INVESTIGACIÓN ORIGINAL

 

DOI 10.17533/udea.iatreia.v28n3a04

Colonización y factores de virulencia de Staphylococcus aureus resistente a meticilina en una población infantil de Montería

Colonization and virulence factors of methicillin resistant Staphylococcus aureus in a pediatric population in Montería, Colombia

Colonização e fatores de virulência de Staphylococcus aureus resistente a meticilina numa população infantil de Montería

Dina Marcela Ricardo-Caldera¹; Francisco Alberto Buelvas-Doria¹; Javier Antonio Escobar-Pérez²; Catalina Tovar-Acero¹

1 Grupo de Investigación en Enfermedades Tropicales y Resistencia Bacteriana, Universidad del Sinú, Montería, Colombia. dinaricardoc@unisinu.edu.co

2 Laboratorio de Genética Molecular Bacteriana, Universidad El Bosque, Bogotá, Colombia.

Recibido: julio 17 de 2014
Aceptado: noviembre 11 de 2014

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RESUMEN

Introducción: Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM) puede colonizar el cuerpo humano, con mayor frecuencia en las fosas nasales, pero también en las manos, el periné y la faringe. Además, se ha propuesto que la colonización puede ser un factor de riesgo para adquirir infecciones futuras.

Objetivo: determinar la prevalencia y las características microbiológicas y moleculares del SARM en una población infantil sana.

Metodología: se hizo un estudio descriptivo transversal para determinar la tasa de colonización nasal por SARM en 150 niños pertenecientes a 13 hogares infantiles de la ciudad de Montería. Los aislamientos se hicieron a partir de hisopados nasales y faríngeos, se identificaron mediante pruebas microbiológicas convencionales y se confirmaron y caracterizaron por métodos moleculares.

Resultados: la tasa de colonización por SARM fue del 9,3% (14/150). El 62,5% de los aislamientos portaban el SCCmec subtipo IVc; 87,5% de los aislamientos presentaron los genes que codifican para PVL y Sek, mientras que 81,2% portaban el gen bsaB.

Conclusión: el porcentaje de colonización hallado es uno de los más altos reportados para la población infantil de la región Caribe colombiana, y los aislamientos presentaron factores de virulencia relacionados con cuadros clínicos agresivos.

PALABRAS CLAVE

Factores de Virulencia, Jardines Infantiles, Preescolar, Staphylococcus Aureus Resistente a Meticilina

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SUMMARY

Introduction: Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is able to colonize the human body, most frequently the nostrils, but also the hands, perineum and throat. Such colonization has been proposed as a risk factor to acquire future infections.

Objective: To determine the prevalence, and the microbiological and molecular characteristics of MRSA in healthy children.

Methodology: A cross-sectional descriptive study was done of 150 children from 13 day care centers in Montería, Colombia. Nasal and throat swabs were obtained. The isolates were identified and characterized by microbiological and molecular methods.

Results: The MRSA colonization rate was 9.3% (14/150). 62.5% of the isolates carried the subtype IVc of SCCmec, and 87.5% had the genes encoding for PVL and Sek, while 81.2% carried the gene bsaB.

Conclusion: The percentage of colonization found is one of the highest reported among children from the Colombian Caribbean region, and the isolates have virulence factors that have been associated with an aggressive clinical course.

KEY WORDS

Child; Child Day Care Centers, Methicillin resistant Staphylococcus aureus, Virulence Factors

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RESUMO

Introdução: Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM) pode colonizar o corpo humano, com maior frequência nas fossas nasais, mas também nas mãos, o períneo e a faringe. Ademais, propôs-se do que a colonização pode ser um fator de risco para adquirir infecções futuras.

Objetivo: determinar a prevalência e as características microbiológicas e moleculares do SARM numa população infantil sã.

Metodologia: fez-se um estudo descritivo transversal para determinar a taxa de colonização nasal por SARM em 150 crianças pertencentes a 13 lares infantis da cidade de Montería. Os isolamentos se fizeram a partir de amostras com suabe nasais e faríngeos, identificaram-se mediante provas microbiológicas convencionais e se confirmaram e caracterizaram por métodos moleculares.

Resultados: a taxa de colonização por SARM foi de 9,3 % (14/150). 62,5% dos isolamentos portavam o SCCmec subtipo IVc; 87,5% dos isolamentos apresentaram os genes que codificam para PVL e Sek, enquanto 81,2% portavam o gene bsaB.

Conclusão: a porcentagem de colonização achado é um dos mais altos reportados para a população infantil da região Caribe colombiana, e os isolamentos apresentaram fatores de virulência relacionados com quadros clínicos agressivos.

PALAVRAS CHAVE

Fatores de Virulência, Jardins Infantis, Pré-escolar, Staphylococcus Aureus Resistente a Meticilina

Cómo citar: Ricardo Caldera DM, Buelvas Doria FA, Escobar Pérez JA, Tovar Acero C. Colonización y factores de virulencia de Staphylococcus aureus resistente a meticilina en una población infantil de Montería. Iatreia. 2015 Jul-Sep;28(3): 259-268. DOI 10.17533/udea.iatreia.v28n3a04.

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INTRODUCCIÓN

Staphylococcus aureus es un microorganismo que puede encontrarse colonizando el cuerpo humano, principalmente las fosas nasales, pero también las manos, el periné y la faringe. Se considera que dicha colonización es uno de los principales factores responsables de la diseminación del germen y de la generación de infecciones estafilocócicas tanto comunitarias como nosocomiales (1). Las más frecuentes son las infecciones de la piel y los tejidos blandos, pero también puede ocasionar enfermedades sistémicas (2-4). Además, S. aureus cuenta con un arsenal de factores de virulencia que contribuyen a su supervivencia y desarrollo, y que son desencadenantes de las manifestaciones clínicas y responsables de la gravedad de sus infecciones (5); entre dichos factores se encuentran varias hemolisinas (α, β, γ, δ), la leucocidina de Panton Valentine (PVL por la sigla en inglés de Panton Valentine Leukocidin), las toxinas exfoliativas A y B, el grupo de las toxinas pirógenas superantígenos (PTSAg) que incluye la toxina del choque tóxico y las enterotoxinas estafilocócicas (SE) y las modulinas solubles en fenol, descritas recientemente (6,7). Tiene además la capacidad de adquirir plásmidos, transposones y secuencias de inserción que le confieren resistencia a múltiples antibióticos (5); todo esto en conjunto le ha permitido a este microorganismo posicionarse como un patógeno de gran importancia en salud pública.

La resistencia de S. aureus a los antibióticos betalactámicos es causada principalmente por la adquisición del gen mecA, que se encuentra en un elemento genético móvil llamado casete estafilocócico cromosómico mec (SCCmec) (Sthaphylococcal Cassette Chromosome mec). El gen mecA codifica para una proteína modificada de unión a penicilina conocida como PBP2a (Penicillin Binding protein 2a), que se caracteriza por su afinidad disminuida a los antibióticos beta-lactámicos (8). En un principio, las cepas de S. aureus resistentes a meticilina (SARM) se asociaron con infecciones intrahospitalarias, pero desde el año 1990 se las ha reportado en la comunidad como causa de infecciones en la piel y los tejidos blandos, en niños y en adultos jóvenes sin factores de riesgo predisponentes a infecciones hospitalarias; los primeros casos se informaron en Australia (9) y Estados Unidos (10), y desde entonces se han diseminado por todo el mundo (11-14).

En los últimos años ha ido cambiando la epidemiología del SARM; en un comienzo las infecciones por SARM adquiridas en los hospitales (SARM-AH) generalmente ocurrían en personas con factores de riesgo asociados a hospitalización reciente, terapia con antibióticos, cirugías y estancias largas en la unidad de cuidado intensivo; mientras que las infecciones producidas por SARM adquirido en la comunidad (SARM-AC) ocurrían en personas sanas de comunidades cerradas como grupos familiares, militares, reclusos, niños en guarderías y deportistas sin factores de riesgo hospitalarios, en condiciones de hacinamiento y con prácticas de higiene inadecuadas. Actualmente esta distinción no está clara puesto que se han publicado informes según los cuales las cepas comunitarias han migrado a los hospitales reemplazando a las cepas tradicionalmente hospitalarias (15,16). En la ciudad de Medellín se reportaron cepas comunitarias que han migrado al hospital, las cuales albergan el SCCmec de subtipo IVc con tasas de prevalencia hasta del 68,2%, y que han desplazado las cepas tradicionalmente hospitalarias que portaban el SCCmec de los tipos I, II y III (16).

La colonización puede llegar a ser un factor de riesgo predisponente para adquirir infecciones, desde leves, como las de la piel y los tejidos blandos, hasta graves como enfermedades sistémicas. Por su condición inmunológica y hábitos de cuidado, la población infantil es vulnerable a este tipo de infecciones y constituye un escenario ideal para la diseminación de clones con perfiles de resistencia. En la región de la costa Atlántica colombiana existe poca información sobre el comportamiento del SARM en la población infantil de la comunidad; por ello, en nuestro estudio se determinaron la prevalencia y las características microbiológicas y moleculares de este microorganismo en una población infantil sana de la ciudad de Montería, para caracterizar las cepas circulantes en la ciudad y contribuir al análisis de la epidemiología local de este patógeno.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se llevó a cabo un estudio descriptivo transversal de 150 niños pertenecientes a 13 hogares infantiles de Montería ubicados en los barrios Rancho Grande y Sucre, en el período comprendido entre agosto del 2010 y marzo del 2011. Previa autorización del acudiente se procedió a la obtención de dos hisopados, uno nasal y otro faríngeo, que se almacenaron y transportaron en caldo tripticasa soya. Se analizaron las variables edad y sexo empleando herramientas del software Epi Info.

Identificación microbiológica

Las muestras se incubaron 24 horas en caldo tripticasa soya y se sembraron en agar salado manitol; las colonias morfológicamente compatibles con S. aureus se analizaron por coloración de Gram, se sembraron en agar sangre de cordero al 5% (17), y se les hicieron pruebas bioquímicas corrientes (catalasa, coagulasa y DNasa) (18) complementadas con pruebas en el sistema MicroScan PC29 (Dade Behring, CA, EE. UU.). Como control se utilizó la cepa de S. aureus ATCC 29213.

Perfiles de susceptibilidad

La sensibilidad a los antimicrobianos se determinó por el sistema MicroScan PC29 (Dade Behring, CA, EE. UU.) y por la técnica de difusión en agar empleando los siguientes antibióticos: penicilina (10 µg), oxacilina (1 µg), eritromicina (15 µg), clindamicina (2 µg), tetraciclina (30 µg), vancomicina (30 µg) y cefocitina (30 µg). Como control se utilizó la cepa de S. aureus ATCC 25923. Se analizaron la presencia de resistencia inducible a clindamicina mediante la prueba del DTest (19), y la susceptibilidad a mupirocina (200 µg) (20,21) y tigeciclina (15 µg), siguiendo las recomendaciones del CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute) 2013. Los aislamientos de S. aureus resistentes a meticilina se conservaron en caldo LB (Luria Bertani) con glicerol al 10% a -70 °C.

Caracterización molecular

Extracción de ADN: se hizo por medio de lisis por ebullición: se tomaron 1 a 5 colonias y se suspendieron en 100 µL de agua destilada estéril; la mezcla se llevó a 95 °C por 10 minutos y luego se centrifugó a 5.000 rpm por 5 minutos; 1 µL del sobrenadante se utilizó como molde para la reacción de PCR y el resto se conservó a -20 °C.

Detección de los genes nuc y mecA y determinación del tipo de SCCmec: para la detección del gen nuc se utilizaron los iniciadores descritos por Lina y colaboradores, y para la del gen mec, los iniciadores utilizados por McClure y colaboradores (22,23). Para la determinación de los tipos de SCCmec se diseñaron iniciadores dirigidos al complejo de genes ccr (tabla 1); en cuanto a la determinación de los subtipos, se emplearon los iniciadores y las condiciones reportados por Escobar y colaboradores y por Milheirico y colaboradores (24,25).

Para la detección de los genes nuc, mecA y la tipificación de los SCCmec se utilizaron las siguientes condiciones de PCR: desnaturalización inicial a 95 °C por 2 minutos; 30 ciclos de desnaturalización a 95 °C por 1 minuto; para la detección de los genes nuc y mecA, se utilizó un anillamiento a 52 °C por 1 minuto; para la tipificación de los SCCmec se utilizó un anillamiento a 55 °C por 1 minuto, extensión a 72 °C por 30 segundos y extensión final a 72 °C por 2 minutos.

La mezcla de reacción para la tipificación de los SCCmec contenía 1 µL de ADN molde, los iniciadores se utilizaron a una concentración de 0,3 µM, 200 µM de cada dNTP, buffer Taq 1X, MgCl2 1,5 mM y Taq polimerasa 1U en un volumen final de 25 µL.

Detección de factores de virulencia: mediante la PCR multiplex descrita por Escobar y colaboradores (26), se hizo la detección de los genes lukF/S-PV, sek, sem, seo y bsaB que codifican para la PVL, las enterotoxinas K, M y O, y la bacteriocina B, respectivamente. Además, se determinó la presencia de la isla de patogenicidad 5 (SaPI5), por la amplificación del gen sausa300_ 0808 (24).

Establecimiento de la relación genética por electroforesis en gel de campo pulsado: el protocolo de extracción del ADN cromosómico se efectuó de acuerdo con lo descrito por Mulvey y colaboradores (27), con algunas modificaciones. La restricción de los bloques se llevó a cabo con la enzima SmaI por 3 horas a 25 °C. La electroforesis se hizo en el sistema CHEF-DRII con las condiciones descritas por Murchan y colaboradores (28), los patrones electroforéticos registrados se visualizaron y fotografiaron en un transluminador; además, se analizaron mediante la elaboración de una matriz empleando el software Fingerprinting II versión 3.0, usando el coeficiente Dice y una tolerancia del 1,5%. En la interpretación del dendrograma se tuvieron en cuenta los criterios de Tenover (29).

RESULTADOS

Los 150 niños hacían parte de trece hogares infantiles en dos barrios de Montería. De ellos, 31 (20,7%) estaban colonizados por S. aureus y 14 de estos (45,2%) lo estaban por SARM en las fosas nasales. Sin embargo, el total de aislamientos de SARM fue de 16 porque dos niños estaban colonizados tanto en las fosas nasales como en la faringe. Todos los aislamientos de SARM amplificaron los genes nuc y mecA. La edad promedio de los niños portadores de SARM fue de 3,3 años (1-5 años). Nueve de los 14 niños colonizados (64,3%) eran del sexo femenino. En todos los hogares infantiles se encontraron niños colonizados por S. aureus, pero solo en seis se halló colonización por cepas SARM. Once de los 16 aislamientos de SARM (68,8%) presentaron resistencia a tetraciclina; nueve (56,3%) a eritromicina y dos (12,5%) a clindamicina. Los 16 mostraron sensibilidad a los demás antibióticos ensayados, incluyendo mupirocina y tigeciclina.

La tipificación del SCCmec de los aislamientos SARM mostró que todos ellos amplificaron el fragmento de 959 pb correspondiente a los genes ccrA2/ccrB2 (SCCmec de tipo II y IV), y para diferenciarlos se utilizó el gen mecI, que no amplificó lo que define los aislamientos como de tipo IV. Adicionalmente, se determinaron los subtipos del SCCmec tipo IV, con el siguiente resultado: 10 (62,5%) portaban el subtipo IVc y 6 (37,5%), el subtipo IVa.

En cuanto a la detección de los factores de virulencia, 14 de los 16 aislamientos (87,5%) presentaron los genes que codifican para PVL y Sek; 13 (81,3%) portaban el gen que codifica para la bacteriocina B de S. aureus; no se hallaron las enterotoxinas sem y seo en los 16 aislamientos analizados. Todos los aislamientos portaban el gen sausa_0808, que se encuentra en la isla de patogenicidad 5 (SaPI5) (tabla 2). Sin embargo, los aislamientos con SCCmec subtipo IVa albergaron una variante del gen sausa_0808 con una inserción de 54pb.

A partir del análisis de restricción del genoma con la enzima SmaI, se obtuvieron cinco pulsotipos, que se clasificaron en los grupos A, B y C. El grupo A se dividió en dos subgrupos, a saber: el A1 constituido por seis aislamientos idénticos y uno posiblemente relacionado, que provenían de diferentes hogares infantiles; el subgrupo A2 lo conformaron dos aislamientos idénticos y pertenecientes a un mismo hogar infantil. El grupo A tiene un porcentaje de similitud del 80,6% con el clon USA300 (figura 1). El grupo B lo conformaron cuatro aislamientos provenientes de tres hogares infantiles. Solo hubo un aislamiento del grupo C. Los dos aislamientos restantes (FF104 y FF130) se excluyen de esta información tal como se explica en la leyenda de la figura 1.

DISCUSIÓN

Mundialmente, la tasa de prevalencia de portación de SARM en niños sanos que asisten a hogares infantiles varía entre 0,14% y 29% (30-34). En un estudio en India se halló un porcentaje del 29% de portación nasal en niños que asistían a guarderías, y se encontró que el riesgo de ser portador aumenta con la edad en niños de familias numerosas (31). En Brasil, Lamaro y colaboradores (32) informaron en el 2009 un porcentaje de colonización por S. aureus del 31,2% en la población infantil de 62 guarderías, de los cuales 1,2% correspondieron a cepas de SARM con casetes de los tipo III, IV y V, sin hallazgos positivos para PVL; caracterizaron variables individuales y sociodemográficas del núcleo familiar y los factores de riesgo potenciales para la portación nasal de SARM; esta se relacionó en mayor proporción con el sexo masculino, mientras que el alto nivel de escolaridad de las madres fue un factor protector para la colonización. En nuestro estudio no se encontró significancia estadística de las variables edad y sexo con la portación de SARM; entre los portadores hubo predominio del sexo femenino, lo que coincide con lo reportado por Castro y colaboradores en Cartagena (35).

En Colombia se han publicado cuatro estudios en niños entre los años 2010 y 2012, dos de estos en la ciudad de Cartagena; uno en el 2010, de Rebollo y colaboradores (36), y el otro en el 2011, de Castro y colaboradores (35); se encontraron tasas de portación de SARM de 4,8% y 9%, respectivamente. En Montería, Lozano y colaboradores (37) hallaron en 2010 una prevalencia del 3,3%; en el 2012 Rodríguez y colaboradores en Medellín (38) reportaron una tasa del 4,75%; en el presente estudio se halló un porcentaje de colonización del 9,3 %, que hasta el momento es el más alto informado en el país en esta población; ello puede estar relacionado con la elección del sitio anatómico para la toma de muestra, lo que concuerda con estudios anteriores que describen las fosas nasales como uno de los sitios anatómicos con mayor porcentaje de colonización por SARM (1,39). En nuestro estudio se tomaron muestras tanto de las fosas nasales como de la faringe, y se obtuvo el mayor porcentaje de colonización en las primeras.

El hallazgo de SCCmec subtipo IVc en la mayoría de los aislamientos de este estudio coincide con los resultados descritos por Rebollo y colaboradores en Cartagena (36) en el 2011 y por Rodríguez y colaboradores en Medellín (38) en el 2012, en los que se evidenció que el subtipo de SCCmec más prevalente en las cepas de la comunidad sigue siendo el IVc; en el estudio de Rebollo se aislaron cinco cepas SARM, dos de las cuales (40%) portaban el tipo IV, mientras que ocho de los 19 SARM obtenidos por Rodríguez (42,1%) portaban el SCCmec subtipo IVc; estos datos concuerdan con los de estudios en otros países: Portugal, Taiwán y Estados Unidos (30,33,34).

Escobar y colaboradores (26) diseñaron en el 2012 una PCR basada en el hallazgo de cinco factores de virulencia que ayudan a identificar rápidamente los aislamientos de SARM adquiridos en la comunidad: los genes lukS/F-PV, sek y bsaB son marcadores genéticos específicos para los aislamientos de SARM-AC, mientras que los genes sem y seo lo son para los aislamientos de SARM-AH. En nuestro estudio 14 de los 16 aislamientos analizados presentaron los genes específicos para los SARM-AC.

Es preocupante encontrar niños sanos colonizados por cepas de SARM portadoras de genes de virulencia como los de la PVL, que están asociados con infecciones graves como la neumonía necrosante, porque los niños son susceptibles a ser colonizados por el contacto cercano con otros niños, y a desarrollar infecciones por ser inmunológicamente inmaduros; los niños colonizados por SARM pueden diseminarlo y dar lugar a infecciones tanto comunitarias como hospitalarias, con el agravante que estas cepas poseen factores de virulencia que pueden aumentar la gravedad de las infecciones. Dado lo anterior, es necesario hacer estudios multicéntricos de seguimiento continuo de esta población altamente susceptible, con el fin de monitorizar las cepas circulantes de SARM, evaluar los factores de riesgo para la colonización en cada comunidad y diseñar e implementar estrategias que permitan contener la diseminación de estas cepas.

CONFLICTO DE INTERESES

Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

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