ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

Evaluación de marcadores moleculares asociados con resistencia a gota (Phytophthora infestans L.) en papas diploides y tetraploides

Evaluation of molecular markers associated with resistance to late blight (Phytophthora infestans L.) in diploid and tetraploid potatoes

Juyó, D. K.¹ , Gerena, H. N.¹ , Mosquera, T.²

¹Estudiante Facultad de Agronomía, Universidad Nacional de Colombia.
²Profesora Titular Facultad de Agronomía, Universidad Nacional de Colombia. tmosquerav@unal.edu.co

Recibido: septiembre 22 de 2010 Aprobado: octubre 27 de 2011

Resumen

La papa, cultivo de importancia a nivel mundial es gravemente afectado por gota, enfermedad ocasionada por el oomycete Phytophthora infestans. Actualmente la forma más efectiva para combatir la enfermedad es mediante el desarrollo de cultivares resistentes al patógeno. Para esto, una estrategia es identificar genes que confieran resistencia al patógeno, para lo cual se buscan marcadores asociados con el carácter de resistencia. En este estudio se evaluaron marcadores moleculares tipo SCAR (Sequence Characterized Amplified Region): CosA, GP179, BA47f2 y Prp1 asociados con resistencia a P. infestans y el gen de resistencia R1, en 22 cultivares tetraploides pertenecientes a la subespecie andigena y cinco especies silvestres. Se evaluó el polimorfismo y se determinó si los alelos polimórficos permitían diferenciar genotipos resistentes de susceptibles. Se comparó el tamaño de los fragmentos obtenidos con los fragmentos esperados asociados con resistencia de acuerdo a reportes. El análisis se realizó considerando presencia/ausencia de los fragmentos: CosA₂₁₀, CosA₂₅₀, R1₁₄₀₀, R1₁₈₀₀, BA47f2₅₀₀, GP179₅₇₀, Prp1₃₀₀, Prp1₆₀₀, y Prp1₉₀₀. Los resultados indicaron que en los cultivares tetraploides y silvestres, se presentaron polimorfismos en todos los marcadores evaluados, con excepción del marcador GP179. No se encontró correlación entre el rasgo de resistencia y los alelos. Los resultados de este estudio muestran que hay repuesta diferencial a los marcadores entre las subsp. tuberosum y subsp. Andigena.

Palabras clave: Phytophthora infestans, resistencia a gota, marcadores diagnóstico, Solanum tuberosum subsp. Andigena.

Abstract

Potato is an important worldwide crop seriously affected by late blight disease caused by the oomycete Phytophthora infestans. Currently, the most effective way to control the disease is developing resistant cultivars to the pathogen by identifying genes that confer resistance to the pathogen. For this purpose it is important to find molecular markers associated with the trait. In this study, the SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) markers: CosA, GP179, BA47f2 y Prp1, associated with late blight and the resistant gen R1 were evaluated in 22 tetraploid cultivars from subspecie andigena and five wild potato species. Polymorphism was evaluated and it was evaluated if polymorphic alleles allow differentiating resistant from susceptible genotypes. The fragment length for each marker was compared to the allele size reported associated to resistance. The analysis considered the presence/absence of the fragments: CosA₂₁₀, CosA₂₅₀, R1₁₄₀₀, R1₁₈₀₀, BA47f2₅₀₀, GP179₅₇₀, Prp1₃₀₀, Prp1₆₀₀ and Prp1₉₀₀. The results indicated that both, tetraploid cultivars and wild potatoes, showed polymorphisms with all these markers, except with the GP179 marker. It was not found correlation between resistance and the presence of specific alleles. Evidence found in this study indicates that results obtained with molecular markers differed between subsp. tuberosum and subsp. andigena.

Key words: Phytophthora infestans, late blight resistance, diagnostic markers, Solanum tuberosum subsp. andigena.

Introducción

La papa (Solanum tuberosum L.) es considerada el tercer alimento de mayor importancia a nivel mundial (Visser et al., 2009). En el año 2006, Colombia fue catalogado como el tercer productor de papa en América Latina (15 millones de ton anuales) y el vigésimo a nivel mundial (CEVIPAPA, 2008).

La especie tetraploide Solanum tuberosum L. (2n=4x=48) originaria de los Andes suramericanos, comprende dos subespecies: tuberosum y andigena (Estrada, 2004). Posiblemente el cruce entre las especies silvestres y diploides, Solanum stenotomun y S.  sparcipilum, dieron origen a S. tuberosum subsp. andigena, especie precursora de S. tuberosum subsp. tuberosum, la cual está más adaptada a días largos, condición característica de algunas latitudes europeas y de algunos países suramericanos (Hawkes, 1990a). Esta especie se caracteriza por poseer altos contenidos de aminoácidos esenciales, presenta periodo vegetativo de tres a cuatro meses y tiempo de reposo del tubérculo corto. El tubérculo es de gran tamaño, tiene yemas superficiales y presenta resistencia parcial a gota (Estrada, 2004).

Los cultivares o híbridos de la subespecie andigena, se desarrollan preferiblemente en condiciones de días neutros o cortos y a una altura entre los 2000-4000 msnm (Hawkes, 1990b). Su periodo vegetativo es de cinco a siete meses, el tubérculo presenta un período largo de reposo, buena calidad para el consumo, alto porcentaje de almidón y resistencia parcial a gota. Estos cultivares son cultivados en la zona andina, en los países de:  Bolivia, Colombia, Perú, Ecuador y Venezuela (Estrada, 2004).

 La presencia de la enfermedad conocida como gota en Colombia es causada por el oomycete Phytophthora infestans, el cual es el patógeno más severo a nivel mundial para este cultivo. La estrategia de control de la enfermedad, adoptada por la mayoría de los agricultores, se basa en el uso y aplicación calendario de una amplia gama de agroquímicos, lo cual constituye cerca del 29,9% de los costos de producción (Agrocadenas, 2005).

La obtención de cultivares resistentes a gota ha sido acogida como una de las principales estrategias para combatir el ataque de esta enfermedad. La resistencia genética en papa es de dos tipos: resistencia de hipersensibilidad, denominada también específica, vertical o monogénica y la resistencia de campo, también denominada parcial, general, horizontal o poligénica (Gebhardt and Valkonen, 2001; Bormann, 2004; Estrada, 2004; Mosquera, 2007). Por un lado, la primera ha sido utilizada tradicionalmente para conferir resistencia a gota, por cruzamientos de cultivares comerciales con la especie silvestre Solanum demissum (L) (Oberhagemann et al., 1999). La segunda, confiere resistencia por disminución de la infección, la tasa de colonización del tejido y reducción de la esporulación. Los genes implicados en resistencia cuantitativa, son identificados mediante el análisis de locus segregantes para caracteres cuantitativos (QTL), en cruzamientos con materiales diploides que muestran resistencia de campo (Jaramillo y Rojas, 2003; Jacobs et al., 2010).

Para la identificación de QTL se ha recurrido al uso de marcadores genéticos, especialmente marcadores moleculares basados en PCR, que revelan diferencias genéticas entre organismos, individuos o entre especies. Por lo general, los marcadores no se encuentran dentro del gen de interés, pero si pueden estar cerca y actuar como señales, cuando se encuentran fuertemente ligados a genes o QTL que controlan la resistencia (Collard et al., 2005). Usualmente se localizan en regiones no codificantes del genoma y no se ven afectados por factores ambientales o del desarrollo de la planta.

La identificación de genes de interés agronómico ha sido posible gracias al uso de marcadores moleculares que se encuentran ligados a ellos y que permiten seleccionar genotipos que expresen rasgos de interés. En los programas de mejoramiento se conoce como Selección Asistida por Marcadores, MAS, (Marker Assisted Selection). Esta metodología involucra el uso de la presencia/ausencia de marcadores para asistir la selección fenotípica, haciéndola más eficiente comparada con la mayoría de metodologías de mejoramiento convencional (Collard et al., 2005).

En papa ya se ha empleado la selección asistida por marcadores. Son ejemplos: el empleo de marcadores para seleccionar material resistente al virus X de papa (PVX) (De-Jong et al., 1997; Ritter et al., 1991) y al virus M (Marczewski et al., 2006) y a los nemátodos Globodera rostochiensis y Globodera pallida (Meksem et al., 1995). Actualmente, se emplea también en mejoramiento el marcador StAOS2 que mapea en el cromosoma XI y hay cuatro alelos identificados que confieren cada uno de ellos resistencia y susceptibilidad a Erwinia carotovora y Phytophthora infestans (Pajerowska et al., 2008; Pajerowska et al., 2009). También se reportó el empleo del marcador GP94 que se asocia con resistencia duradera a gota, y que deriva su resistencia de Solanum phureja (Sliwka et al., 2010).

En la identificación de marcadores genéticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se han desarrollado marcadores dependientes de la secuencia denominados SCAR (Sequence Characterized Amplified Region), los cuales suelen ser codominantes, monolocus y requieren el uso de primers específicos para amplificar la región de interés, son robustos, de bajo costo y de fácil manipulación (Collard et al., 2005). Estos marcadores se desarrollan a partir de la secuenciación y clonación de RAPDs (Random Amplified Polymorphic DNA) (Arnedo-Andrés et al., 2002; Ballvora et al., 2002; Bautista et al., 2003; Gedhardt et al., 2004; Koveza et al., 2001; Parasnis et al., 2000) o de AFLPs (Amplified Fragment Length Polymorphisms) (Vos et al, 1995; Negi et al., 2000; Xu and Korban, 2002).

De acuerdo con el estudio realizado por Gebhardt et al. (2004),  mediante la evaluación de marcadores genéticos basados en PCR sobre cultivares mejorados de papa del Banco Genético Gatersleben of Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research de Alemania, los marcadores SCAR: CosA y BA47f2 se encuentran fuertemente asociados al gen R1,  ratificando las distancias genéticas calculadas por Ballvora et al. (2002) de 0,2 cM y 0,1 cM, respectivamente.

Adicionalmente, el marcador Prp1 (Pathogenesis-related glutathione S-transferase) ocupa una posición distal en el grupo de ligamiento IX de papa (Taylor et al., 1990) y se encuentra flanqueando un QTL que controla la resistencia cuantitativa a gota (Gebhardt and Valkonen, 2001; Mosquera, 2007).

El objetivo del presente estudio fue la evaluación del  polimorfismo en marcadores SCAR asociados con resistencia a gota, sobre diferentes genotipos tetraploides y genotipos silvestres de papa Solanum demissum, S. stoloniferum, S. andreanum, S. avilesii y S. tarijense, con miras a determinar la presencia de regiones genómicas asociadas con la resistencia en estos genotipos.

Materiales y métodos

Este estudio se llevó a cabo en el Laboratorio de Biotecnología Vegetal Antonio Angarita, de la Facultad de Agronomía de la Universidad  Nacional de Colombia, sede Bogotá.

Material Vegetal

Extracción de DNA

El DNA genómico fue extraído a partir de 500 mg de tejido foliar fresco en buffer de extracción que contiene Tris-HCL pH 8,0; 5M NaCl; 0,5M EDTA; 1% CTAB y 5% de β-mercaptoetanol, siguiendo el procedimiento descrito por Doyle and Doyle (1987). La calidad y cantidad del DNA fue evaluada mediante dos metodologías. La primera fue de tipo cualitativo, se realizó en geles de agarosa al 1% usando tinción con bromuro de  etidio y por comparación con un DNA estándar. En la segunda se empleó el NanoDrop® ND-100. La concentración final de DNA se ajustó a 20 ng/µl.

Análisis de marcadores tipo SCAR

Cinco marcadores SCAR con posición conocida en el genoma fueron analizados para determinar su polimorfismo (tabla 1 ). Estos marcadores fueron reportados por Gebhardt et al., (2004) y Taylor et al. (1990) como asociados y ligados a resistencia a P. infestans.

La reacción de PCR para los marcadores  GP179, R1, BA47f2 y CosA fue realizada en un volumen final de 15 µl que contenía 20 ng de DNA genómico,  buffer de reacción estándar  10x (Invitro Life Technologies, Karlsruhe, Germany), 0,2 mM de dNTP, 0,7 µM de cada oligonucleótido, 2,5 mM de MgCl₂ y 1 Unidad de Taq polimerasa (Invitrogen). El programa de PCR para estos marcadores fue el siguiente: temperatura de denaturación 93 ºC por 90 segundos, seguido por 40 ciclos de 93 ºC por 45 segundos, 45 segundos a la respectiva temperatura de annealing (tabla 1 ), 90 segundos a 72 ºC y por último un ciclo de extensión de diez minutos a 72 ºC.

Para el marcador Prp1 se modificaron las condiciones de PCR y el volumen final fue de 15,5 µl, el cual contenía 20 ng de DNA genómico, buffer de reacción estándar 10x (Invitro Life Technologies, Karlsruhe, Germany), 0,26 mM de dNTP, 0,6 µM de cada oligonucleótido, 3,9 mM de MgCl₂ y 1 Unidad de Taq polimerasa (Invitrogen). El programa de PCR correspondiente a este marcador fue: temperatura de denaturación 94 ºC por 120 segundos, seguido por 40 ciclos de 93 ºC por 45 segundos, 45 segundos a la respectiva temperatura de annealing (tabla 1 ), 72 ºC por 45 segundos y un ciclo de extensión  de ocho minutos a 72 ºC.

En todos los casos, se utilizó un control negativo, donde el DNA fue reemplazado por agua. Para el marcador R1 el control positivo utilizado fue el BAC, BA87d17, que contiene  el gen (Ballvora et al., 2002). Este BAC fue suministrado por Ballvora del Instituto Max Planck.

La electroforesis se realizó con buffer TAE 1x utilizando las condiciones de corrida específicas para cada marcador (tabla 1 ). Para estimar el tamaño de los fragmentos o alelos, se empleó marcador de peso de 100 pb de Fermentas y para la tinción se utilizó bromuro de etidio. Las imágenes fueron capturadas con el documentador de geles Molecular Imager ® Gel doc^TMXR.

Análisis de la caracterización genética

La presencia de los fragmentos obtenidos para cada marcador fue evaluada a través del programa Quantity One-4.6.7® (Biorad, 2007), obteniéndose una matriz binaria de presencia (1) y ausencia (0) (Ghislain et al., 2009; Mosquera, 2007). Los fragmentos que no se pudieron evaluar fueron declarados como perdidos (/). La similaridad de la distribución de los fragmentos de los marcadores asociados con resistencia a P. infestans, en los materiales de estudio, se calculó por medio de un análisis de distancias entre variables binarias, usando el índice de similaridad simple ó Simple Matching,  utilizando el programa NTSYS-PC2.1.

Resultados

Análisis de los marcadores SCAR

Gen marcador R1: se obtuvieron cinco fragmentos de diferente peso molecular, identificados como R1₂₅₀, R1₅₀₀, R1₈₀₀, R1₁₀₀₀ y R1₁₈₀₀  junto con el principal producto, el fragmento 1400 pb, los cuales fueron polimórficos para  los  individuos estudiados.

Marcador CosA: se obtuvo la amplificación de dos fragmentos característicos, el primero de 250 pb, el cual fue monomórfico y el segundo de 210 pb, polimórfico entre los materiales estudiados.

Marcador BA47f2: para este marcador el fragmento asociado con resistencia a P. infestans, en cultivares de la subsp. tuberosum, corresponde a 650 pb (Gedhardt et al., 2004). En este estudio, se pudo determinar un fragmento polimórfico de 500 pb, entre los materiales evaluados. El alelo BA47f2₅₀₀ se presentó en todos los niveles de resistencia y su ausencia fue característica en algunos de los individuos denominados como resistentes o altamente resistentes a gota (figura 1e).

La presencia/ausencia de los alelos marcadores R1₁₄₀₀ y CosA₂₁₀ asociados con resistencia a P. infestans generaron una distribución similar entre el material de estudio,  es decir, que la ocurrencia de estos fragmentos fue 100% similar para ambos marcadores (tabla 2 ). Con respecto al fragmento GP179570, su similaridad con los fragmentos R1₁₄₀₀ y CosA210 fue del 59% (tabla 2 ) valor asociado con la distancia genética reportada entre los marcadores R1, CosA y GP179 equivalente a 0,8 cM (Ballvora et al., 2002).

Comparando el índice de similaridad calculado entre BA47f2₅₀₀ y GP179₅₇₀, se observó una semejanza del 66% (tabla 2 ).

Finalmente, el índice de similaridad para el marcador Prp1 con respecto a los demás no se calculó, ya que éste se encuentra en el cromosoma IX y sería un error inferir algún tipo de ligamiento.

Especies silvestres

Se evaluó la presencia de los marcadores GP179, CosA, BA47f2 y Prp1 en las especies silvestres de papa Solanum demissum, S. stoloniferum, S. andreanum, S. avilesii y S. tarijense. Se pudo determinar que en todas se presenta el fragmento CosA₂₅₀, mientras que el fragmento CosA₂₁₀ se presentó únicamente en la especie S. demissum (figura 3a).

Respecto al marcador R1 (figura 3b), el fragmento R1₁₄₀₀ únicamente se presentó en S. demissum, mientras que el fragmento R1₁₈₀₀ aparece en S. demissum y S. tarijense especies catalogadas como resistente y susceptible respectivamente. Adicionalmente, con este marcador se observaron bandas polimórficas correspondientes a los alelos R1₂₅₀, R1₃₅₀, R1₅₀₀, R1₈₀₀, R1₁₀₀₀.

La presencia de los fragmentos R1₁₄₀₀ y CosA₂₁₀ fue exclusiva para S. demissum. En el caso del marcador GP179 la banda asociada con resistencia de 570 pb se encontró en todas las especies silvestres evaluadas y además en el genotipo S. tarijense se presentó un alelo de 1000 pb (figura 3c).

El marcador BA47f2, presentó un fragmento difuso de 500 pb entre los genotipos silvestres evaluados. Por lo tanto, no fue posible determinar si este fragmento fue poli o monomórfico. Lo que sí es distinguible con este marcador, es la diferencia en tamaño entre el fragmento asociado con resistencia de 650 pb y el que se reporta en este estudio de 500 pb.

Con el marcador Prp1 todos los genotipos silvestres aquí evaluados presentaron bandas polimórficas correspondiente a 300, 600 y 900 pb (figura 3e ).

Discusión

Marcadores SCAR

La presencia de los fragmentos, R1₁₄₀₀ y CosA₂₁₀ está correlacionada con el incremento de resistencia a P. infestans tanto en tubérculo como a nivel foliar (Gebhardt et al., 2004). Sin embargo, en el presente estudio, se observó que no existe una relación clara entre el nivel de resistencia a P. infestans y la presencia de los fragmentos R1₁₄₀₀ y CosA₂₁₀ (figura 1a y 1c), es decir, que estos fragmentos se presentaron tanto en individuos catalogados como resistentes como en no resistentes.

El alelo R1₁₈₀₀ fue asociado con la susceptibilidad a gota, tanto en follaje como en tubérculo  en cultivares de S. tuberosum subsp. tuberosum (Gebhardt et al., 2004), no obstante al analizar la relación entre la presencia de este fragmento y la resistencia, no fue posible identificar relación ni con resistencia ni con susceptibilidad, debido a que en todos los casos, aproximadamente el 50% de los individuos que presentaron este alelo son susceptibles y el 50% son resistentes (figura 1b). Los demás fragmentos obtenidos polimórficos en este estudio no se analizaron por su asociación con resistencia, ya que el estudio se concentró en el análisis de alelos reportados en estudios previos e identificados a través de análisis de asociación genética para evaluar estos resultados en materiales de S. andigena. Es importante evaluar el grado de asociación de estos alelos polimórficos sea por su efecto positivo o negativo con resistencia a gota y diferenciado entre la resistencia en follaje y campo, tal como lo sugiere Danan et al., (2009).

Para el marcador BA47f2 Gebhardt et al. (2004) reportan el fragmento de 650 pb como  asociado a resistencia a P. infestans, en cultivares de la subsp. tuberosum. En este estudio se presentó el alelo BA47f2₅₀₀, en los diferentes niveles de resistencia, tanto en materiales susceptibles como resistentes. Sin embargo, su ausencia fue en su mayoría en algunos de los individuos que fueron catalogados como resistentes o altamente resistentes a gota (figura 1e). Esta diferencia en pares de bases, entre en fragmento reportado por Gebhardt et al. (2004) y el presentado en este estudio puede ser atribuida a la variabilidad alélica que se presenta en materiales genéticos sometidos a diferentes condiciones ambientales asociadas con el origen, la distribución geográfica y el ambiente donde se desarrollan estas especies (Raker and Spooner, 2002). La variabilidad alélica entre S. tuberosum subsp. tuberosum y S. tuberosum subsp. andigena ha sido reportada con anterioridad por Raker y Spooner (2002), quienes por medio del uso de microsatélites han podido determinar altos niveles de polimorfismo y heterocigosidad entre estas especies de papa.

El estudio realizado por Sukhotu et al. (2005), en el cual evaluaron la diversidad genética entre cultivares de las subespecies andigena y tuberosum, a través de la presencia o ausencia de fragmentos generados por marcadores tipo RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphis) de DNA nuclear y diferencias polimórficas entre microsatélites de DNA citoplasmático, se determinó la presencia de fragmentos con diferente peso molecular para el mismo marcador. Estas diferencias permitieron separar los cultivares tuberosum de los andinos.

Al comparar la resistencia en campo para clones de S. tuberosum, S. andigena y S. phureja se observaron diferencias en cuanto a penetración, velocidad de esporulación y tamaño de la lesión en los diferentes cultivares (Guzmán, 1964) citado por  Estrada (2000), indicando claras diferencias entre el tipo de resistencia y el ataque del patógeno a nivel inter e intraespecífico.

El fragmento asociado con la resistencia a gota para el marcador GP179 reportado por Gebhardt et al. (2004) es de 570 pb; sin embargo, la presencia de este fragmento en los cultivares andinos evaluados, no pudo relacionarse de manera directa con la resistencia a P. infestans, debido a que se observó tanto en individuos resistentes como susceptibles, a diferencia de lo que ocurre en los cultivares europeos, aunque, para este estudio, la presencia de este fragmento fue más frecuente entre los individuos reportados como resistentes (figura 1f). Estos resultados poco concluyentes para GP179570 y opuestos en cuanto a su asociación con resistencia al patógeno, han sido reportados por  Gebhardt et al. (2004), Oberthageman et al. (1999) y Díaz et al. (2003). Para aclarar esta discrepancia es necesario adelantar un estudio fenotípico detallado de respuesta ante la presencia del patógeno en los genotipos de interés o hacer uso de nuevas metodologías que se están empleando para identificar genes que confieran resistencia a P. infestans evaluando diferentes materiales genéticos (Mirjam et al., 2010). De la misma forma, la ocurrencia en común del fragmento GP179₅₇₀ puede estar relacionada más específicamente con el hecho de que S. tuberosum subsp. tuberosum proviene de S. tuberosum subsp. andigena, observándose un fuerte solapamiento de caracteres, mas no necesariamente con la condición de resistencia a gota, la cual varía entre ambas especies (Huamán and Spooner, 2002).

El marcador Prp1 presentó tres fragmentos característicos en todos los materiales evaluados, Prp1₃₀₀, Prp1₆₀₀ y Prp1₉₀₀ (figura 2 ). Estos resultados difieren de los encontrados por Taylor et al. (1990). Según estos autores e(1990)l marcador Prp1 flanquea un QTL para resistencia cuantitativa a gota, lo que explica la relación observada entre la presencia del marcador y la resistencia. Otros autores también han encontrado resultados contradictorios para este marcador (Gedhardt et al., 2004; Oberhagemann et al., 1999; Raker and Spooner, 2002).

Similaridad entre los alelos marcadores

La similaridad encontrada en los resultados de los marcadores R1₁₄₀₀ y CosA₂₁₀, coincide con el nivel de resistencia que presentaron los diferentes individuos evaluados (figura 1a y 1c). Esta similaridad entre los marcadores R1 y CosA sugiere que se encuentran fuertemente ligados, resultado esperado, teniendo en cuenta que la distancia genética entre ellos para S. tuberosum es de 0,2 cM (Ballvora et al., 2002).

La similaridad entre el fragmento GP179₅₇₀ y los fragmentos R1₁₄₀₀ y CosA₂₁₀ en este estudio fue calculada en un 59% (tabla 2 ), valor asociado con la distancia genética calculada por Ballvora et al. (2002) de 0,8 cM entre los marcadores R1, CosA y GP179.  Igualmente, se ha encontrado que aunque GP179 está flanqueando el QTL que contiene el gen R1 (Gebhardt et al., 1991; Meksem et al., 1995), en el caso de cultivares tetraploides colombianos los alelos del marcador GP179₅₇₀ ligados a R1, fueron inespecíficos para identificar la presencia de este gen en dichos cultivares. Similar resultado fue reportado por  Díaz et al. (2003) quienes no pudieron asociar el marcador R2 con resistencia, ya que dicho marcador fue encontrado en genotipos resistentes y susceptibles.

La similaridad calculada entre el alelo BA47f2₅₀₀ y los alelos R1₁₄₀₀ y CosA₂₁₀ fue del 48% (tabla 2 ). Este valor dista de lo reportado por Ballvora et al. (2002) en donde estos calculan una distancia genética entre los marcadores mencionados, equivalente a 0,1 cM. Esta diferencia puede ser atribuida a que el alelo aquí reportado corresponde a un alelo de 500 pb para los cultivares de S. tuberosum subsp. andigena y no de 650 pb como lo reportaron Gebhardt et al. (2004) para los cultivares de S. tuberosum subsp. tuberosum. Esto permite concluir, que no se pueden aplicar de manera directa los resultados obtenidos en S. tuberosum subsp. tuberosum a los demás materiales de papa. Esto implica que se deben hacer mayores esfuerzos para encontrar marcadores moleculares diagnósticos que apoyen los trabajos de mejoramiento genético en Colombia.

Para el índice de similaridad calculado entre BA47f2₅₀₀ y GP179₅₇₀, se observó una semejanza del 66% (tabla 2 ), acorde con la distancia genética aproximada de 0,9 cM y la ubicación de estos dos marcadores dentro del cromosoma V.

Especies silvestres

En el análisis de las especies silvestres se determinó que en  todos los materiales estudiados  el fragmento CosA₂₅₀, estuvo presente, mientras que el fragmento CosA₂₁₀ se presentó únicamente en la especie _{S. demissum} (figura 3a), este resultado está en consonancia con lo reportado por Gebhardt et al. (2004), en donde, el fragmento CosA₂₁₀ está presente en cuatro accesiones de S. demissum y en S. dulcamara, especies silvestres, que presentan resistencia a P. infestans.

La presencia de los fragmentos R1₁₄₀₀ y CosA₂₁₀ fue exclusiva para S. demissum, indicando co-segregación de estos alelos, debido a su alto grado de ligamiento. Aunque la resistencia generada por el gen R1 derivada de S. demissum fue quebrada por el patógeno, se ha encontrado en materiales que presentan el gen R1, que genera un grado de resistencia de tipo cuantitativo (comunicación personal, Ballvora, 2009). El fragmento R1₁₈₀₀ aparece en S. demissum y S. tarijense especies catalogadas como resistente y susceptible respectivamente (figura 3b).

El alelo GP179₅₇₀ se encontró en todas las especies silvestres evaluadas (figura 3c ). El marcador BA47f2, presentó un fragmento difuso de 500 pb sin llegarse a definir como fragmento polimórfico o monomórfico, debido a la pobre resolución que presentó este marcador. Es importante resaltar que aunque este marcador mapea a 0,1 cM del gen R1 (Gebhardt et al., 2004), y podría constituirse al igual que el marcador CosA₂₁₀ en importante herramienta para selección, su baja resolución, la cual se evidencia también en este estudio, no permite hacer extensivo su uso.  

Con el marcador Prp1 todos los genotipos silvestres aquí evaluados presentaron bandas polimórficas correspondiente a 300, 600 y 900 pb (figura 3e ). Por lo tanto, es necesario tener en cuenta, para estudios posteriores, las interacciones epigenéticas y de genotipo por ambiente que puedan estar asociadas con cambios en el nivel de resistencia y la presencia de estas bandas.

De acuerdo a los resultados de esta investigación tanto en los cultivares tetraploides y silvestres estudiados, se identificaron polimorfismos con todos los marcadores evaluados, específicamente en los fragmentos que han sido reportados por su asociación con resistencia a P. infestans, exceptuando al marcador GP179 en el fragmento de 570 pb que fue monomórfico. Adicionalmente, no se encontraron los mismos resultados reportados para S. tuberosum subsp. tuberosum en la totalidad de los marcadores evaluados, indicando que no es posible aplicar directamente la presencia de marcadores moleculares asociados con resistencia a gota, entre las subsp. tuberosum y subsp. andigena.

Con base en este estudio se recomienda realizar caracterizaciones fenotípicas de la resistencia a P. infestans más precisas que permitan estimar la resistencia a nivel de tallo y follaje, ya que en campo se observan manifestaciones de resistencia y susceptibilidad que no han podido ser bien evaluadas con la escala que se ha aplicado y posiblemente esto dificulta la convergencia de los datos moleculares con las evaluaciones fenotípicas.

Agradecimientos

Los autores agradecen al Instituto Max Planck para Mejoramiento Genético por su apoyo y especialmente al Dr. Agim Ballvora por la donación del control positivo para el gen R1 y al CIP por los datos de caracterización fenotípica.

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