Previamente a la exposición de los seres humanos a sustancias químicas, éstas deben ser valoradas para determinar su seguridad, por medio de pruebas que tradicionalmente se han desarrollado en animales (1). Dentro de estas pruebas es común evaluar la irritación ocular con el test de Draize, el cual ha suscitado una gran controversia ética ya que se realiza en conejos albinos conscientes (2). En la actualidad son importantes los esfuerzos orientados a implementar alternativas en este tipo de evaluaciones, máxime si se tiene en cuenta que las regulaciones de algunos países, particularmente los europeos, establecen prohibiciones al empleo de animales para valorar la seguridad de cosméticos, productos en los que se demanda la evaluación de la irritación ocular (3).

Dentro de los compuestos a los cuales se les debe valorar su capacidad irritante están los tensoactivos, importantes ingredientes de un gran número de productos farmacéuticos y cosméticos que, dada su naturaleza química, poseen alta afinidad por las membranas celulares, cuya estructura alteran, ocasionando efectos adversos en la piel y las mucosas (4). Una alternativa ampliamente aceptada al test de Draize, que evalúa la irritación ocular de tensoactivos, es el ensayo en glóbulos rojos (RBC, por sus siglas en inglés), en el que se determina la hemólisis en presencia de surfactantes y la capacidad de estas sustancias para producir desnaturalización proteica (5). Estas manifestaciones se relacionan con reacciones celulares propias de la irritación, que pueden conducir a respuestas inflamatorias y cambios en la conformación de cadenas polipeptídicas; tales eventos ocurren, por ejemplo, en la opacidad corneal después del contacto con productos químicos (6, 7).

El ensayo RBC, desarrollado a través de espectrofotometría, usa la hemoglobina (Hb) liberada en la hemólisis como indicador para determinar cuantitativamente la concentración a la cual el tensoactivo destruye la membrana celular en el 50% de los glóbulos rojos (concentración hemolítica media – CH₅₀). El ensayo también considera la desnaturalización de Hb libre (índice de desnaturalización -ID), que ocasionan las altas concentraciones de tensoactivo. La relación CH₅₀/ID puede determinarse para cada agente, relacionando su capacidad para lesionar la membrana celular, y de esta manera se logra una clasificación de su potencial irritante (6). De esta forma, el ensayo es una alternativa al test de irritación ocular de Draize para los efectos agudos de las formulaciones e ingredientes con base en surfactantes (5).

El RBC es un ensayo económico que no requiere equipos especiales y constituye una metodología rápida para evaluar la irritación ocular de tensoactivos (7). Además y, aunque no como alternativa oficial, hace parte de las recomendaciones del Banco de Datos de Técnicas in vitro en Toxicología (INVITTOX, por sus siglas en inglés) y se considera una técnica de amplia aceptación (5, 8). Sin embargo, para considerar fidedignos los resultados que arroja este tipo de pruebas, es necesario estandarizar y validar la metodología, proceso en el que se establece la fiabilidad (reproducibilidad de un método en un laboratorio y entre laboratorios), y la relevancia (capacidad de predicción y correlación respecto a resultados in vivo, aplicabilidad y limitaciones) de una metodología para un propósito en particular (9). La validación de una metodología alternativa difiere en varios aspectos de la de una metodología analítica de cuantificación convencional, pero mantiene de forma estricta muchos parámetros, como la precisión, la linealidad, límites de cuantificación, precisión intermedia y repetibilidad (8, 10, 11).

El presente trabajo describe la validación intralaboratorio del RBC, evaluando los parámetros de linealidad, repetibilidad y precisión intermedia y empleando como tensoactivo prototipo y patrón de relación el dodecilsulfato de sodio (SDS).

MATERIALES Y MÉTODOS

Ensayo en glóbulos rojos

Todos los análisis se realizaron en un espectro-fotómetro UV/VIS, ATI Unicam^®, con un rango de absorbancia entre 0,000 y 2,000, ancho de banda de 2 nm, integración de 1s y celdas de 1 cm de espesor. El procedimiento para el RBC se siguió, salvo algunas modificaciones, de acuerdo con la metodología propuesta por Pape et al., 1990 (6), que se describe a continuación:

Preparación de los glóbulos rojos y ajuste de oxihemoglobina

Se colectó sangre de terneros sanos no medicados (6 meses de edad), en viales de polietileno con buffer citrato como anticoagulante; posteriormente, por centrifugación a 1500 g por 15 minutos, se aislaron los glóbulos rojos (GR) y se lavaron tres veces con PBS (buffer salino de fosfato). Esta suspensión se almacenó a 8ºC, máximo por una semana. Previamente a los ensayos de hemólisis y desnaturalización, se ajustó espectrofotométricamente la concentración de oxihemoglobina (HbO₂) a un valor de 0,122 ± 0,003 mmol/L, para lo cual se tuvo en cuenta el coeficiente de extinción molar (1,59x104 M^-1*cm^-1 a 576 nm) (12).

Hemólisis

Para el ensayo de hemólisis se incubó la suspensión de GR con diferentes concentraciones de SDS (5, 10, 20, 40, 80, 100, 200, 400, 600 y 1000 ppm) en proporción 1:1, por 10 minutos, a temperatura ambiente, en constante agitación. Para detener la incubación se centrifugó por un minuto a 10000 rpm en microcentrífuga para tubos Eppendorf (centrífuga 5702 Eppendorf) y se monitoreó la concentración de HbO₂ en el sobrenadante a 577 nm, definiendo previamente el espectro de absorción molecular entre 500 y 650 nm. Se determinó la CH₅₀ ajustando la liberación total de Hb al 100% con la liberación fraccional ocasionada por cada concentración de la sustancia de prueba, expresada como porcentaje relativo de la liberación máxima de Hb.

Desnaturalización de proteínas

El tensoactivo, a una concentración del 1%, fue incubado con los GR bajo las mismas condiciones que se emplearon en la hemólisis. Como patrón interno de desnaturalización total se tomó una concentración de SDS de 3,47 mmol/L (1000 ppm); el sobrenadante fue monitoreado a 542 y 577 nm.

Para el análisis de los resultados, la absorbancia a 577 nm se dividió por la absorbancia a 542 nm, obteniendo la relación α/β,que se usó para calcular el índice de desnaturalización (ID) de Hb mediante la siguiente ecuación:

ID = 100 (R1 – Ri)/ (R1 – R2) (%) Ecuación 1.

donde R1: relación α/β para HbO₂ sin emplear tensoactivo; R2: relación α/β para estándar interno (SDS 3,47 mmol/L); R1-R2: desnaturalización total de HbO₂; Ri: relación α/βpara la sustancia evaluada; R1 – Ri: desnaturalización debida al tensoactivo.

Cálculo del índice de irritación

La relación CH₅₀/ID se emplea como medida del potencial de irritación ocular de acuerdo con la siguiente clasificación: CH50/ID > 100 – no irritante; CH₅₀/ID >10 –levemente irritante; CH₅₀/ID > 1 - moderadamente irritante; CH₅₀/ID > 0,1 – irritante; CH₅₀/ID < 0,1 – muy irritante.

Validación de la metodología analítica

Linealidad

Con el propósito de corroborar la correlación entre la absorbancia de HbO₂ y su concentración, se efectuó una curva de calibración en tres diferentes niveles (0,010, 0,051 y 0,120 mmol/L), con cuatro réplicas. Evaluadores estadísticos: ANOVA, análisis de la regresión y de correlación.

Repetibilidad

Se estimó mediante el coeficiente de variación promedio ponderado (RSDp), desarrollando la metodología completa en un mismo día, con los mismos reactivos y el mismo analista. Evaluador estadístico: RSDp, obtenido a partir del test de Cochran.

Precisión intermedia

Este parámetro se valoró mediante la diferencia estadística de los resultados obtenidos al desarrollar la metodología, variando el día, el analista y con 4 réplicas. Evaluador estadístico: análisis estadístico ANOVA.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Ajuste de oxihemoglobina y linealidad

La linealidad, establecida por mínimos cuadrados para diferentes concentraciones de HbO₂ a una λ de 577 nm, dio como resultado la ecuación de la curva:

y = 14,453x + 0,1684 R² = 0,9781 Ecuación 2.

Con esta curva de calibración se demuestra el cumplimiento de la ley de Lambert-Beer en un rango de absorbancia de 0,000 a 2,000, dado que al ajustar la HbO₂ a 0,122 mmol/L, concentración empleada para los ensayos de hemólisis y desnaturalización, la absorbancia corresponde aproximadamente a 1,9. El ajuste de HbO₂ permite estandarizar la concentración de la suspensión de GR para cada uno de los ensayos sucesivos (6-8).

En la tabla 1 se reportan los valores experimentales para intercepto y pendiente, así como los valores de t para la prueba de t de Student con 10 grados de libertad y una probabilidad de error del 5%; así mismo se muestran los límites calculados de acuerdo al error estándar de cada uno. Los valores experimentales de t indican convergencia al origen (t experimental < t de la tabla), un valor de pendiente significativamente diferente a cero (t experimental > t de la tabla) y una correlación entre las variables dependientes y las independientes (t experimental > t de la tabla). El cero se encuentra dentro de los límites calculados para el intercepto. El valor experimental de Fisher para el análisis de varianza es mayor al F de la tabla, para los correspondientes grados de libertad (F_exp: 72,22, F_tab: 4,96 (gl1: 1, gl2: 10, α: 0,05)) e indica una regresión significativa. De esta manera se demostró la capacidad de la metodología analítica de brindar una respuesta directamente proporcional a la concentración del analito en la muestra dentro de un rango definido, acorde al intervalo de concentraciones de trabajo.

Hemólisis

En la figura 1 se muestran los cambios espectrofotométricos de absorción de HbO₂ ante diferentes concentraciones de SDS. Se definen claramente dos máximos de absorción (uno a 542 y otro a 577 nm), siendo mayor a 577 nm cuando se emplean bajas concentraciones de SDS, invirtiendo su comportamiento a concentraciones altas del surfactante (mayores a 80 ppm). Los espectros de absorción a concentraciones de 600 y 1000 ppm no presentan los máximos de absorción característicos a las longitudes de onda mencionadas y tampoco se interceptan con las demás. Allí es claro el fenómeno de desnaturalización de proteínas, lo que hace que disminuya la absorción de la HbO₂.

Aunque varios autores recomiendan otras longitudes de onda para monitorear hemólisis (6-8, 13-15), en esta investigación se seleccionó 577 nm para ajustar la HbO₂ y determinar la CH₅₀ ya que, además de ser éste un pico de alta absorción, en esta longitud de onda se visualiza con claridad el límite entre la hemólisis y la desnaturalización, tal como se aprecia en la figura 2, lo cual no ocurre con otras longitudes evaluadas (resultados no mostrados). Además, Kirschenbaum, 1978 (12) reporta diferentes valores para el coeficiente de extinción molar de HbO₂, siendo 576,5 nm el más cercano a nuestros resultados.

La figura 2 señala los cambios en la absorción, inducidos por concentraciones crecientes de SDS. A partir de 10 ppm empieza a hacerse evidente el efecto del tensoactivo sobre las membranas de los GR, liberándose la Hb y aumentando su absorción hasta llegar a un máximo en 80 ppm, concentración a la cual la hemólisis es del 100%. A partir de esta concentración de SDS, la absorbancia empieza a disminuir, y se inicia la desnaturalización de las proteínas, que se hace máxima en 400 ppm, momento en el cual el tensoactivo no tiene más proteínas por desnaturalizar.

Con la relación dosis-respuesta establecida en la hemólisis, se calculó una CH₅₀ de 21,3 ppm. En las validaciones que realizaron Pape et al., 1990 (6, 7) y Martínez et al. 2006 (15), la CH₅₀ para el SDS fue de 29,0 ppm y 43,6 ppm respectivamente. Estas diferencias seguramente obedecen a variaciones en las condiciones de experimentación entre laboratorios. Nuestros resultados son más cercanos a los obtenidos por los creadores de la metodología (6, 7).

La hemólisis ocurre por la interacción entre los fosfolípidos de la membrana celular y los aniones del SDS (16, 17), conduciendo a la liberación del pigmento natural Hb, cuyas cargas y enlaces dobles le brindan la propiedad de absorber al UV/VIS (18); se establece de esta manera el principio del ensayo RBC para la determinación de hemólisis.

Desnaturalización de proteínas

En la figura 2 se aprecia que la desnaturalización de la Hb se hace total a partir de 400 ppm. El ensayo RBC establece una concentración del tensoactivo del 1% (10000 ppm) para valorar la desnaturalización, con lo cual se garantiza que ésta sea total. Además, en esta técnica, el estándar interno es el SDS 3,47 mmol/L (1000 ppm), reconociéndose que este tensoactivo genera desnaturalización completa, incluso en concentraciones 10 veces inferiores a la evaluada. La desnaturalización proteica ocurre por perturbación de las interacciones hidrofóbicas y electrostáticas de las proteínas, ocasionada por el SDS (18).

En la presente investigación, el ID del SDS fue 99,90 ± 2,18 y la relación CH₅₀/ID fue 0,21 ± 0,01, clasificándose este surfactante como irritante, lo cual concuerda con lo reportado por los creadores de la metodología (6).

Repetibilidad

El test de Cochran que se aplicó para esta metodología indica que para todas las longitudes de onda no se rechaza la hipótesis de varianzas equivalentes, lo que sugiere que la varianza de los resultados es independiente de la concentración de surfactante analizada. Tal como se evidencia en la tabla 2, la variación en el resultado de absorbancia en los ensayos de hemólisis y de desnaturalización, permitió obtener unos RSDp considerablemente inferiores al valor máximo permitido para sustancias de origen biológico, que es del 15% (19), lo que brinda un primer nivel de precisión confiable para esta metodología in vitro.

Precisión intermedia

Partiendo del anterior análisis es posible la aplicación de un ANOVA para evaluar la precisión intermedia a cualquier nivel de concentración de SDS. Los resultados de este análisis muestran que el valor experimental de Fisher en la prueba de hemólisis es menor al F de la tabla en los tres parámetros evaluados, analista, día y réplica (F_exp 0,49; 1,02 y 0,01 frente a F_tab de 4,96 4,96 y 3,71 respectivamente, para analista, día y réplica); lo mismo ocurre en la prueba de desnaturalización (F_exp 0,17; 1,12 y 0,39 frente a F_tab de 4,96; 4,96 y 3,71 respectivamente, para analista, día y réplica). Lo anterior no indica una regresión significativa y existe evidencia estadística suficiente para señalar que los cambios en cuanto a analista, día y número de réplicas no causan una variación considerable en la respuesta para el SDS.

CONCLUSIONES

En el marco de las actuales tendencias en materia de regulación es importante contar con alternativas al uso de animales de experimentación para valorar la seguridad de sustancias y formulaciones. Con este estudio se logró la validación intralaboratorio de una metodología in vitro, alternativa al test de Draize, evaluando los parámetros de linealidad y precisión a dos niveles (repetibilidad y precisión intermedia con variación de día y analista). Se obtuvo linealidad en el rango de concentraciones empleado en la curva de calibración, lo cual hace posible la valoración de HbO₂ en el intervalo en el que se realiza su ajuste. De igual manera, se demostró la repetibilidad de los ensayos, así como equivalencia entre las varianzas a diferentes concentraciones de SDS en cada ensayo. Se recomienda practicar el test únicamente con extracto de glóbulos rojos frescos, obtenido de terneros sanos y no medicados, para descartar interferencias en las lecturas de absorción. RCB es una opción que contribuye a evaluar la irritación ocular producida por surfactantes, bien sea como materias primas o incluidos en formulaciones. Esta metodología constituye una alternativa para las evaluaciones de seguridad.

AGRADECIMIENTOS

Por sus aportes al progreso de esta investigación y al acompañamiento académico extendemos un sincero agradecimiento al laboratorio de Patología Clínica de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia y al Grupo de Investigaciones Toxicológicas del Departamento de Farmacia de la Universidad Nacional de Colombia.

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