliable and accurate diagnosis. This article seeks to review the role of proteins associated with pathogenicity and utility of gene expression studies in the implementation of new diagnostic techniques that allow postulating molecular markers of infection.

Keywords: leptospirosis, pathogenicity proteins, molecular markers, gene expression.

La leptospirosis es una infección zoonótica ampliamente distribuida alrededor del mundo, siendo más frecuente en zonas tropicales. La mayoría de las infecciones por Leptospira en bovinos de las áreas tropicales y subtropicales son causadas por Leptospira interrogans serovariante Hardjo (Srivastava et ál., 2006; Escamilla et ál., 2007; Hernández et ál., 2008).

La leptospirosis es producida por una espiroqueta del género Leptospira. Esta bacteria tiene forma de espiral y es flexible. Se clasifica como Gram negativa y posee un flagelo interno. Los sistemas de clasificación tradicional, basados en especificidad bioquímica y serológica, han diferenciado especies patógenas (Leptospira interrogans) y especies saprofitas (Leptospira biflexa). Adicionalmente, las especies se subdividen en más de doscientos serovares para Leptospira interrogans y más de sesenta serovares para Leptospira biflexa, según las proteínas que expresan (Bharti, 2003).

En los bovinos la infección con Leptospiras se establece a través de las membranas mucosas nasales, orales y de la conjuntiva o abrasiones de la piel. La incubación es de tres a doce días, posteriormente sigue una fase leptospirémica, donde las Leptospiras invaden órganos internos como el hígado, el riñón, los órganos reproductivos, las membranas fetales, el feto y la glándula mamaria en las vacas y los testículos, el epidídimo y las vesículas seminales en los toros, donde ocasionan un daño tisular severo. La severidad del cuadro clínico depende de las características de la serovariante involucrada. Con la aparición de los anticuerpos en el suero, la leptospiremia se reduce y las Leptospiras son eliminadas por fagocitosis en los órganos internos, a excepción del riñón donde sobreviven (Orrego et ál., 2003; Alfaro et ál., 2004; Hernández et ál., 2003; Victoria et ál., 2002; Kanchan et ál., 2008).

Las investigaciones conducentes al desarrollo de vacunas han clasificado éstas como recombinantes de proteínas, lipopolisacáridos, de DNA, inactivas y atenuadas (Wang et ál., 2007). El objetivo de este artículo es describir las características bioquímicas y moleculares de las proteínas de patogenicidad candidatas para la elaboración de inmunógenos para la prevención de la leptospirosis; así como, la utilidad que puedan presentar como marcadores moleculares de patogenicidad.

La identificación de proteínas antigénicas expresadas durante la infección tiene una implicación importante para el desarrollo de nuevas técnicas de diagnóstico serológico y para la producción de vacunas. La mayoría de las investigaciones relacionadas con los antígenos de Leptospira, se basan en los lipopolisacáridos, debido a que las variaciones en las cadenas laterales de carbohidratos son las responsables de la diversidad antigénica observada entre las diferentes cepas de Leptospira (Faine et ál., 1999).

Las espiroquetas, incluyendo las bacterias del género Leptospira, poseen una membrana citoplasmática y una membrana externa (Holt, 1978). A pesar de que la identificación y la caracterización de los componentes de la membrana externa de las especies de Leptospira es compleja, diversas técnicas han logrado determinar tres tipos de proteínas de la membrana externa (OMP, por sus siglas en inglés Outer Membrane Proteins): transmembranales, lipoproteínas y proteínas periféricas de la membrana (Haake y Matsunaga, 2002).

Las OMP desempeñan un papel importante en la patogénesis de la enfermedad, debido a que actúan como adhesinas (Bessen y Gotschlich, 1986; Isberg y Falkow, 1985; Miller y Falkow, 1988; Sansonetti, 1991), puntos de fijación de los anticuerpos (Murphy y Bartos, 1988; Saukkonen et ál., 1987), porinas (Jeanteur et ál., 1991; Li et ál., 1991; McGuinness et ál., 1990), receptores para proteínas solubles como los sideróforos (Stoebner y Payne, 1988) y proteínas del complemento (Hoffman et ál., 1992).

Las OMP's revisten gran importancia en investigación debido a que, por su localización estratégica, son responsables de la interacción de los patógenos con el hospedador (Sansonetti, 1991). Incluso se presume que las OMP's participan en los mecanismos de evasión de la respuesta inmune y, por ende, de la persistencia de las espiroquetas en el hospedador (Blanco, 1990).

Entre las proteínas aisladas de Leptospira interrogans serovar Copenhageni se encuentran: LipL32, LipL21, LipL45, LipL31, OmpL1, Flagelina/FlaB1, LipL36, LipL41, LipL71 y LigA (Nally, 2007). Dentro de éstas, las proteínas LipL31 y OmpLl son candidatas para la producción de inmunógenos.

La primera proteína transmembranal descrita en especies patógenas de Leptospira sp. fue la OmpLl (Haake et ál., 1993). Su estructura contiene por lo menos diez segmentos transmembranales |3 y canales de porinas en la bicapa lipídica (Shang, 1995). Los segmentos transmembranales |3 son antipáticos, lo que indica que los residuos hidrofóbicos orientados hacia la membrana, se alternan con otros residuos hidrofílicos orientados hacia el interior de la proteína (Haake, 1993). Las porinas, como la OmpLl, permiten la difusión de solutos hidrofílicos a través de la membrana externa hacia el periplasma (Haake y Matsunaga, 2002).

De acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la OmpL1, se ha determinado que no es una lipoproteína; por otra parte, las lipoproteínas poseen sitios de unión de peptidasa II, mientras que la OmpLl tiene sitios de unión para peptidasa I, los cuales se confirman por la presencia de una secuencia de aminoácidos N-terminal (leucina-serina-alanina) (Haake, 1993).

La expresión de la proteína OmpLl es controlada por genes diferentes (ompL1/1, ompL1/2 y ompL1/3). Sin embargo, se considera que las diferencias entre los genes ompL1, no afectan la inmunogenicidad de la proteína. Adicionalmente, como se mencionó en los párrafos anteriores, la OmpLl se postula un antígeno específico para el desarrollo de vacunas y diagnóstico serológico de leptospirosis, debido a que se encuentra en todas las cepas patógenas de Leptospira, y está ausente en las cepas saprofitas (Dong et ál., 2008). La estructura del gen ompLl consta de 960 bases que codifican una proteína compuesta por 320 aminoácidos (Haake, 1993).

La proteína LipL32 también es importante en la patogénesis de la enfermedad, debido a que se encuentra de forma abundante en la superficie de la membrana externa de las especies de Leptospira, siendo evidente su alta capacidad inmunogénica (Zuerner et ál., 1991). Asimismo, se encuentra en la membrana citoplasmática de la bacteria (Haake y Matsunaga 2002), anclada a la membrana externa a través de una modificación covalente de residuos de cisterna aminoterminal por ácidos grasos en el átomo de nitrógeno y un diacilglicerol en la cadena de sulfuro lateral (Haake et ál., 2000). Al igual que la proteína transmembranal OmpL1, la LipL32 es considerada como un blanco para el desarrollo de vacunas y nuevos métodos diagnósticos para leptospirosis (Guerreiro et ál., 2001; Zhang et ál., 2005), siendo considerada como un antígeno inmunodominante. Los hallazgos recientes demuestran que la LipL32 es el antígeno dominante durante la respuesta inmune humoral a leptospirosis en humanos, mostrando la mayor sensibilidad y especificidad en pacientes con la enfermedad, ya sea en fase aguda o convalecientes (Flannery et ál., 2001; Guerreiro et ál., 2001).

La lipoproteína LipL32 tiene una masa molecular de aproximadamente 26,7 kDa y su movilidad electroforética es de 32 kDa (Haake, 2000). Se considera que promueve la hemólisis mediada por esfingomielinasa SphH, por esta razón, esta lipoproteína también se conoce como Hap-1 (Proteína asociada con hemolisis) (Lee, 2000).

La expresión del RNAm del gen que codifica para la proteína LipL32 fue detectada en seis cepas de Leptospira, incluyendo cinco cepas de Leptospira interrogans y una de Leptospira borgpetersenii, lo cual indica que la LipL32 recombinante es un candidato óptimo como antígeno molecular para el diagnóstico sérico (Zhang et ál., 2005; Flannery et ál., 2001).

En el estudio realizado por Haake et ál., (1991) se demostró que la expresión de LipL32 es constante en las diferentes cepas de Leptospira interrogans, excepto en los serovares Bakeri y Fort Bragg, que presentaron niveles de expresión ligeramente menores.

A través de la técnica de fraccionamiento de membrana de plasmólisis alcalina, se determinó que tanto la LipL32 como la LipL41 tienen aminoácidos neutrales en las posiciones +2 y +3, lo que confirma la presencia de estas lipoproteínas en la membrana citoplasmática y en la membrana externa (Yamaguchi et ál., 1988).

Investigaciones realizadas con inmunoblot indican que los dominios C-terminal e intermedios de LipL32 son reconocidos en el suero, generando IgM específicas para la porción C-terminal tanto en pacientes en fase aguda como convaleciente (Hauk et ál., 2008).

Aunque los estudios de mutagénesis de transposones de LipL32 en Leptospira interrogans en los modelos animales de infección aguda o crónica, indican que el papel que desempeña esta proteína no es esencial en la patogénesis (Murray, 2008), no existen hallazgos que permitan descartar su función en la interacción entre la bacteria y el hospedero (Hauk et ál., 2009).

El gen que codifica la lipoproteína lipL32 está presente únicamente en las especies de Leptospira patógenas con un alto grado de conservación (Haake, 2004), siendo uno de los blancos principales de la respuesta inmune (Haake et ál., 2000).

Se considera que la LipL32 está involucrada en la patogénesis de la leptospirosis a través de la matriz extracelular, posiblemente debido a que los elementos presentes en la porción C-terminal con proteínas ortólogas de LipL32 funcionan como dominios de unión de la matriz extracelular en diferentes bacterias (Hauk, 2008).

En el estudio realizado por Zhang (2005) se demostró que las proteínas recombinantes de LipL32 y OmpL1 tienen un grado alto de reactividad con suero de pacientes infectados con Leptospira interrogans serovar Lai y otras Leptospiras patógenas. Los resultados de este estudio indican que estas proteínas serían candidatos para el desarrollo de vacunas contra la leptospirosis.

Es una lipoproteína de la membrana externa de 36 kDa. Se considera que su componente lipídico está modificado en el residuo cisteína amino terminal. Como las demás lipoproteínas de espiroquetas, la LipL36 se fracciona selectivamente con Triton X-114 hidrofóbico en la fase detergente. El procesamiento de la LipL32 es detenido por globomicina, un inhibidor selectivo de la señal peptidasa de la lipoproteína (Haake et ál., 1998). Casi el 16% de los residuos de la proteína madura son compuestos por alanina y los arreglos de la misma se presentan en su mayoría en pares o tripletas. Se presume que cerca del 38% de las secuencias de LipL36 en las regiones alfa-helicoidales son alaninas (Haake et ál., 1998).

La gran adaptabilidad a diferentes ambientes es una de las características de la Leptospira; sin embargo, las reacciones moleculares que se presentan para que esto sea posible aún no han sido identificadas. Se considera que la LipL36 es una proteína de expresión que se regula de acuerdo a las condiciones ambientales. En estudios inmunohistoquímicos se demostró la expresión de la LipL36 en cultivos in vitro a 30° C, pero no se detectó la infección de tejidos ni cultivos a una temperatura de 37° C. Esto indica una respuesta adaptativa del organismo a la infección, induciendo la disminución en la expresión de LipL36 (Nally, 2001).

Adicionalmente, en diversos estudios en cultivos bacterianos in vitro se han evidenciado diferencias en la expresión de LipL36. Se considera que existe gran cantidad de LipL36 en cultivos de Leptospira kirschneri durante su crecimiento logarítmico temprano; sin embargo, hacia la fase media del crecimiento, la presentación de la lipoproteína se ve disminuida. Se han realizado dos interpretaciones con relación a esto: posiblemente la expresión de la LipL36 es regulada para que hacia el final de la fase de crecimiento logarítmico no se exprese; por otra parte, se considera que la LipL36 es blanco para alguna proteasas endógenas y su digestión se hace más evidente hacia la fase tardía del crecimiento logarítmico. Sin embargo, debido a la conservación de la integridad de la LipL36 durante los experimentos, aún existen dudas sobre la hipótesis de digestión enzimática (Haake et ál., 1998).

Los hallazgos de la LipL36 sugieren que esta lipoproteína es una herramienta de gran utilidad para el estudio de la adaptabilidad de las especies patógenas de Leptospira (Haake et ál., 1998).

Es una lipoproteína que se expresa en la superficie de las membranas interna y externa de las especies de Leptospira, y actúa de forma sinérgica con OmpL1 (Haake et ál., 1999; Shang et ál., 1996). La LipL41 es una lipoproteína de 41 kDa hidrofóbica. La clonación molecular y la secuencia del gen lipL41, reveló un sitio de clivaje peptidasa de señal de lipoproteína con Leu-X-Y-Cys. Además, se determinó que la LipL41 es inhibida por la globomicina (Shang et ál., 1996).

El estudio de Nally et ál., (2007) evidenció que LipL41, LigA y LipL21 se encuentran en cantidades reducidas en los tejidos infectados con Leptospira al comparar la cantidad en cultivos in vitro.

En contraste con otros lipopolisacáridos, LipL41 y OmpLl, se encuentran antigénicamente conservados entre las especies de Leptospira (Shang, 1996). Se considera que LipL41 junto con OmpLl son excelentes candidatos para el desarrollo de vacunas, debido a su presencia durante la infección de mamíferos (Barnett et ál., 1999). En un estudio de animales inmunizados con OmpLl y LipL41 recombinantes en la membrana externa de Escherichia coli se determinó una tasa de supervivencia de 71%, comparado con 25% del grupo control. Además, se demostró que OmpLl y LipL41 no ejercen protección cuando se encuentran independientes (Haake, 1999).

En un estudio en el que se evaluó el tejido renal de hámsters infectados con Leptospira kirschneri se reveló la presencia de LipL41 en el lumen del túbulo renal, mientras que en el intersticio únicamente se identificaron lipopolisacáridos y OmpLl. Esto se debe posiblemente a que la migración de antígenos desde la membrana externa es selectiva o a que LipL41 es fácilmente degradada por las enzimas proteolíticas halladas en el citoplasma de las células o en el intersticio del riñón (Barnett et ál., 1999).

Debido a la dificultad para la producción de lipoproteínas en sistemas de expresión heterólogos, solamente se ha reportado a LipL41 como posible candidato potencial para la elaboración de biológicos. Sin embargo, algunos autores mencionan que LipL32, LipL45 y LipL21 también podrían ser utilizados para el desarrollo de vacunas (Wang et ál., 2007), debido a la conservación de la secuencia en las especies de Leptospira (Haake, 2004).

Después de LipL32, LipL21 es la lipoproteína más abundante en la membrana externa de Leptospira interrogans serovar Lai (Cufien et ál., 2002). Por otra parte, estudios realizados por el mismo autor determinaron que después de inocular hámsters con LipL21 recombinante, se identificaron anticuerpos producidos específicamente contra la proteína (Cullen et ál., 2003).

Se considera que LipL21 es una excelente opción para el desarrollo de vacunas, debido a que experimentos en que se ha clonado el gen lipL21 para insertarlo en vectores de expresión eucarióticos para inmunizar cobayos, demuestran una buena respuesta antigénica (He et ál., 2008).

Al igual que otras lipoproteínas descritas, LipL21 sólo se expresa en cepas patógenas de Leptospira, y no en cepas saprofitas (Cullen et ál., 2003; He et ál., 2008).

A este grupo de proteínas pertenecen LigA, LigB y LigC, las cuales tienen 12, 13 y 12 dominios, respectivamente. Estas son similares a proteínas de adhesión como la intimina de E. coli y Yersinia pseudotuberculosis. La expresión de LigA y LigB está controlada por las señales ambientales y la osmolaridad para alcanzar la unión de la Leptospira a las células del hospedador. Los hallazgos indican que estas proteínas son factores de virulencia en especies patógenas de Leptospira (Lin y Chang, 2007).

LigA es una proteína de 130 kDa, denominada proteína similar a inmunoglobulina de Leptospira. También se considera como blanco para la producción de vacunas. Esta proteína altamente inmunogénica se expresa en la infección por Leptospira en equinos (Palaniappan, 2002).

LigA es básicamente hidrofílica, con algunas regiones hidrofóbicas ubicadas en los residuos 4 a 24, 306 a 326, 402 a 422, 490 a 510 y 1034 a 1054. Consiste en regiones (3 con algunas regiones a-helicoidal. Se han detectado doce o más repeticiones en tándem de noventa aminoácidos. De acuerdo con algunas características de LigA, se presume que puede actuar como una molécula de adhesión y sólo se expresa in vivo. Además se propone a LigA como base para el desarrollo de nuevas técnicas de diagnóstico para identificar animales vacunados y animales infectados (Palaniappan, 2002).

La amplificación del gen ligA por medio de PCR, a partir de ADN de serovares patógenos como hardjo, icterohaemorrhagiae, grippotyphosa, y canicola, demostró que una secuencia similar se encuentra distribuida en varios serovares de Leptospira interrogans. Sin embargo, otros estudios han demostrado que las secuencias de ligA en los serovares pomona y grippotyphosa tienen mayor semejanza que las encontradas en canicola e icterohaemorrhagiae (Palaniappan et ál., 2002).

Los genes ligA, ligB y LigC codifican determinantes de virulencia en cepas patógenas (Matsunaga et ál., 2003). Las proteínas Lig han sido utilizadas como marcadores para el diagnóstico temprano de la enfermedad y como candidatos para vacunas (Yan et ál., 2009). Los genes que codifican estas proteínas son altamente conservados (70 - 99%) en cepas patógenas de Leptospira (McBride et ál., 2009). El gen ligB está presente en todos los aislamientos de cepas de Leptospira, mientras que ligA únicamente se encuentra en Leptospira interrogans y Leptospira kirschneri (Cerqueira et ál., 2009).

GroEl es una proteína inmunoreactiva dominante, que se encuentra en la fracción soluble de la célula. Esta proteína ha sido reportada en especies patógenas y saprofitas de Leptospira (Guerreiro et ál., 2001).

Se han identificado dos antígenos, p62 y p76, que actúan en sinergismo con GroEL y DnaK respectivamente. La expresión de las proteínas heat shock, GroEL y DnaK, se regula a temperaturas elevadas en los hospedaros mamíferos (Stamm et ál., 1991; Guerreiro et ál., 2001). GroEL y DnaK se reconocen en el suero de pacientes en la fase aguda y convaleciente de la enfermedad. De hecho, en el suero de pacientes en fase aguda sometido a inmunoblot, GroEL se encuentra en mayor proporción (45%) que LipL32 (37%). Sin embargo, sólo el 16% de los casos confirmados demostró seroconversión de GroEL entre pacientes en fase aguda a fase de convalecencia, en contraste con 50% de LipL32. Lo anterior sugiere que la inmunorreactividad observada en la fase aguda se debe a anticuerpos preexistentes o a una respuesta exacerbada (Guerreiro et ál., 2001). Se ha reportado que la mayor parte de la respuesta inmune a enfermedades infecciosas corresponde a proteínas de tipo heat shock (Stamm et ál., 1991).

El determinante antigénico dominante de GroEL es una región de veinte aminoácidos (Park et ál., 1999). La proteína GroEL puede tener reactividad cruzada con proteínas de otras bacterias, lo que limita la posibilidad de utilizarla como marcador específico de serorreactividad a especies de Leptospira (Guerreiro et ál., 2001).

La leptospirosis es una infección zoonótica ampliamente distribuida en el mundo. Debido a su alta prevalencia e incidencia en zonas tropicales, es indispensable aumentar el número de estudios e investigaciones en el país, para conocer la fisiopatología de la enfermedad y así plantear estrategias de control y prevención eficientes en especies altamente susceptibles como bovinos, caninos e incluso humanos. Debido al escaso conocimiento en su dinámica de crecimiento y a la expresión y comportamiento de las OMP's, es necesario plantear investigaciones en la búsqueda de nuevos candidatos para el desarrollo de pruebas diagnósticas y de vacunas, con el fin de garantizar un control eficiente de la enfermedad en el país.

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