Producción de Astaxantina en Haematococcus pluvialis bajo diferentes condiciones de estrés

Astaxanthin Production in Haematococcus pluvialis under different stress conditions

Judith Elena Camacho Kurmen ¹, Gloria González ², Bernadette Klotz ²

¹ Docente Investigadora del Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico de la Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca, Bogotá-Colombia. Doctorado en Biociencias, Universidad de la Sabana, Bogotá, Colombia
² Doctorado en Biociencias, Universidad de la Sabana, Bogotá, Colombia

Correspondencia: jelenacamacho@hotmail.com

Recibido: 15/02/2013 Aceptado: 23/05/2013

RESUMEN

Las microalgas son fuente de un gran número de compuestos bioactivos de interés industrial, como los carotenoides que se utilizan como colorantes naturales en alimentación animal y humana, así como en la industria farmacéutica, cosmética y en la acuicultura. Además se han propuesto como agentes efectivos en la prevención de una variedad de enfermedades, debido a su capacidad antioxidante, inmunoregulaora, anti-inflamatoria y anti-cancerígena. El ketocarotenoide astaxantina es el más importante desde el punto de vista biotecnológico.

Hoy la mayor cantidad de astaxantina es producida por síntesis química y es vendida a un precio de US $2500/kg. El alto precio y el incremento en la demanda para este compuesto, especialmente de origen natural, en las diferentes industrias, hace que sea de interés la producción astaxantina a partir de microalgas como el Haematococcus pluvialis, que acumula cantidades importantes (más del 4%/g de peso seco) y de mejor calidad que las obtenidas por otras fuentes como levaduras y plantas.

La acumulación del pigmento en H. pluvialis ocurre durante la transformación de la microalga desde el estado vegetativo (fase verde) a aplanospora (fase roja) cuando cesa su crecimiento en la fase estacionaria. Los tipos de estrés que inducen a la acumulación de astaxantina son temperatura, intensidad lumínica, ciclos de luz/oscuridad, concentración de nutrientes, pH, especies reactivas de oxígeno, sales y presencia de inhibidores de procesos metabólicos a diferente nivel.

Es importante resaltar que esta microalga es de difícil cultivo; así como en la obtención del pigmento en cantidades de interés, debido a su ciclo celular complejo. De igual forma, un mayor entendimiento de las bases moleculares de la relación -condiciones de estrés-inducción- acumulación de astaxantina en H. pluvialis, podría ser útil para aumentar la productividad de astaxantina.

Palabras clave: carotenoides, Haematococcus pluvialis, microalga, astaxantina, condiciones de estrés.

ABSTRACT

Microalgae are a source of a large number of bioactive compounds of industrial importance, such as carotenoids used as natural colorants in food and feed, as well as in pharmaceuticals, cosmetics and aquaculture. They also have been studied as effective compounds for the prevention of different diseases due to their antioxidant, immunoregulatory, anti-inflammatory and anticarcinogenic properties.

In biotechnology applications astaxanthin is the most important ketocarotenoide. Currently most astaxanthin is produced by chemical synthesis and sold at U.S. $ 2500/kg. The high price and increasing demand of this compound in different industries, especially of natural origin creates an interest in the astaxanthin production from microalgae as Haematococcus pluvialis that accumulate significant amounts (more than 4%/g dry weight) and better quality what is obtained from sources such as yeast and plants.

The pigment accumulation in H. pluvialis occurs during the transformation of microalgae from the vegetative state (green phase) to aplanospora (red phase) when growth ends in the stationary phase. The types of stress that induce astaxanthin accumulation are temperature, light intensity, cycles of light / dark, nutrient concentration, pH, reactive oxygen species, salts and presence of metabolic processes inhibitors at different levels.

Is important to take in account that this microalgae is hard to grow and obtain the pigment in amounts of interest could be complicated due to complex cell cycle. Similarly, a better understanding of the molecular basis of the relationship, stress-inducing conditions, astaxanthin accumulation in H. pluvialis, might be helpful for increasing productivity of astaxanthin.

Key words: carotenoid, Haematococcus pluvialis, microalgae, astaxantina, stress-conditions.

INTRODUCCIÓN

Los carotenoides son un grupo de pigmentos encontrados en la naturaleza en plantas, y a nivel microbiano. Tienen un rol funcional en el desarrollo, fotosíntesis y estabilidad de la membrana, dando protección al daño fotodinámico (1-4). Se han caracterizado al menos 700 carotenoides, son precursores de fitohormonas y proveen adaptación ambiental (5,6).

Los carotenoides ejercen una función protectora por su alto poder antioxidante y también son importantes ingredientes de la dieta humana. Algunos estudios sugieren que previenen algunas enfermedades crónicas y ciertos cánceres (6).

Por otra parte, se ha analizado la ruta biosintética de carotenoides, conociéndose dos rutas (5). Además se han identificado 25 genes carotenogénicos, que producen diferentes funciones catalíticas en las síntesis de carotenos (7) y algunos de estos genes han sido clonados y expresados funcionalmente en E. coli. (4,8,9) Estos son componentes esenciales de todas las células eucariotas fotosintéticas (10).

El alga unicelular H. pluvialis es una de las mejores fuentes de carotenoides secundarios rojos como la astaxantina, Figura 1, en especial para producirla biotecnológicamente. La astaxantina tiene uso farmacéutico, cosmético y como aditivo de pigmentación en la acuacultura (salmón) (1,11-13) y para yemas de huevo (14,15).

Recientemente ha llamado la atención como un suplemento nutricional, siendo inhibidor de la peroxidación de lípidos, reductor de la inflamación gástrica. Adicionalmente, disminuye el riesgo de arteriosclerosis y previene la carcinogénesis (14), además tiene potencial neuroprotector e inmunomodulador (11) y sirve como alimento nutracéutico por su alto poder antioxidante (8,12,17,18).

La demanda mundial para I²-caroteno de origen natural está alrededor del 15 a 20%, una similar demanda para astaxantina de origen natural está emergiendo en el mercado nutracéutico que mueve billones de dólares. Además la producción biotecnológica a partir de H. pluvialis, es ventajosa sobre la síntesis química y la extracción a partir de crustáceos (19).

Química de la astaxantina

La molécula de astaxantina tiene dos carbonos asimétricos localizados en las posiciones 3 y 3’ sobre los dos anillos bencénicos al final de la molécula. Diferentes enantiomeros de la molécula son resultantes de la unión de los grupos hidroxilo a los átomos de carbono, que son centros de asimetría. Figura 2.

Cuando los grupos hidroxilo se unen sobre el plano de la molécula se dice que están en la configuración R y cuando los grupos hidroxilo se unen bajo el plano de la molécula se dice que están en la configuración S. Así, los tres posibles enantiómeros son designados R,R’; S,S’ y R,S’(meso). El Haematococcus primeramente contiene monoesteres de astaxantina (20).

La composición de los esteres de astaxantina en Haematococcus es similar a la de los crustáceos, fuente de dieta natural de los salmones. Siendo el contenido de astaxantina en quistes de Haematococcus ; aproximadamente de 70% monoesteres, 25% diesteres y 5% libre. El alga Haematococcus provee la configuración 3S,3’S de astaxantina, mientras la levadura Phaffia contiene 3R, 3’R astaxantina pura, y la astaxantina sintética es una mezcla de los tres isómeros (20).

Condiciones de estrés ambiental en cultivos de H. pluvialis

Fisiológicamente la acumulación de astaxantina en H. pluvialis ocurre en respuesta a varias condiciones de estrés ambiental como; alta intensidad de luz, limitaciones de nitrógeno, fósforo y estrés por sal (14,21,22).

El cambio morfológico en H. pluvialis de células vegetativas verdes, para incrementar el número de las células, a células con quistes rojos que acumulan astaxantina es inducido por algunos factores, tales como; temperatura alta, deficiencia de nutrientes (nitrato, magnesio, sulfato y fosfato), alta intensidad de luz, alta salinidad y estrés oxidativo (12,17,23,24). Sus quistes maduros son a menudo responsables del color rojo sanguíneo visto en el fondo seco de rocas afuera de charcos y de baños de aves. Este color es causado por astaxantina la cual se cree protege los quistes maduros del detrimento de los efectos de los rayos UV, cuando están expuestos a los rayos solares directos (25).

En el ciclo de vida del H. pluvialis se ha observado que las células verdes vegetativas con dos flagelos crecen autotróficamente en la luz y heterotróficamente en la oscuridad (26). El H. pluvialis es una microalga que puede crecer bajo condiciones fotoautotróficas, heterotróficas y mixotróficas (27).

Otras de las condiciones de estrés ensayadas son: estrés de nutrientes, alta intensidad de luz, alta salinidad (7,28), pH y nutrientes orgánicos como acetato (9) ó combinación cloruro de sodio/acetato de sodio, aumentando el contenido total de carotenoides y contenido total de astaxantina (29). En la Tabla 1 se pueden observar en forma general las diferentes condiciones de estrés ensayadas en los estudios revisados (1-51), incluyendo el uso de fotobioreactores, mezclándolo con ciclos irregulares de luz/oscuridad (17).

Ruta de biosíntesis de Astaxantina en H. pluvialis

En la biosíntesis de carotenoides el primer paso es la condensación del geranil-geranil difosfato (GGPP) a fitoeno, modificado por la enzima fitoeno sintasa (PSY), como se observa en la Figura 3.

Los siguientes pasos son llevados fuera de la membrana localizando enzimas como; fitoeno desaturasa (PDS) y licopeno β-cyclasa (LCY). Según estudios realizados la fitoeno desaturasa es regulada por los niveles del mRNA y se ha establecido que los carotenoides secundarios se acumulan fuera del cloroplasto, siendo transportados del sitio de biosíntesis (cloroplasto) al sitio de acumulación (vesículas localizadas en el citoplasma) (1,9).

Las rutas metabólicas secundarias sirven para explorar nuevas estructuras químicas a mínimos costos, en especial a través de la identificación de enzimas que pueden actuar sobre diversos sustratos (5). Todas las enzimas de la ruta son reguladas por genes y son sintetizadas en el citoplasma de las células como precursores polipéptidicos (3).

La ingeniería genética es una opción para mejorar la ruta biosintética de los carotenoides para producir astaxantina (8) en H. pluvialis (9), modificando el gen de la fitoeno desaturasa (PDS) (11) o usando los genes carotenogénicos en Saccharomyces cerevisiae (19) como fitoeno desaturasa (crtl) y la bifuncional fitoeno sintasa/licopeno ciclasa (crtYB) (41).

En la fitoeno desaturasa (PDS) se ha estudiado también la duplicación de genes a PDS1 y PDS2, (10), lo cual no ha sido reportado en H. pluvialis. La biosíntesis de astaxantina en Haematococcus sigue la ruta general de carotenos hacia la formación del β-caroteno.

En estudios realizados in vitro e in vivo utilizando diferentes inhibidores en el análisis de la producción de astaxantina en H. pluvialis han encontrado otras enzimas β-caroteno ketolasa (BKT), β-caroteno oxigenasa (CRTO) y β-caroteno hidroxilasa (CHY o CRTR-B), Figura 4. El BKT convierte el β-caroteno a cantaxantina vía equinenona, siendo regulado por el CHY resultando en la formación de astaxantina. Los genes para ΂-caroteno desaturasa (ZDS) y carotenoide isomerasa (CRTISO) no han sido reportados en Haematococcus (9,29).

Se han observado actividades biofuncionales para la actividad separada de β-caroteno hydroxylasa y ketolasa regulada por dos genes separados, uno de los cuales ( crtS ) se ha clonado en otros organismos (19). Además se sugiere que se puede involucrar otra enzima en el proceso de síntesis de astaxantina, por ser este un carotenoide, como la plastido terminal oxidasa (PTOX); la cual se ha expresado bajo condiciones de estrés para mejorar la producción de carotenoides (42). Aunque los pasos específicos de biosíntesis de astaxantina son llevados afuera del citoplasma, las enzimas de la ruta carotenoide parecen estar localizadas en los cloroplastos (9,29).

A pesar de que algunos genes reguladores para enzimas de la ruta biosintética de carotenoides han sido identificados en varias especies, incluyendo algas, aún no se conoce bien la regulación de la carotenogénesis in vivo (9).

Correlación condiciones de estrés - expresión genética en cultivos de H. pluvialis durante la producción de astaxantina

La dilucidación de las rutas sintéticas de carotenoides y el enorme progreso en la clonación de genes; estableciendo los genes, las enzimas implicadas y conociendo como es el proceso y su regulación (1), han aportado las herramientas necesarias para realizar ingeniería genética y así incrementar la síntesis de carotenoides mediante el aumento a la tolerancia a condiciones de estrés (5,14,15). La mayoría de manipulaciones va dirigida a aumentar el contenido de licopeno y β-caroteno, aprovechando la sobreexpresión de la fitoeno desaturasa (PDS) (1) y fitoeno sintasa (PSY) (14). Además se evidencia la existencia de una sobrerregulación de un múltiple mecanismo de defensa antioxidante, espacialmente y temporalmente, para proteger las células del H. pluvialis en contra del estrés oxidativo (24).

La expresión de genes carotenogénicos, fitoeno sintasa (PSY), fitoeno desaturasa (PDS), licopeno ciclasa (LCY), β-caroteno Ketolasa (BKT) y β-caroteno hydroxilasa (CHY), se aumenta bajo las condiciones de estrés de nutrientes, alta intensidad de luz en combinación con cloruro de sodio/ acetato de sodio (29). El estrés de nutrientes y la alta intensidad de luz inducen la expresión de los genes biosintéticos de astaxantina, BKT y CHY, transitoriamente. El aumento de la expresión de estos genes se observó con acetato de sodio y cloruro de sodio/acetato de sodio, mientras la expresión fue demorada con cloruro de sodio (29).

Diferentes expresiones de genes carotenoides durante la carotenogénesis indican su probable regulación en los diferentes estados de acumulación del carotenoide. En un estudio realizado en el 2001, se reportó un alto nivel de expresión para genes PSY y CHY, cuando las células estuvieron expuestas a alta intensidad de luz y cloruro de sodio (14,29). En la familia de genes PSY se han identificado los genes PSY1,PSY2 y PSY3, en condiciones de estrés ambiental; como sequía y presencia de sal, estableciendo que el gen PSY3 es importante en el flujo de la regulación de carotenoides en respuesta a condiciones de estrés (43,44) lo cual no ha sido reportado en H. pluvialis.

El primer estudio que presenta la regulación de carotenogénesis general y específica para astaxantina bajo la influencia de nutrientes y otras condiciones de estrés, se realizó en el 2008, analizando el nivel de expresión y de metabolismo usando inhibidores transcripcionales y transduccionales (29).

En la Tabla 2 se presenta una relación de algunos estudios que nos permite correlacionar condiciones de estrés- expresión genética, teniendo en cuenta las determinaciones realizadas y las instituciones involucradas (grupos de investigación).

En la Tabla 3 se presenta la relación de las diferentes instituciones y grupos de investigación que se encuentran trabajando en esta temática, identificando los diferentes métodos de análisis propuestos por cada una, correlacionándola con la determinación realizada, el país y el año de publicación.

CONCLUSIONES

Aunque existen un gran número de estudios de la influencia de diferentes condiciones de estrés sobre la expresión de genes carotenogénicos en H. pluvialis , se estableció que estudios sobre la influencia de otros factores de estrés o de todos aplicados en forma simultánea son muy limitados, así como estudios que relacionen estas condiciones con la expresión de genes carotenogénicos durante la producción de astaxantina.

Los estudios usando varios inhibidores indican que la carotenogenesis en general y la inducción de carotenoides secundarios está regulada a nivel transcripcional y transduccional, y se constituye en un tema de interés a investigar para entender los genes involucrados, las proteínas y la actividad enzimática durante la inducción de acumulación de carotenoides secundarios, en especial astaxantina.

Respecto a los grupos que trabajan esta temática, vemos que es un tema de interés en varias instituciones alrededor del mundo en países como; Alemania, Estados Unidos, Japón, India, Corea, China, Turquía, involucrando no solo el estudio de la correlación condiciones de estrés, expresión genética, producción de astaxantina, sino también el uso de diferentes métodos de análisis y la ingeniería genética, ya sea en el mismo H. pluvialis u otros microorganismos como E. coli o S. cerevisiae; siempre en la búsqueda de conocer mejor la ruta biosintética, las proteínas involucradas, las enzimas y los genes expresados para mejorar la producción de astaxantina.

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