Caracterización fenotípica

La forma de las hojas fue uniforme dentro de cada individuo y de cada tipo de cacao evaluado. El largo de la hoja varió entre 271,2 y 392,6 mm, mientras que el ancho tuvo valores entre 90,0 y 132,6 mm. En total se observaron dos formas de la base y dos del ápice. Igualmente, en la intensidad del color de la hoja también se observaron dos variantes. La muestra de hoja obtenida de Becerril, identificada con el código 008, tuvo el menor tamaño con 287,0 mm de longitud y 90,6 mm de ancho. Además, la mayoría de las hojas de los cultivares evaluados posee la base obtusa, el ápice acuminado, con intensidad de color media. Aunque el tamaño de la hoja no es empleado para diferenciar los cultivares de cacao, las diferencias observadas, especialmente en el ancho del limbo, reflejan que existe un grado de variabilidad entre ellos.

Igualmente, la forma de los frutos fue homogénea dentro de cada individuo evaluado. La longitud en todos los cultivares varió entre 110 y 277 mm; el diámetro, entre 55 y 200 mm, y el grosor del epicarpio, entre 4,35 y 17,97 mm. Se observó diversidad en las formas del fruto, y la forma oblonga fue la más frecuente (figura 1). En la mayoría de los cultivares el estrangulamiento basal del fruto estuvo ausente o muy débil; se observaron dos formas de ápice, y la superficie del fruto que predominó fue la moderadamente rugosa. El color del fruto fue variado, sobresaliendo el amarillo. Los colores de la pulpa observados fueron blanco y crema claro (tabla 2). Esta diversidad de formas entre cultivares muestra la variabilidad que existe entre ellos, rasgos que permiten diferenciarlos e identificarlos.

Fuente: Elaboración propia

Figura 1 Frutos de Theobroma cacao de cultivares del corregimiento de Mingueoa. Crio-12; b. Crio-11; c. Crio-6; d. CCN51-5; e. ICS60-4; f. ICS39-3; g. ICS95-2; h. ICS39-1. 

En relación con el número de semillas por fruto, el clon CCN51 es el que posee mayor cantidad de semillas, seguido del Criollo de Becerril (008), con 42 semillas; el cultivar con menor cantidad de semillas fue el híbrido ICS95 (tabla 2). El número promedio de semillas fue 30, con una longitud que osciló entre 29,76 y 21,53 mm, y un ancho entre 15,17 y 10,59 mm. El grosor de las semillas varió de 7,9 a 12,2 mm. En este sentido, el tamaño de las semillas de los criollos encontrados en Mingueo fue más grande que el de los híbridos. La mayoría de las semillas fueron ovales u oblongas, y el color del cotiledón predominante fue el púrpura oscuro, seguido del blanco. Todas las muestras de los cacaos identificados como criollos poseen cotiledones de color blanco (tabla 2). Las variantes morfológicas de las semillas observadas son características de cada cultivar y se reflejan en las características productivas y organolépticas de estos cacaos. De esta manera, sobresale la coloración de los cacaos criollos en relación con los híbridos comerciales (^{García, 2009}).

Tabla 2 Características fenotípicas sobresalientes de los cultivares de cacao encontrados en Dibulla, La Guajira 

Fuente: Elaboración propia

Los cultivares de cacao estudiados fueron agrupados en cacaos nativos y cacaos no nativos, y se compararon los rasgos cuantitativos entre los dos grupos. Según la prueba de Mann-Whitney, se acepta la hipótesis nula Ho para las variables longitud del fruto, longitud del limbo, grosor del epicarpio, número de semillas y pH, es decir, no existen diferencias significativas entre los dos grupos de cacao (p = 0,01). Por otro lado, al comparar las variables ancho del limbo, diámetro del fruto, ºBrix y longitud, ancho y grosor de la semilla, se rechaza la hipótesis nula, señalando que existen diferencias significativas con 99% de confianza (p = 0,01) entre los cacaos criollos y los híbridos, para estas variables.

El análisis de agrupamiento mediante características fenotípicas cuantitativas por método de Ward forma dos grandes clados (figura 2): en un clado se ordenaron los cultivares criollos, incluyendo la variedad de cacao Criollo usado como control, y en el otro, los cultivares híbridos.

El PCA se realizó comparando las características cualitativas y cuantitativas (figura 3). La dispersión de las muestras indica que los parámetros con mayor influencia sobre la variabilidad son GS (grosor de la semilla), CC (grosor del cotiledón), LF (longitud del fruto), CF (color del fruto), FF (forma fruto), PLF (profundidad entre los lomos), LS (longitud de la semilla) y FSLS (forma longitudinal de la semilla). Asimismo, se observa una segregación de los cacaos criollos de los cultivares comerciales (figura 3).

Fuente: Elaboración propia con PCORD

Figura 2 Dendrograma de los cultivares de cacao evaluados a partir de rasgos fenotípicos cuantitativos. Agrupamiento por método de Ward y distancia euclidiana 

Fuente: Elaboración propia con PCORD

Figura 3 Análisis multivariado PCA a partir de características fenotípicas cuantitativas y cualitativas 

Análisis genotípico

Inicialmente se realizaron algunas extracciones de ADN; sin embargo, el rendimiento y la calidad fueron muy bajas. Dentro de este procedimiento, las primeras extracciones orgánicas no separaron bien los ácidos nucleicos de los residuos celulares, pues al final del procedimiento se observaron grandes cantidades de un pellet blanco, y no se lograba amplificar la secuencia ITS a partir de estos ADN. Por este motivo, se realizaron varios ajustes y pruebas empleando diferentes concentraciones de PVP, sin obtener cambios significativos. Luego, se aumentó la concentración de 2-β-Mercaptoethanol al 1% y el número de extracciones orgánicas con cloroformo: AIA hasta cuatro veces. Así se obtuvieron mejores resultados, que fueron verificados por cuantificación espectrofotométrica.

Uno de los factores que afecta la extracción de ácidos nucleicos a partir de hojas de T. cacao, y que interfiere en la calidad y cantidad de ADN, es la alta concentración de polifenoles y polisacáridos en el tejido foliar de la planta (^{Henao et al., 2017}; ^{Martínez et al., 2013}; ^{Schrader et al., 2012}). Una vez realizados los ajustes al protocolo de extracción, se obtuvieron los ADN; según la relación 260/280, estos aún contenían algunos contaminantes. Dada la presencia de estos residuos, se ajustaron las concentraciones de la muestra realizando diluciones para disminuir el efecto de inhibidor y mantener una concentración final de ADN de 10 ng/mL. Como han expresado algunos autores, este tipo de problema es común cuando se trabaja con esta especie (^{Chia-Wong, 2009}; ^{Martínez et al., 2013}; ^{Ruiz, 2014}). Luego se ajustó el perfil térmico de la amplificación por PCR y todos los fragmentos se evidenciaron en los corridos electroforéticos. El tamaño de estas secuencias fue de 380 pb y corresponde con la región ITS2, ubicada entre la región 5,8S y la subunidad mayor del ribosoma (^{White et al., 1990}). Esta región intergénica fue seleccionada porque permite observar variaciones intraespecíficas, debido a que posee menor presión selectiva que las regiones codificantes (^{Quijada et al., 2017}; ^{Zambrano, 2017}).

Una vez obtenidas las secuencias, se realizaron análisis de agrupamiento por métodos de distancia y métodos filogenéticos UPGMA, Neighbor-Joining, máxima verosimilitud y máxima parsimonia. Se evaluaron los modelos de sustitución nucleotídica para estas secuencias y se determinó que el modelo evolutivo que mejor se ajusta es el de Tamura-3 (^{Tamura, 1992}); a partir de estos parámetros, se construyeron los dendrogramas. En todos los métodos se formó un clado en donde se agrupan los cacaos criollos (incluyendo el de referencia de Becerril), que se distancia del clado de los cacaos híbridos comerciales. Además, la mayoría de los clados están estadísticamente soportados por todos los métodos. Así, se construyó un árbol mediante el método de máxima verosimilitud, ubicando los clados consenso y señalando la probabilidad para un Bootstrap de 1.500 réplicas para cada método (figura 4).

A pesar de que los ITS utilizados en el trabajo permitieron diferenciar al grupo de cacaos criollos de los comerciales, no permiten responder toda la historia evolutiva. Por esto, se realizó un análisis prospectivo in silico de otros marcadores, que permiten complementar este análisis y sentar bases para futuras investigaciones. Inicialmente, se hizo una búsqueda de los genomas de cloroplasto de cultivares de cacao y otras especies de la familia Malvaceae depositados en el GenBank (^{Benson et al., 2012}). Para todos los análisis se usaron los mismos cultivares de cacao y las especies de la familia variaron en cada marcador. En estos genomas se realizó una búsqueda in silico y se determinó, por métodos filogenéticos, que los marcadores matK y psbA-trnH tienen variabilidad suficiente para ver diferencias entre tipos de cacao. Por otro lado, rbcL y rpl32-trnL no permiten resolver las diferencias entre cultivares de cacao.

Fuente: Elaboración propia con Mega X

Figura 4 Análisis de parentesco entre cultivares de cacao de Dibulla, a partir de la región intergénica ITS. El árbol filogenético se construyó por el método de máxima verosimilitud, bajo los parámetros del modelo evolutivo Tamura-3 y un Bootstrap de 1.500 repeticiones. Los clados se validaron por los métodos de máxima verosimilitud, máxima parsimonia, UPGMA y Neighbor-Join, respectivamente 

En la Sierra Nevada de Santa Marta, el municipio de Dibulla cuenta con una diversidad biológica y unas características ambientales que favorecen una creciente y dinámica actividad agrícola. En este sentido, es necesario realizar programas de capacitación para la producción de cultivos de cacao de calidad a través de la identificación, selección y utilización de materiales recomendados a nivel internacional y, a su vez, la promoción del rescate de genotipos sobresalientes de tipo Criollo. Esto permitiría la conservación y multiplicación de germoplasma para iniciar programas de mejoramiento genético, con el objetivo de incrementar la calidad de los cacaos, así como la promoción de sistemas de cultivo eficientes y sostenibles en el tiempo. Este trabajo permite identificar los tipos de cacaos que se cultivan en la región, con el fin de promover su cultivo y dinamizar sus productos finales.

Al momento de caracterizar e identificar un cultivar, los rasgos fenotípicos son los más distintivos. El fenotipo se entiende como el conjunto de rasgos que son observables, ya sean morfológicos, fisiológicos o comportamentales, dentro de una especie o población; este depende del genotipo, y puede estar influenciado por factores ambientales y nutricionales (^{Botero & Arias, 2018}). En este sentido, los individuos analizados se ubicaban en la misma parcela, en un ambiente uniforme, bajo condiciones de temperatura, humedad y radiación poco variables, bajo el mismo régimen de fertilización y con prácticas fitosanitarias orgánicas iguales; además, fueron colectados y medidos el mismo día. Por lo tanto, la variación fenotípica observada debe tener poca influencia ambiental.

Dentro de los cacaos nativos encontrados en Dibulla, se evidencian claramente rasgos propios del cacao tipo Criollo, que los diferencian de los cacaos comerciales (figuras 2, 3 y 4). Estos cacaos se caracterizan por poseer hojas cuya forma de la base y ápice es obtusa y acuminada, respectivamente; la longitud y ancho de dichas hojas son uniformes. Por otra parte, la mayoría de los frutos de este cacao tienen forma oblonga, la superficie es moderadamente rugosa y el estrangulamiento basal es débil (tabla 2). Además, se encontraron dos formas de fruto, uno con ápice entallado y otro con ápice agudo. En cuanto al tamaño, los frutos son más pequeños en longitud, ancho y grosor que los comerciales. Las semillas son uniformes, con forma oval y moderadamente alargadas, y su tamaño es semejante al de los comerciales (tabla 2). En cuanto a los cultivares comerciales evaluados, se observó que conservan la mayoría de las características morfológicas descritas por ^{García (2009)}.

Asimismo, uno de los rasgos fenotípicos empleados para distinguir los cacaos criollos de otros tipos es el color del cotiledón (^{Avendaño et al., 2014}; ^{Ventura et al., 2004}). De acuerdo con esto, el color del cotiledón presentó una gran variación que se ve reflejada en el efecto sobre la distribución de las muestras en el PCA (figura 3). De este modo, se observó que los cultivares de cacaos comerciales presentaron coloración púrpura oscura, y los cacaos denominados criollos, cotiledón blanco (tabla 2).

En el caso del criollo 006, la caracterización fenotípica cualitativa mostró que este comparte características con algunos cacaos comerciales, como el color del cotiledón y la forma de la base de la hoja aguda, lo que sugiere que este criollo no sea puro, y que esté emparentado con un híbrido. Asimismo, el criollo 008 de Becerril posee algunas características semejantes al clon CCN 51, indicando que es originario de cruces entre Forasteros y Criollos (^{García, 2009}). No obstante, son pocas las características fenotípicas que relacionan estos cultivares, y estas pueden ser características poligénicas; por lo tanto, habría que hacer más análisis genéticos para determinar el grado de parentesco. Por ello, se hace necesario hacer estudios poblacionales, que abarquen mayor número de muestras, una distribución más amplia, y la segregación de rasgos en la descendencia, para examinar distinción, homogeneidad y estabilidad.

Los ITS utilizados en el trabajo permitieron diferenciar al grupo de cacaos criollos de los comerciales; sin embargo, no terminan de responder toda la historia evolutiva (^{Zambrano, 2017}). La pequeña región nuclear escogida no representa todo el genoma y, por lo tanto, no cuenta toda la evolución genética de la especie. El análisis de marcadores de DNA de cloroplasto (cpDNA) se ha utilizado cada vez más en genética de poblacionales para determinar su estructura, flujo de genes, frecuencia de haplotipos y relaciones filogenéticas (^{Gutiérrez-López et al., 2016}). Por esta razón, se hizo una evaluación in silico de otros marcadores de secuencia del genoma de cloroplasto, que permitirán hacer en el futuro análisis más profundos y precisos entre cultivares de cacao. Los análisis filogenéticos realizados los marcadores matK y trnH-psbA podrían resolver mejor las diferencias entre cultivares de cacao y permitirían entender mejor el origen y las relaciones de parentesco de los cacaos de la región. Asimismo, en futuros estudios se podrían emplear otros marcadores como los microsatélites, que permiten estimar la diversidad genética (^{Aranguren-Díaz et al., 2018}; ^{Lanaud & Risterucci, 1999}).