Artículo de investigación tecnológica

Desarrollo y validación de una metodología analítica por HPLC-DAD para la cuantificación de Warfarina Sódica en una preparación extemporánea

Development and validation of an analytical method by HPLC-DAD for quantification of Warfarin Sodium in an extemporaneous preparation

Marcel Berrío¹, Mary Trujillo², Bibiana Margarita Vallejo³, Hélber de Jesús Barbosa⁴

¹ Maestría en Ciencias Farmacéuticas, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá, D. C., Colombia. E-mail: mberriom@unal.edu.co.

²Grupo Aseguramiento de la Calidad, Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá, D. C., Colombia. E-mail: mtrujillog@unal.edu.co.

³Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá, D. C., Colombia. E-mail: bmvallejod@unal.edu.co.

⁴ Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá, D. C., Colombia. E-mail: hdbarbosab@unal.edu.co.

Recibido para evaluación: 21 de marzo de 2013.
Aceptado para publicación: 23 de mayo de 2013.

RESUMEN

En este trabajo se llevó a cabo el desarrollo y la validación de una metodología analítica por HPLC para la cuantificación de Warfarina Sódica en una suspensión para uso hospitalario. La selectividad se evaluó frente a los excipientes y compuestos de degradación; la linealidad en el rango de concentraciones comprendido entre 0,05 y 0,15 mg/mL; la precisión se estudió en los niveles de repetibilidad y precisión intermedia y la exactitud en tres niveles de concentración que corresponden al 75%, 100% y 125%. Los resultados muestran que la validación de la metodología por HPLC es selectiva, lineal, precisa y exacta; por tanto, es confiable para ser utilizada en la cuantificación del activo Warfarina Sódica en una suspensión extemporánea y también en estudios de estabilidad de dicha preparación.

Palabras clave: Warfarina, validación, HPLC-DAD, preparación extemporánea.

SUMMARY

In this work was carried out the development and quantification of an analytical methodology for quantification of Warfarin Sodium in an extemporaneous suspension for hospital use. Evaluation of specificity was achieved against its excipients and degradation compounds. The selectivity was evaluated against the excipients and degradation compounds. Linearity studies were performed in a range of concentration between 0.05 to 0.15 mg/mL. Precision was evaluated in levels of repeatability and intermediate precision and accuracy in three concentration levels corresponding to the 75, 100 and 125%. The results show that the validation of the methodology is selective, linear, accurate and precise; therefore, it is reliable for use in the quantification of active warfarin sodium in the extemporaneous suspension.

Key words: Warfarin, validation, HPLC-DAD, extemporaneous preparation.

INTRODUCCIÓN

La posibilidad de utilizar fármacos cumarínicos como la Warfarina Sódica, administrados por vía peroral, ha brindado tanto a los médicos como a los pacientes, una terapia eficaz como anticoagulante; sin embargo, este fármaco presenta una alta incidencia de efectos adversos, entre los cuales el sangrado es el más común y peligroso, llegando a ser fatal. El estrecho margen terapéutico del fármaco, la gran variabilidad interindividual en la respuesta al tratamiento, así como sus numerosas interacciones farmacológicas, hacen de la Warfarina un fármaco difícil de manejar [1-4].

La Warfarina Sódica puede ser administrada tanto por vía intravenosa como peroral; sin embargo, el efecto anticoagulante completo de una dosis, independientemente de la vía de administración, corresponde al tiempo que debe transcurrir para que se agoten los factores de coagulación, cuyas semividas son de 6 horas para el factor VII, 24 horas para el factor IX, 40 horas para el factor X y 60 horas para el factor II, lo cual indica que la administración intravenosa no proporciona un comienzo más rápido de la acción, respecto a la vía peroral [5, 6].

Teniendo en cuenta que en Colombia no se comercializa una forma farmacéutica líquida, sino como tabletas de Warfarina Sódica (5,0 y 2,5 mg), y Warfarina Sódica Caltrato (2,5 mg) [7], la preparación de una forma extemporánea tipo suspensión, elaborada a partir de tabletas, brindaría una excelente alternativa para el control de la dosificación, ya que permitiría la administración de una dosis más exacta y controlada, que la obtenida cuando se fractura una tableta.

En el presente trabajo se desarrolló y validó una metodología para la cuantificación de Warfarina Sódica en una preparación extemporánea, tipo suspensión. Este resultado permitirá contar con una metodología para ser utilizada en los estudios de estabilidad en preparaciones de uso hospitalario con este principio activo.

Propiedades fisicoquímicas de la Warfarina
Nombre químico (IUPAC): (RS)-4-hidroxi-3-(3-oxo-1-fenilbutil)-cumarina, sinónimo: 3-(α-fenil-β-acetiletil)-4-hidroxicumarina, fórmula molecular: C₁₉H₁₆O₄.

Peso molecular: 308,34 g/mol, punto de fusión: 161 °C. Solubilidad: soluble en acetona y dioxano, moderadamente soluble en metanol y etanol, y prácticamente insoluble en benceno y ciclohexano. La solubilidad en HCl 0,1 N es 4,4 mg/L a temperatura ambiente y 7,5 mg/L a 37 °C. La sal sódica es libremente soluble en agua. pKa: 5,05 ± 0,10 a temperatura ambiente [10, 12].

METODOLOGÍA

Equipos
Los análisis se realizaron en un cromatógrafo Agilent Technologies 1200 con detector UV-VIS de arreglo de diodos, utilizando una columna cromatográfica Phenomenex Luna C18 de 250 × 4,6 mm y un tamaño de partícula de 5 µm.

Reactivos
Estándar USP de Warfarina base RS, metanol y acetonitrilo HPLC (Honeywell), ácido acético glacial (Panreac), ácido clorhídrico fumante, pentóxido de fósforo, lactosa y almidón (Merck), peróxido de hidrógeno (Carlo Erba), hidróxido de sodio (EK CHEM), fosfato monobásico de potasio (Mallinckrodt), dextrosa al 5% y cloruro de sodio al 0,9% estériles (Baxter).

Estandarización del sistema cromatográfico
Debido a que no se encuentra reportado un método oficial para la valoración de Warfarina Sódica en suspensión, se desarrolló y validó la metodología para este producto tomando como punto de partida las condiciones cromatográficas sugeridas por la USP 35 [8], para la cuantificación de Warfarina Sódica en tabletas. Para la estandarización y optimización de las condiciones cromatográficas, se modificó el método con el fin de obtener parámetros cromatográficos que representaran la idoneidad del sistema para la cuantificación del activo en suspensión.

Estandarización del método de extracción
El método de extracción se desarrolló teniendo en cuenta los insumos que generalmente se utilizan en la elaboración de preparaciones extemporáneas de uso hospitalario.

La muestra para análisis se obtuvo mediante la trituración de 30 tabletas (previa determinación de la variación de peso). Una porción se suspendió en cloruro de sodio 0,9% o dextrosa al 5% y se agitó vigorosamente hasta obtener una preparación homogénea, luego se completó a volumen con el vehículo y se agitó nuevamente. La extracción del activo se realizó usando mezclas de solución de buffer de fosfato monobásico de potasio pH 7,4 y acetonitrilo.

Selectividad
La selectividad se evaluó respecto a los excipientes y frente a los productos generados por la degradación forzada del activo. Los excipientes se evaluaron uno a uno al doble de la concentración que normalmente se encuentran en la suspensión. Tanto la Warfarina Sódica como los excipientes que forman parte de la matriz se sometieron a degradación forzada por hidrólisis en medio ácido y básico; también se sometieron a oxidación con peróxido de hidrógeno y fotólisis; esta última tanto por exposición a la luz directa del sol como a las longitudes de onda 254 y 366 nm.

Linealidad
La linealidad del sistema y del método se determinó al preparar soluciones de Warfarina Sódica con las siguientes concentraciones: 0,050, 0,075, 0,100, 0,125 y 0,150 mg/mL.

Precisión
La repetibilidad se evaluó tanto para el sistema como para el método realizando cinco determinaciones de la solución de concentración 0,1 mg/mL. La precisión intermedia se evaluó para dos analistas en dos días diferentes.

Exactitud
La evaluación de este parámetro se determinó mediante el porcentaje de recuperación para tres niveles de concentración: 75%, 100% y 125%.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Sistema de idoneidad
La idoneidad del sistema cromatográfico se verificó usando el estándar USP de Warfarina Base RS (previamente secado al vacío por 4 horas sobre pentóxido de fósforo), a una concentración aproximada de 0,1 mg/mL. El factor de capacidad fue 3,42, el número de platos teóricos fue 6903 y el factor de asimetría 0,836. Estos parámetros cumplen con lo establecido por la USP 35; por tal razón, se concluye que el sistema cromatográfico es confiable para realizar la validación de la metodología propuesta.

Estandarización del sistema cromatográfico
Después de realizar diversas modificaciones en las condiciones cromatográficas, se observó que no se obtuvo una mejora significativa con respecto a las condiciones sugeridas por la USP 30 [9]; por tanto, se decidió adoptar estas. Las condiciones fueron las siguientes: longitud de onda 280 nm, columna C18 de 250 × 4,6 mm, tamaño de partícula 5 µm, flujo 1,4 mL/min, volumen de inyección 20 µL y fase móvil metanol: agua: ácido acético glacial (68:32:1).

Estandarización del método de extracción
La muestra se obtuvo mediante la trituración de 30 tabletas (previa determinación de la variación de peso). De allí se tomaron aproximadamente 1.100 mg, se llevaron a un balón aforado de 50 mL, se adicionaron 30 mL del vehículo (cloruro de sodio 0,9% o dextrosa al 5%), se agitó vigorosamente hasta obtener una suspensión homogénea, luego se completó a volumen con el vehículo y se agitó nuevamente. Se transfirió una alícuota de 2 mL a un balón aforado de 10 mL, se adicionaron 5 mL de mezcla diluyente (solución buffer de fosfato monobásico de potasio pH 7,4: acetonitrilo 85:15); sonicando por 10 minutos, se agitó vigorosamente por un minuto y se aforó con solución diluyente. Al seguir este procedimiento y después de la valoración del activo se obtuvo una concentración de aproximadamente 0,1 mg/mL.

Selectividad
El análisis cromatográfico de las muestras evaluadas permite concluir que ni los excipientes de la matriz ni los productos de degradación generan señales que puedan interferir con las señales correspondientes al principio activo [10] (Figura 2 y Figura 3).

El cromatograma correspondiente a la hidrólisis ácida presenta tres señales: aproximadamente a los 7,6 minutos aparece la señal correspondiente a la Warfarina Sódica; cerca de los 3,4 y 4,3 minutos aparecen las señales correspondientes posiblemente a la formación de los hemicetales cíclicos de la 4-hidroxicumarina y 2-hidroxicromona, respectivamente [10].

El cromatograma correspondiente a la hidrólisis básica presenta cuatro señales: aproximadamente a los 7,6 minutos aparece la señal correspondiente a la Warfarina Sódica; cerca de los 3,3 y 3,8 minutos aparecen las señales correspondientes posiblemente a la formación del ácido hidroxicumarínico proveniente de la hidrólisis lactónica y la subsiguiente descarboxilación del mismo. La ciclación aldólica del último forma, posiblemente, el compuesto correspondiente a la señal obtenida a los 9,4 minutos aproximadamente [10].

El cromatograma correspondiente a la oxidación presenta múltiples señales: aproximadamente a los 7,6 minutos aparece la señal correspondiente a la Warfarina Sódica; cerca de 1,7 a 2,2 minutos aparece la señal correspondiente al blanco; aproximadamente de 2,4 a 6,2 y a los 9,3 minutos aparecen las señales correspondientes a los compuestos formados por la hidroxilación y posible formación de quinonas en las posiciones 4, 4', 6, 7 y 8 de la molécula de Warfarina Sódica [10].

El cromatograma correspondiente a los excipientes no muestra señales debidas a ellos; por tal razón, no interfieren con la cuantificación del analito de interés.

Linealidad
La Figura 4 muestra las curvas de calibración para la linealidad del sistema y método, respectivamente. Como se muestra en las Tablas 1 y 2, la prueba t para un nivel de confianza del 95% y n-2 grados de libertad indican que estadísticamente hay proporcionalidad entre la concentración y la respuesta analítica para el rango comprendido entre 0,05 y 0,15 mg/mL. También muestra que la pendiente es estadísticamente diferente a cero y el intercepto no es estadísticamente diferente de dicho valor. Todo lo anterior indica que para el modelo lineal propuesto, los errores sistemáticos no afectan la linealidad ni del sistema ni del método.

Los resultados de las pruebas F y ANOVA (Tablas 3 y 4), indican que no hay dispersión estadísticamente significativa entre los resultados de las réplicas de las distintas concentraciones, corroborando el cumplimiento de la linealidad de la metodología.

Precisión
Los resultados obtenidos muestran coeficientes de variación inferiores al 2% (0,0978 y 0,0725, respectivamente); lo que indica que tanto el sistema como el método son precisos desde el punto de vista de la repetibilidad.

Como se muestra en la Tabla 5, el análisis de varianza, mediante un test F para la precisión intermedia, indica que no se presentan diferencias estadísticamente significativas por realizar el análisis en días diferentes o con analistas diferentes [11].

Exactitud
La Tabla 6 muestra que el porcentaje de recuperación fue superior al 95% e inferior al 105%. Para la prueba t de Student se puede apreciar que el valor calculado es mayor que el tabulado. Se acepta entonces la hipótesis alternativa (H1: t exp > t tab) y se afirma que la probabilidad de obtener un valor t, con ocho grados de libertad, igual o mayor a 3,351 es aproximadamente 0,005, cuando el promedio es 100,53; es decir, no existe diferencia estadísticamente significativa entre los datos y el 100%. La prueba de Cochran muestra que existe homogeneidad entre las varianzas para los diferentes niveles de concentración (Tabla 7), indicando que el nivel de concentración no afecta la variación de los resultados.

CONCLUSIONES

Se desarrolló y validó una metodología analítica por HPLC para la cuantificación de Warfarina Sódica en una suspensión extemporánea. Los resultados de la validación muestran que la metodología propuesta es selectiva, lineal, precisa y exacta; por tanto, es confiable para utilizarla en la cuantificación del activo Warfarina Sódica en una preparación extemporánea tipo suspensión.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos al Laboratorio de Investigaciones en Análisis Instrumental y al Laboratorio de Análisis Farmacéutico del Departamento de Farmacia de la Universidad Nacional de Colombia.

REFERENCIAS

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