2.3.1 Síntesis del ligando dietil 2,2'-(butano-1,4-dilbis((2-hidroxibencil)azanedil))diacetato

La ruta sintética del ligando L se muestra en la figura 2.

Figura 2 Ruta sintética empleada para el ligando L. 

Se realizó una mezcla de 2 mL de salicilaldehído (19.2 mmol) y 960 µL de 1,4-diaminobutano (9.6 mmol) en un erlenmeyer que contenía 2 mL de metanol. La solución resultante se llevó a sonicación por 1 hora a 25 ^°C; después de este tiempo, el sistema fue enfriado a 4 ^°C por 30 minutos y el sólido fue filtrado y lavado, con 100 mL de una mezcla fría 1:1 metanol:agua y con 50 mL de metanol frío. El compuesto fue identificado como N,N'-bis(saliciliden)-1, 4-butanodiamina (SBS) con un punto de fusión de 88 ^°C - 89 ^°C próximo al reportado en la literatura [⁸], con un rendimiento del 90 %.

Posteriormente, 2490 g (8.4 mmol) de SBS fueron sometidos a reducción con borohidruro de sodio 0.673 g (17.8 mmol) en metanol. Se observó efervescencia inmediata al agregarse el borohidruro de sodio a la solución metanólica de SBS; la mezcla se agitó a 35 ^°C por 1 hora, tiempo en el que la solución dejó de efervescer y se tornó incolora. Se agregó agua fría al sistema para promover la precipitación del compuesto reducido SBSR, el sistema fue enfriado a 4 °C por 30 minutos y el sólido fue filtrado y lavado con 100 mL de una mezcla fría 1:1 metanol:agua y con 50 mL de metanol frío. El compuesto fue identificado a través del punto de fusión y los espectros RMN protónico e infrarrojo en comparación con reportes previos [⁸]. Polvo blanco (rendimiento: 70 %). p.f.: 118-119 °C. IR (ATR cm^-1): и 3286 d, 2931 d, 2902 d, 2850 d, 2813 m, 1597 m, 1452 m, 1395 m, 1380 m, 1337 m, 1272 m, 1252 m, 1238 m, 1192 m, 1163 m, 1113 m, 1091 m, 1040 m, 997 m, 975 d, 939 , 866 m, 839 m, 751 f, 721 m. ¹H-RMN (CDCl₃, 400 MHz): 5 (ppm) 1.63 (q, J = 3.3 Hz, 4H, H9), 2.72 (t, J = 6.0Hz, 4H, H8), 4.02 (s, 4H, H6), 6.81 (td, J = 7.4 Hz, 1.2 Hz, 2H, H4), 6.86 (dd, J = 8.2 Hz, 1.1 Hz, 2H, H2), 7.01 (dd, J = 7.4 Hz, 1.6 Hz, 2H, H5), 7.2 (td, J = 7.8 Hz, 1.7 Hz, 2H, H3).

Se dispuso en un balón de dos bocas 1.502 g (5.0 mmol) de SBSR, 10.1 g (73.1 mmol) de carbonato de potasio seco y 50 mL de acetonitrilo seco. El sistema se dejó a reflujo por 1 hora y posteriormente se agregaron 0.830 g (5.0 mmol) de yoduro de potasio seco junto con 1.11 mL (10.4 mmol) de cloroacetato de etilo. El sistema continuó en reflujo por otras 18 horas. Una vez terminado el tiempo de reacción, se filtraron los sólidos inorgánicos insolubles y el solvente fue removido con evaporación a presión reducida. El sólido obtenido del crudo de reacción tuvo un color amarillo pálido y fue recristalizado en metanol. Cristales incoloros (rendimiento: 65 %). C26H36N2O6. p.f.: 250-251 °C. IR (pastilla KBr cm^-1): и 3285 d, 3050 m, 2982 m, 2954 m, 2926 m, 2909 m, 2858 m, 1738 f, 1615 m, 1587 f, 1509 m, 1492 f, 1458 m, 1424 m, 1374 m, 1313 m, 1274 m, 1246 m, 1190 m, 1122 m, 1094 m, 1033 f, 987 f, 948 f, 936 m, 892 m, 869 m, 853 f, 808 d, 774 m, 752 f, 713 m, 662 d, 629 d, 589 d, 500 m, 450 f, 400 m, 320 f, 300 m, 281 f. ¹H-RMN (CDCl₃, 400 MHz): 5 (ppm) 1.27 (t, J = 7.1 Hz, 6H, H9), 1.49 (q ancho, 4H, H11), 2.53 (t ancho, 4H, H10), 3.31 (s, 4H, H6), 3.79 (s, 4H, H7), 4.18 (c, J = 7.1 Hz, 4H, H8), 6.76 (td, J = 7.4 Hz, 0.7 Hz, 2H, H4), 6,83 (d, J = 8.0 Hz, 2H, H2), 6.95 (d, J = 7.1 Hz, 2H, H5), 7.17 (td, J = 7.7 Hz, 0.8 Hz, 2H, H3), 10.02 (s, 2H, H1). ¹³C-RMN (CDCl₃, 100 MHz): 5 14.3 (C9), 24.3 (C11), 53.2 (C10), 54.5 (C6), 58.2 (C7), 61.2 (C8), 116.4 (C2), 119.3 (C4), 121.8 (C13), 129.1 (C3), 129.2 (C5), 157.7 (C12) 170.8 (C14). EM (IE, 70 eV): m/z472 [M+].

2.3.2 Síntesis del ligando 4,4'-((1E,1'E)-hidracin- 1.2- dilidenbis(metanoiliden))bis(bencen-1.3- diol)

El segundo ligando, se sintetizó como fluoróforo F, cuya síntesis se resume en la figura 3.

Figura 3 Síntesis de fluoróforo F. 

0.525 g (3.6 mmol) de 2,4-dihidroxibenzaldehído y 0.20 mL (4.1 mmol) de hidrazina monohidratada se llevaron a reflujo en 20 mL de metanol por 12 horas. Una vez finalizada la reacción, confirmada por cromatografía de placa delgada, se agregaron 50 mL de agua fría para inducir precipitación de la azina del 2,4-dihidroxibenzaldehído (F) de color amarillo; el sólido fue lavado con 20 mL de una mezcla fría 1:1 metanol:agua. El compuesto se identificó a través de espectrometría de masas, en donde se observó el ion molecular a m/z 272 [M+] con fragmentos característicos (ver material suplementario). El rendimiento obtenido fue del 50 %. C14H12N₂O₄. IR (ATR cm^-1): v 3498 d, 3220 d, 1612 f, 1580 m, 1508 m, 1445 m, 1310 m, 1248 m, 1212 m, 1176 m, 1118 m, 985 m, 850 m, 781 m, 745 m, 682 m, 646 m, 568 m. Los resultados de la caracterización son acordes a lo reportado en investigaciones previas [⁹, ¹⁰].

2.5.1 Relajatividad molar

La determinación de las relajatividades molares de los complejos lantánidos se llevó a cabo en un espectrofotómetro Bruker Ultrashield Avance II 400 operando a 400 MHz y con intensidad de campo de 9 T a 300 K. Se usó el medicamento DOTAREM® como agente de contraste de referencia en los estudios. La secuencia empleada para el ensayo es mostrada en la figura 5.

Figura 5 Secuencia "recuperación de saturación" para determinación de tiempos de relajación del agua (71 ) y ecuación de ajuste para cálculo de A3 = 1 /T1 [¹¹]. 

Se realizó el cálculo de 71 para cada concentración presentada en la tabla 1, variando el parámetro (d7) tiempo de adquisición en 0 s, 0.25 s, 0.50 s, 1 s, 1.5 s, 2.0 s, 4.0 s, 6.0 s y 8.0 s.

Tabla 1 Concentraciones empleadas para la determinación de relajatividades molares. 

Las disoluciones fueron preparadas en 400 µL agua tipo I con 50 µL de agua deuterada (D₂O). Posteriormente se realizó la gráfica de 1/T1 vs concentración de compuesto para determinar la relajatividad molar como la pendiente de la regresión lineal de los datos.

2.5.2 Rendimiento cuántico

Se determinaron los rendimientos cuánticos de los cuatro complejos lantánidos y el fluoróforo F. Se usó el espectrofluorímetro JASCO FP-8500 para la adquisición de los espectros de emisión y el espectrofotómetro UV-visible Evolution 220 Thermo Scientific para la toma de los espectros de absorción. Para cada compuesto se tomaron espectros de absorción de siete disoluciones de concentración variable de tal manera que las absorbancias variaron entre 0 y 0.1 unidades, evitando el fenómeno de autoabsorción al momento de adquisición de los espectros de emisión. Los resultados de rendimiento cuántico se expresan como relación de pendientes de las gráficas de emisión integrada vs absorbancia de los compuestos sobre el patrón, a su vez multiplicado por el rendimiento cuántico del mismo, como indica la ecuación 1 [¹²].

El patrón usado para estos experimentos fue fluoresceína en hidróxido de sodio 0.1 mol.L^-1, cuyo rendimiento cuántico es 0.79 [⁸] y se empleó una longitud de onda de excitación de 370 nm.

2.5.3 Estabilidad termodinámica preliminar

La estabilidad termodinámica preliminar de los complejos se determinó a partir de la constante de equilibrio aparente de disoluciones 0.5 mol.L^-1 de los complejos lantánidos y el medicamento de referencia, tras su incubación por 72 horas a 37 ^°C. Para ello se empleó la cuantificación de lantánidos libres por método colorimétrico usando naranja de xilenol. Se prepararon curvas de calibración para cada metal desde 1.0 µmol.L^-1 hasta 5.0 µmol.L^-1 usando el respectivo tricloruro de lantánido como patrón. Las muestras y curvas para lectura en el espectrofotómetro UV-visible Evolution 220 Thermo Scientific se prepararon en buffer de hexametilentetramina 50 mmol.L^-1 ajustado a pH 7.0, el cual se empleó como solvente para preparar una solución de naranja de Xilenol 1.2 %. Las lecturas fueron tomadas por triplicado. Las constantes de equilibrio aparente (k _ap ) fueron calculadas a través de la ecuación 2.

En donde k _ap es la constante de equilibrio aparente; [Ln³+] es la concentración de lantánido libre y [LnLF] _i es la concentración de complejo inicial.

2.7.1 Ensayos de absorción electrónica (UV-Vis)

Los espectros de absorción fueron medidos en el espectrofotómetro UV-visible Evolution 220 Thermo Scientific con accesorio Peltier para control de temperatura. Las titulaciones fotométricas se realizaron a una temperatura de 20 ^°C, a una concentración constante del compuesto y con adición de ADN cubriendo un rango desde 5 µmol.L^-1 a 38 µmol.L^-1. Las concentraciones del compuesto empleado para cada ensayo fueron L (42 pmol.L^-1), F (37 µmol.L^-1), 1 (25 pmol.L^-1), 2 (24 pmol.L^-1), 3 (23 µmol.L^-1) y 4 (20 µmol.L^-1). Tras la adición de cada alícuota de ADN, se tomó el respectivo espectro electrónico del compuesto estudiado en un rango de longitudes de onda de 230-550 nm con previa corrección de blanco. Para el cálculo de las constantes de unión, se ajustaron los datos obtenidos a la ecuación de Wolfe-Shimmer descrita en la ecuación 3.

En dónde [ADN] es la concentración de ADN agregado, ε a es el coeficiente de extinción molar aparente, εb es el coeficiente de extinción molar totalmente unido y εf es el coeficiente de extinción molar del compuesto libre.

2.7.2 Mediciones de viscosidad

La viscosidad de seis soluciones de ADN a concentración de 600 µmol.L^-1, con concentraciones incrementales de compuesto, fueron medidas con el uso de un semi-micro viscosímetro Cannon-Ubbelohde 75. Se evaluaron relaciones [ADN]/[Compuesto] de 0, 0.2, 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0, manteniendo control de temperatura a 25 °C en un baño termostatizado. Los tiempos de flujo fueron medidos con un cronómetro.

3.1.1 Espectroscopia de infrarrojo

La síntesis de los ligandos fue seguida a través de espectroscopia IR junto con la medición de algunos parámetros físicos para la confirmación de la estructura propuesta. Para el caso de L, se vigiló el avance de las reacciones teniendo en cuenta la presencia y ausencia de bandas características modificadas durante el esquema de síntesis. Las figura 6a y figura 6b muestran el seguimiento de las bandas características de cada compuesto intermedio para cada paso descrito en la figura 2.

Figura 6 Seguimiento de esquema sintético de L por espectroscopia IR. 

El ensanchamiento de la banda de tensión absorción de los grupos O-H aromáticos a 3300 cm^-1, que ocurre al pasar del compuesto SBSR a L y que está ausente en LNa (compuesto hidrolizado por base) es la principal observación. Esta banda también se encuentra ausente en los espectros infrarrojos de todos los complejos, evidenciándose la tensión del grupo O-H del fluoróforo F. La desaparición de las dos bandas de tensión simétrica y asimétrica del enlace C-O-C característica de L en los demás espectros indica la efectiva hidrólisis del éster, además del desplazamiento de la banda de tensión del grupo carbonilo C=O hacia menor energía por disminución de efecto de resonancia ante la ausencia del grupo etilo. La comparación de los desplazamientos de las bandas características entre ligandos y el complejo se resumen en la tabla 2.

Tabla 2 Bandas características de compuestos obtenidos. 

El posible modo de unión de los grupos carboxilo del ligando L hidrolizado hacia los centros metálicos, puede proponerse al analizar la diferencia de las frecuencias de tensión simétrica y asimétrica del enlace O-C-O. En la tabla 3 se resumen las frecuencias a evaluar junto con las diferencias entre ellas.

Tabla 3 Diferencias entre bandas de tensión simétrica y asimétrica del enlace O-C-O. 

*Av = v O-C-Oasim - v O-C-Osim

Para el caso de los complejos lantánidos, se observó que la diferencias en frecuencias son mayores a 200 cm^-1, sugiriendo una posible coordinación monodentada por parte los grupos carboxilatos del ligando L hidrolizado [¹⁴, ¹⁵].

De la tabla 2 se puede apreciar que, para las frecuencias de vibración de tensión de los grupos OH, se conserva únicamente la frecuencia de vibración correspondiente al fluoróforo F (v O-H(₂)) en los complejos lantánidos, además de observarse un desplazamiento de aproximadamente 20 cm^-1 en la banda de tensión del O-H adyacente al carbono ipso (v O-H(₁)) que denota la posible coordinación a través de uno los O-H de los anillos bencénicos. En adición, no se observa desplazamiento significativo en las energías del enlace imino del fluoróforo F, indicando, probablemente, que el grupo azometino de la molécula no está participando en la coordinación [¹⁶].

3.1.2 Espectroscopia de resonancia magnética nuclear

El ligando L mostró las señales esperadas para la estructura propuesta, se diferencia de su posible contraparte sustituida en la posición 1 por el desplazamiento químico, que en este caso es de 10.02 ppm, característica de un protón en el grupo O-H aromático. En campo alto se observaron las señales de los protones alifáticos, correspondientes a los hidrógenos H9, H11, H10, H6, H7 y H8; los hidrógenos H9 y H8 se observaron como triplete que integra para seis hidrógenos y cuartete que integra para cuatro hidrógenos, respectivamente; los cuales se acoplan con constante J = 7.1 Hz; H6, H7 se observan como singletes que integran para cuatro hidrógenos, denotando la ausencia de protones adyacentes no equivalentes; H10 y H11 se encuentran como dos señales anchas sin resolución de acople, aunque se alcanza a observar que H11 pretende ser un quintete y H10 un triplete (ver material suplementario). En campo bajo se lograron observar las señales correspondientes a los hidrógenos aromáticos y aquellos enlazados a heteroátomos; los dobletes H2 y H5 que integran para dos protones se diferencian en que H2 se encuentra más protegido por efecto de resonancia del grupo OH bencénico, lo que hace que su desplazamiento químico sea a campo más alto respecto a H5; los tripletes H3 y H4 que integran para dos protones cada uno, se logran diferenciar por el mismo efecto de resonancia, haciendo que la posición para respecto al grupo OH (protones H4) se proteja más y la señal se ubique a un desplazamiento químico de mayor campo. Finalmente, para la región aromática sólo se observó acople meta entre los protones H3 y H5 y entre H2 y H4, con magnitudes de J = 0. 8 Hz y 0.7 Hz, respectivamente. El espectro RMN ¹H de L con señales asignadas se muestra en

Figura 7 Espectro RMN ¹H del ligando L. 

Para los complejos lantánidos, se observó la ausencia de las señales H9 y H8, indicando la hidrólisis efectiva del ligando L, además se encuentran las señales aromáticas del fluoróforo F y de algunos hidrógenos de heteroátomos, confirmando el anclaje de F al centro metálico. En adición, las señales se encuentran ensanchadas y modificadas en magnitud por el efecto paramagnético de los centros metálicos [¹⁷]; se presentaron también en general, desplazamientos hacia campo bajo, de las señales aromáticas correspondientes al ligando L hidrolizado y OH del fluoróforo F, indicando la posible coordinación a través de los grupos carboxilato e hidroxilo. La desaparición de la señal del protón H-3' del ligando F en todos los complejos indica la probable naturaleza intercambiable del protón en el grupo -OH coordinante, que en este caso podría ser el -OH en posición orto. En la información suplementaria se muestra el espectro ¹H-RMN del ligando F.

De manera representativa, en la figura 8, se muestra el espectro ¹H-RMN del complejo 4 con la asignación de señales, se realiza de manera similar para los complejos 1, 2 y 3 (ver material suplementario). Un aspecto particular de los espectros de los complejos, es el efecto del paramagnetismo del núcleo metálico en las señales de los ligandos. Se observa una disminución de las señales en los complejos más paramagnéticos (1 y 2) y un menor efecto en los complejos menos paramagnéticos 3 y 4.

Figura 8 Espectro RMN 1H del compuesto 4. 

3.2.1 Espectrometría de masas

Para los ligandos L y F se adquirieron espectros de masas que corroboraron la estructura propuesta.

En la figura 9 se muestran los fragmentos característicos de L; se observó un fragmento característico, además del ion molecular a m/z = 472, que distingue la sustitución en NH en lugar del OH en el paso de SBSR mostrado en la figura 2, es el fragmento a m/z = 365, que indica la ruptura del enlace N-C6, además de la generación del fragmento m/z = 107 de alta intensidad que corresponde al fragmento fenólico sin sustitución.

Figura 9 Espectro de masas de L. 

En el caso del ligando F (ver material suplementario), el espectro de masas también presenta fragmentos característicos de compuesto, además del ion molecular con alta intensidad en m/z 272. Los iones de mayor intensidad corresponden a los fragmentos generados por la pérdida de un OH (m/z = 255), ruptura del enlace entre carbono ipso y C4' (m/z = 109), ruptura de enlace imino (m/z = 122) y ruptura simétrica del enlace N-N (m/z = 136, 137 y 138).

Los puntos de fusión encontrados para todos los compuestos fueron altos, para el caso de los complejos lantánidos, todos superaron los 300 °C; los análisis de conductividad molar muestran que podrían presentarse como compuestos iónicos, ya que los valores de conductividad superan los 50 Ω ^{- 1} .cm².mol^-1, siendo similares a aquellos obtenidos para el yoduro de potasio en DMSO en condiciones similares [¹⁸, ¹⁹]. Es probable que los protones de los grupos hidroxilo coordinantes en las estructuras propuestas sean protones ácidos, pues al disolverse en agua logran bajar el pH del sistema hasta 6, y en medio básico también logran mantener su solubilidad, esto explica las altas conductividades encontradas para estos complejos, además de la ausencia de estos protones en los espectros de ¹H RMN, que se piensa es debida a intercambio con solvente deuterado.

Los complejos de coordinación fueron parcialmente solubles en agua, y aumentaron su solubilidad en medios ácidos y básicos. En contraste, los ligandos L y F no fueron solubles en agua, pero sí en disolventes orgánicos como diclorometano, cloroformo, acetonitrilo y metanol. La solubilidad del ligando L aumenta en agua ligeramente acidulada (pH 5-6), gracias -posiblemente- a los nitrógenos aceptores de protones que le logran conferir carga neta a la molécula.

El porcentaje de lantánido en cada complejo fue determinado a través de la digestión ácida, y la posterior cuantificación colorimétrica de lantánidos libres, de acuerdo con la metodología seguida por Barge et al. [⁷]. Los porcentajes encontrados concuerdan con los valores teóricos para las posibles estructuras propuestas.

3.2.2 Análisis termogravimétricos

La figura 10 muestra el termograma del compuesto 4 como representativo de los cuatro complejos obtenidos.

Figura 10 Termograma del compuesto 4 en atmósfera de nitrógeno. 

Se logró observar una pérdida de masa inicial en dos etapas, la primera a 50 °C (11 %) y la segunda a 95 °C (5 %), probablemente atribuidas al metanol y la humedad residual después de los pasos de recristalización y lavados. No se observan pérdidas entre 100 ° C y 120 ° C características de aguas de esfera de coordinación interna. Posteriormente se observa una pérdida hasta el 61 % de la masa inicial cuando se alcanzan los 312 °C, atribuida a una probable descomposición de los ligandos orgánicos, dejando como intermediario el carbonato de iterbio(III) (Yb₂(CO₃)₂), finalmente se pierde otro porcentaje de masa hasta alcanzar el 47 % de la masa inicial, debida a la pérdida de monóxido de carbono (CO) producto de la descomposición del carbonato de iterbio, dejando finalmente el óxido de iterbio(III) (Yb₂O₃) como producto final de la descomposición térmica. Se tienen reportes de esta misma tendencia de descomposición para los complejos lantánidos unidos a ligandos con grupos carboxilatos y oxigenados, en donde los pasos finales se relacionan con la formación del respectivo carbonato de lantánido y su posterior paso a óxido [¹⁴].

Se obtuvieron termogramas similares para los complejos 1, 2 y 3, con la diferencia de no hacerse distinguible la última temperatura del paso desde carbonato de lantánido a óxido (ver material suplementario). Los termogramas mostraron coincidencias entre los porcentajes esperados de las especies intermediarias en la descomposición térmica y los obtenidos experimentalmente, teniendo en cuenta las masas molares de las estructuras moleculares propuestas.

3.3.1 Relajatividad molar

El funcionamiento de los agentes de contraste en resonancia magnética nuclear de imágenes, se basa en la modificación de los tiempos de relajación de los espines nucleares de los átomos de hidrógeno en el agua, de tal manera que, si los compuestos logran modificar en un mayor grado los tiempos T ₁ o T₂, se considerarán mejores agentes de contraste [⁶, ²⁰ - ²²].

Se determinaron las relajatividades molares en T1 (r1) de los cuatro complejos obtenidos y del compuesto de referencia Dotarem®, el cuál es usado comercialmente como medicamento para contraste en resonancia nuclear de imágenes (RMI). Además, se evaluó el efecto del ligando L en el tiempo de relajación del agua a través de r1 con un fin comparativo. Con el uso de la secuencia "Recuperación de saturación" se obtienen las curvas de intensidad de señal vs tiempo d7 de las cuales se obtiene el parámetro T1 para cada concentración (ver figura 11).

Figura 11 Recuperación de saturación en señales del agua y ajustes matemáticos para determinación de T1 del agua tipo I. 

La figura 12 muestra el resumen de las seis rectas experimentales generadas a partir de la relación 1/T₁ vs concentración. Los tiempos T₁ obtenidos para cada compuesto se muestran en el material suplementario. En este experimento se obtuvo un T1 del agua tipo 1 de 3.10 s, que coincide con algunos valores reportados en la literatura [²³, ²⁴].

Figura 12 Curvas de relajatividad molar (r₁) para compuestos evaluados en agua tipo I, 9 T y 300 K a). Dotarem^® ; b). L; c). 1;d). 2;e). 3 y f). 4. 

En la tabla 4 se resumen los resultados de r₁ y en la figura 32 se observa una gráfica comparativa de las rectas para los seis compuestos.

Tabla 4 Relajatividades molares obtenidas. 

Se observó un aumento significativo en el parámetro r1 para el compuesto 1 inclusive por encima del compuesto de referencia Dotarem®. El efecto es concordante con el menor número de coordinación del metal respecto al compuesto de referencia, en este caso 7 para el compuesto 1 y 8 para Dotarem^®, que permite que se tengan más aguas de coordinación en el complejo en solución y así el efecto paramagnético sobre los espines nucleares sea mayor [⁶, ²⁰ - ²², ²⁵]. Además, el tiempo de intercambio de aguas t_m puede ser mayor debido a la mayor accesibilidad que tienen las moléculas de agua en un ligando lineal [²⁶]. Por otro lado, el tiempo de correlación t_r no debería aumentar, pues no hay presencia de macromoléculas que vuelva más lento el tambaleo de la magnetización sectorial que provoca el centro metálico paramagnético, por lo que se puede afirmar, que la principal causa del mejoramiento de r1 posiblemente sea el menor número de coordinación y la mayor tasa de intercambio de aguas entre esferas internas de coordinación y el seno del sistema (t_m) [⁶, ²⁶].

Figura 13 Comparación de rectas r ₁ para los compuestos evaluados. 

Los valores de r1 para los compuestos 2, 3, 4 y L estuvieron por debajo del compuesto de referencia Dotarem^® y de 1 debido a su menor paramagnetismo. El paramagnetismo de los metales lantánidos dependerá en gran medida de su estado de oxidación y de cómo se desdoblan los orbitales f en el arreglo geométrico de los orbitales moleculares [⁶]. A pesar que el ión Eu(III) posee una configuración electrónica [Xe]4f⁶ en su forma de ion libre, en donde 6 electrones en los orbitales 4 f estarían desapareados, para el caso de 2, se podría tener un arreglo de orbitales en donde no todos los 6 electrones están desapareados, y así se reduzca en gran medida el paramagnetismo del ion, desembocando en un efecto poco importante sobre la modificación de los tiempos de relajación del agua [⁶, ²⁵].

Los compuestos 3 y 4 tampoco presentan un significativo r₁ en contraste con el compuesto de referencia Dotarem^®, en este caso, por su reducido paramagnetismo al poseer mayor cantidad de electrones en sus orbitales f. Aun así, el compuesto 3 logró tener mayor efecto en r1 que el complejo 2. El ligando L mostró un efecto casi nulo sobre r₁, confirmando su naturaleza diamagnética.

Las relajatividades molares, en este caso r1, son sensibles a la temperatura, viscosidad, intensidad del campo, entre otras, por lo que la comparación de datos con la literatura se debe hacer de manera cuidadosa[⁶], [²³ - ²⁵]. Por este motivo, las comparaciones se realizan con el compuesto de referencia Dotarem^® bajo las mismas condiciones de viscosidad, temperatura, intensidad del campo. En todos los complejos se observó una aceleración de los tiempos de relajación del agua, lo que indica que pueden ser potencialmente usados como contrastes en resonancia magnética nuclear de imágenes (RMI), especialmente el compuesto 1.

3.3.2 Rendimiento cuántico de fluorescencia

La figura 14 muestra los espectros de emisión y absorción de la fluoresceína y el compuesto 4, los demás espectros se pueden encontrar en el material suplementario.

Figura 14 Espectros de absorción y emisión para determinación de rendimiento cuántico en NaOH 0.1 M. a). Absorción de Fluoresceína; b). Emisión de Fluoresceína; c). Absorción de 4 y d). Emisión de 4. 

Se mantuvo una absorbancia < 0.1 en todas las disoluciones usadas para la determinación del rendimiento cuántico, con el fin de evitar fenómenos de autoabsorción; se realizó la determinación de las pendientes de las curvas "absorbancia vs intensidad integrada" para todos los compuestos evaluados. La figura 15 muestra las rectas generadas. El rendimiento cuántico de la fluoresceína es de 0.79 bajo las condiciones en que se realizaron los ensayos [¹², ²⁷], todos los experimentos se realizaron en el mismo disolvente, por lo que la razón de los coeficientes de refracción (n) de la ecuación 1 se considera 1. La tabla 5 muestra los valores de rendimiento cuántico respecto a la fluoresceína obtenidos para los compuestos evaluados.

Figura 15 Curvas de intensidad de fluorescencia integrada vs absorbancia: a). Fluoresceina; b). F; c). 1; d). 2; e). 3 y f). 4. 

Tabla 5 Rendimientos cuánticos obtenidos, patrón de fluoresceína. 

Todos los rendimientos cuánticos obtenidos están por debajo del 0.5 %, indicando que el proceso de emisión de fotones absorbidos es ineficiente en comparación con la fluoresceína. Se observa que el fluoróforo F al acoplarse con los centros metálicos disminuye su capacidad de emitir fotones, es decir se genera un leve quenching de la radiación, probablemente por la aparente coordinación directa al centro metálico a través del grupo OH, que podría inhibir los procesos de transferencia de energía [²⁶, ⁹, ¹⁰], Sin embargo, los rendimientos cuánticos obtenidos se encuentran dentro del rango de algunos agentes de contraste usados para microscopía de fluorescencia [⁶, ²⁸]. La figura 16 muestra la comparación de los gradientes (pendientes de regresión lineal) del fluoróforo F y los complejos lantánidos.

Figura 16 Comparación de gradientes (intensidad/absorbancia) obtenidos para compuestos evaluados. 

Se observa que el quenching es mayor para los complejos con centros lantánidos más pesados (Dy e Yb) en comparación con los más livianos (Gd y Eu). Es posible que el menor tamaño de los iones más pesados, que se traduce en una mayor carga nuclear efectiva, altera de manera más significativa las energías de los estados singlete y triplete, generando una diferencia de energía mayor y ocasionando que el entrecruzamiento de sistemas y la óptima transferencia de energía para la emisión radiativa, se vea disminuida [⁶]. Además, en contraste con los resultados de relajatividad molar, es probable que las aguas de coordinación presentes en solución y/o algunos iones OH provoquen el quenching en todos los complejos [⁶]. La proximidad o la unión directa de la antena F para la recolección de energía, no logra verse reflejada de manera totalmente beneficiosa en la región del espectro visible, sin embargo, para la región del infrarrojo e infrarrojo cercano, se tiene evidencia que los iones lantánidos como el Eu(III) poseen excelentes rendimientos, de tal manera que podría evaluarse la emisión en esta región del espectro [⁶, ²⁹, ³⁰].

3.3.3 Estabilidad termodinámica preliminar

Se pretendió emular las condiciones fisiológicas en pH 7.0 y temneratura 37 °C durante un neriodo de 72 horas (144 veces más, que la vida media del medicamento Dotarem® en el cuerpo y 7 veces más, que la vida media del Magnevist®) [³¹ - ³³] para cuantificar posteriormente la cantidad de iones lantánidos libres y estimar la constante de estabilidad termodinámica de manera preliminar a través de la ecuación 2. La figura 17 muestra la curva de calibración empleada para la cuantificación de gadolinio libre, de manera análoga se obtuvieron curvas de calibración para los demás metales (ver material suplementario).

Figura 17 Cuantificación espectrofotométrica de lantánidos libres a). Espectros UV-Vis y b). Curva de calibración del Gd³⁺ libre. 

La tabla 6 muestra los valores de - log [k _ap ] encontrados después de la incubación y determinación por el método espectrofotométrico.

Tabla 6 Constantes k _ap de los compuestos evaluados. 

En este caso, la constante de estabilidad se asume como el inverso de la constante de disociación de los complejos (kap). Todos los complejos tuvieron estabilidades menores a las del compuesto de referencia Dotarem^®, entre 5 y 6 órdenes de magnitud por debajo, lo cual reafirma la mayor estabilidad termodinámica que confiere los ligandos macrocíclicos sobre los polidentados lineales, sin embargo, se obtuvieron constantes altas en referencia a constantes halladas por técnicas similares para otros ligandos polidentados y agentes de contraste [⁵, ⁶] entre los complejos; se observa una tendencia de incrementar la estabilidad en cuanto se disminuye el tamaño del centro metálico en 1 o 2 órdenes de magnitud, probablemente por el aumento de la dureza del ion que lo convierte en una especie más oxófila [⁵, ³⁴].

Las altas estabilidades encontradas a los tiempos de incubación trabajados señalan a los compuestos obtenidos como posibles candidatos viables para contraste tanto en resonancia como en microscopía de fluorescencia, ya que en general los metales lantánidos y sus complejos no son retenidos en el cuerpo por más 24 horas [³³]. Además, la alta relajatividad molar y relativa alta estabilidad del compuesto 1 puede desembocar en su uso a menores dosis para generar el mismo efecto en el mejoramiento de imágenes T1 [⁶], [³⁵, ³⁶].

3.5.1 Ensayos de absorción electrónica

En primer lugar, se realizaron las titulaciones espectrofotométricas con ADN de los ligandos empleados (L y F) para la formación de los complejos (figura 18).

Figura 18 Efecto de la adición de ADN de timo de ternera sobre el espectro electrónico de a). L y b). F. 

En el espectro electrónico de L (figura 18a), no se observa un efecto neto sobre la banda de absorción cerca de los 280 nm, mientras que el espectro electrónico del fluoróforo F (figura 18b) se evidencia un efecto hipocrómico en su banda de absorción cerca de los 360 nm, indicando una posible interacción por intercalación entre F y las pares de bases del ADN [¹⁴, ¹⁹, ³⁷]. La explicación puede residir en que el fluoróforo F posee una estructura conjugada más extensa y por ende una mayor planaridad, lo que lo hace poseer un sistema n extenso que logra estabilizar las bases nitrogenadas por interacción de apilamiento n [¹⁹], propiedad que no posee el ligando L. La figura 19 muestra el efecto de la interacción de los complejos lantánidos con el ADN.

Figura 19 Efecto de la adicion de ADN de timo de ternera sobre el espectro electronico de a). 1; b). 2; c). 3 y d). 4. 

En los espectros electrónicos de los complejos 1, 2 y 4, se observaron cambios hipocrómicos en la banda de absorción cerca de 360 nm e hipercrómicos en la banda cerca de los 280 nm, a medida que aumenta la presencia del ADN en el sistema; lo cual indica una posible interacción entre los complejos metálicos y las hebras del ADN. Además, se observan también puntos isosbésticos durante la titulación que indican la formación de una tercera especie, posiblemente la especie ADN-Complejo [¹⁴,³⁷]. Se identifica de manera general, que las bandas características de los complejos se comportan de manera distinta; por ejemplo, la banda a 360 nm que presenta hipocromismo, y que principalmente pertenece al fluoróforo F, puede estar indicando que su coordinación al centro metálico de los complejos favorece su intercalación con el ADN, a través de ese fragmento de la molécula; el efecto hipercrómico en la banda a 280 nm, principalmente asociada al ligando hidrolizado L, indica que también se ve afectada la absorción al ocurrir el proceso de intercalación, efecto que no se observa en el ligando L libre. De esta manera, la interacción con las hebras del ADN de los complejos lantánidos puede estarse dando posiblemente por un mecanismo de inserción, que implica tanto la intercalación entre las bases nitrogenadas del ADN, como la unión a los surcos del esqueleto de fosfatos [¹⁹]. Por otro lado, el efecto neto sobre el espectro electrónico del 3 fue el leve hipocromismo en ambas bandas de absorción, lo que sugiere también una posible interacción con las hebras del ADN, sin involucrar precisamente el proceso de intercalación [³⁷].

Con los datos de absorbancia de la banda a 360 nm de la figura 19 y las concentraciones de ADN empleadas, se ajustaron los datos a la ecuación 3 y se usaron los valores de pendiente e intercepto para el cálculo de las constantes de unión. La tabla 8 presenta los valores de las constantes de unión encontradas para los compuestos evaluados.

Los valores encontrados para las constantes de unión son menores a las reportadas para intercaladores clásicos como el bromuro de etidio, entre otros, las cuales se encuentran en el rango de 10⁵-10⁶ L-mol^-1 [⁹, ³⁷]. La constante de unión estimada para el complejo 3 es dos órdenes de magnitud más baja que el resto de complejos. En general, estas constantes de unión dan cuenta de la posible toxicidad a nivel genómico que tienen los complejos lantánidos [¹⁹], el hecho que los valores kb sean menores que aquellos para intercaladores clásicos como el bromuro de etidio, que se consideran altamente tóxicos y mutagénicos, puede dar indicios de una toxicidad reducida, al menos, al nivel de los procesos de replicación y transcripción de ácidos nucleicos. La toxicidad que pudieran presentar éstos complejos lantánidos a través de otros mecanismos fisiológicos, debe ser evaluada por medio de otros ensayos y experimentos de citotoxicidad in-vitro e in-vivo.

Tabla 8 Constantes de unión k _b encontradas. 

3.5.2 Mediciones de viscosidad

Los cambios en la viscosidad de una solución de ADN dan cuenta de la forma en que puede interaccionar las moléculas con las hebras de los ácidos nucleicos [¹⁴], [¹⁹], [³⁷]. La figura 21 muestra los resultados del efecto de los compuestos sobre la viscosidad relativa de una solución de ADN 600 mmol-L^-1.

Las viscosidades relativas del ADN en general incrementaron a medida que se aumentó la relación [Compuesto]/[ADN], con excepción del ligando L. Esto indica nuevamente que, posiblemente, la forma de unión con las hebras del ADN sea a través del mecanismo intercalativo, ya que la inserción de las moléculas entre las bases nitrogenadas del ADN aumenta la longitud del biopolímero, teniendo como efecto un aumento de la viscosidad del mismo a nivel macroscópico [¹⁴, ¹⁹]. También hay congruencia en que el ligando L no tiene la capacidad de unirse al ADN, pues se observó que la viscosidad relativa se mantuvo casi constante en todo el rango de ratios evaluados, confirmando lo observado en los ensayos de seguimiento del espectro electrónico.

Figura 20 Ajustes de Wolfe-Shimmer para determinación de constantes de unión K _b de los compuestos a). F; b). 1; c). 2; d). 3 y e). 4. 

Figura 21 Efecto en la viscosidad relativa del ADN en presencia de los compuestos a). L y F; b). 1, 2, 3 y 4. 

De esta manera, los compuestos obtenidos mostraron una posible capacidad de unirse a las hebras del ADN, de tal manera que éstos podrían intervenir, de manera reducida, en los procesos bioquímicos que involucran a los ácidos nucleicos, como los procesos de replicación y transcripción. Esto se podría correlacionar con la posible baja citotoxicidad que pudieran presentar los complejos lantánidos de manera in-vitro, además de poder explicar la reducida actividad biocida contra células procariotas y su potencial aplicación para contraste óptico y contraste para RMI intravenoso.