INTRODUCCIÓN
La tilapia roja (Oreochromis spp), es una de las especies de mayor interés en la acuicultura mundial, alcanzando una producción estimada en 2016 de 1,17 millones de toneladas métricas (FAO, 2018). En Colombia, esta es la principal especie cultivada y en 2017 representó el 61.2% de la producción piscícola colombiana (Pardo, 2018). Entre las ventajas para cultivar este cíclido se destacan su aspecto atractivo (color rojo), facilidad de cultivo, alta capacidad de adaptación a condiciones ambientales adversas, alta resistencia a enfermedades, comportamiento de alimentación omnívoro, tiempo de generación corto y crecimiento más rápido (Haque et al., 2016); además de su buena adaptación a los sistemas intensivos de cultivos (Avnimelech, 2007; Widanarni et al., 2012).
La intensificación de los sistemas de cultivo de peces aumenta los riesgos de algunas enfermedades por diferentes agentes patógenos (virus, bacterias, hongos y/o alteración de los parámetros ambientales). En este sentido, es importante tener herramientas tecnológicas que permitan vigilancia epidemiológica, seguimiento sanitario y diagnóstico de patologías en el menor tiempo posible.
Los parámetros hematológicos son indicadores rápidos de trastornos fisiológicos en los sistemas de cultivo; por tanto, existe la necesidad de establecer patrones hematológicos en los peces para poder diagnosticar patologías (Davidov et al., 2002). También, se pueden observar alteraciones en el núcleo, como el núcleo con forma ampollada, brotes, condensados, lobulados, entre otros (Barbosa, 2010; Summak et al., 2010; Islam et al., (2019).
El reconocimiento de la morfología eritrocitaria se realiza mediante analogías con objetos visibles a escala macroscópica, por ejemplo, la analogía entre los dacriocitos y la forma que tienen las lágrimas, peras, raquetas de tenis, entre otros (Campuzano, 2008). Las investigaciones realizadas en la fisiología y la morfología eritrocitaria en humanos han apoyado en el diagnóstico de ciertas afecciones (Bogdanova et al., 2020). Investigaciones llevadas a cabo en los vertebrados inferiores, han encontrado la posibilidad de analizar la deformabilidad de los glóbulos rojos de peces, a partir de la comparación de los resultados arrojados en el estudio con las investigaciones llevadas a cabo con eritrocitos humanos (Hughes et al., 1982). En otra investigación fue analizado los efectos de la temperatura en la deformación de los glóbulos rojos de trucha arco iris Oncorhynchus mykiss y raya, encontraron que la deformabilidad de los glóbulos rojos en estas especies, se vería modificada cuando los animales se exponen a cambios ambientales, con efectos considerables en la aclimatación o supervivencia en las diversas condiciones (Hughes et al., 1988). Islam et al., (2019) evaluaron estrés térmico en Pangasianodon hypophthalmus y encontraron que a altas temperaturas (36°C) se presentaron anormalidades celulares eritrociticas y las anormalidades nucleares eritrocíticas.
La geometría euclidiana, permite caracterizar los objetos regulares y homogéneos mediante el cálculo de su longitud, área y volumen (Mandelbrot, 2000); mientras que, con la geometría fractal es posible medir y caracterizar el grado de irregularidad de un objeto, cuyo resultante es una medida numérica adimensional (Mandelbrot, 1972; Rodríguez et al., 2014). Existen diferentes formas de calcular la dimensión fractal de un objeto irregular, empleadas de acuerdo con el tipo de objeto a medir. Entre ellos se encuentra el fractal salvaje, caracterizado principalmente por la superposición entre sus partes y que se mide mediante el método de Box-Counting (Rodríguez et al., 2014; Peitgen, 1992a, 1992b).
Teniendo en cuenta las diferentes alteraciones en la forma que pueden presentar los glóbulos rojos, se hace necesario plantear nuevas metodologías fundamentadas en el contexto de la geometría fractal considerando la irregularidad morfológica de estas células (Rodríguez et al., 2017a; 2018). La metodología fundamentada en el método de Box Counting permitió caracterizar el grado de irregularidad de los glóbulos rojos normales (Rodríguez et al., 2017a), de los equinocitos (Rodríguez et al., 2017b), células falciformes (Rodríguez et al., 2020), otras posibles alteraciones en la forma de los glóbulos rojos (Correa et al., 2012), incluyendo la comparación entre los valores que caracterizan los glóbulos rojos normales y los esferocitos (Rodríguez et al., 2018).
Por lo anteriormente expuesto, resulta oportuno aplicar la geometría fractal para caracterizar la irregularidad en la forma de los eritrocitos nucleados de tilapia roja (Oreochromis spp), como un primer proceso de investigación que permita ser aplicado a todas las posibles alteraciones en los eritrocitos de este y otros grupos de especies. Es por esta razón que el propósito de esta investigación es caracterizar el grado de irregularidad de los eritrocitos nucleados de Oreochromis spp, mediante las nociones de irregularidad y superficie desde el contexto de la geometría fractal y euclidiana, respectivamente, aplicando para ello el método de Box Counting, con el fin de obtener parámetros matemáticos que permitan establecer comparaciones y diferencias en otro grupo de eritrocitos que se puedan presentar en esta especie y encontrar posibles deformaciones asociadas a una enfermedad.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material biológico
Se tomaron muestras de sangre de cinco tilapias rojas con longitud total de 11.9±0.5 cm y peso de 27.8±3.6 g. Los animales se observaron aparentemente sanos, nado equilibrado en línea horizontal, sin laceraciones externas, buena coloración de cuerpo y branquias. Las muestras de sangre se obtuvieron puncionando el paquete vascular caudal, entre la línea lateral y el septo medio ventral, extrayendo de 1 a 2 mL de sangre por individuo y recibida en tubos vacutainer (Vacuette®, Greiner Bioone, USA) con anticoagulante EDTA (Ethylen Diamino Tetra Acético) (Atencio et al., 2007). Posteriormente se realizaron 20 frotis sanguíneos teñidos con colorante Wright y se realizaron microfotografías con un microscopio óptico (Carl Zeiss, Axioestar 4.3, Alemania) con cámara fotográfica digital incorporada (Canon Power Shot G10, Japón). Los eritrocitos nucleados fueron fotografiados con aumento de 40x y posteriormente editadas con el fin de que todas conserven un mismo tamaño para luego delinear el contorno de cada uno de estos eritrocitos que aparecen en las fotografías.
Método de Box Counting
A continuación, el contorno del núcleo y el citoplasma de las fotografías de los eritrocitos nucleados fue delineado. Posteriormente se utilizó el método de Box Counting incorporado en un software en lenguaje C++ diseñado por el grupo Insight en investigaciones previas, el cual superpone dos rejillas cuyas dimensiones están en píxeles, una con el doble tamaño que la otra, en cada uno de eritrocitos nucleados delineados.
Rejillas de 5x5 y 10x10 píxeles, es un conjunto de cuadros diseñado en píxeles, en donde la cuadricula de 5x5 píxeles se denomina rejilla de cuadros pequeños (Kp) y la cuadricula de 10x10 píxeles recibe el nombre de rejilla de cuadros grandes (Kg).
La superficie del objeto delineada, es todo lo que toca interior del objeto expresada en órdenes de magnitud en pixeles.
Superpuestas las dos rejillas el software realizó el conteo de los cuadros ocupados por el núcleo y el citoplasma, para evaluar a partir de estos valores la dimensión fractal con la ecuación 1 (Correa et al., 2012).
Donde Df es la dimensión fractal, N el número de espacios que contiene el contorno del objeto y K el grado de partición de la cuadrícula.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Esta es la primera investigación en el cual se aplicó el método de Box Counting, para caracterizar los eritrocitos nucleados de tilapia roja, en el contexto de las nociones de irregularidad de la geometría fractal y superficie de la geometría euclidiana. Para ello fue necesario cuantificar el espacio ocupado por el contorno del núcleo y el citoplasma para evaluar su dimensión fractal y la superficie de cada una de estas dos partes del eritrocito. Estos primeros resultados serán posteriormente comparados con los resultados de un estudio futuro, en el cual se pueda caracterizar la anormalidad eritrocitaria que se pueda presentar durante el proceso de cultivo.
Para caracterizar el grado de irregularidad de los eritrocitos nucleados, se evaluó la ocupación del citoplasma y el núcleo. En la tabla 1, se muestran los resultados establecidos a la hora de utilizar el método de Box Counting en el núcleo y citoplasma en 20 eritrocitos nucleados de los 50 que fueron delineados, cuyo citoplasma se encuentra entre 53 y 66 al superponer la rejilla Kp; entre 22 y 34 al superponer la rejilla Kg. Los espacios ocupados al superponer la rejilla Kp en el núcleo de los eritrocitos nucleados, varió entre 14 y 21, mientras que al superponer la rejilla Kg varió entre 6 y 11. La dimensión fractal del citoplasma varió entre 0.93 y 1.32 y la dimensión fractal del núcleo varió entre 0.68 y 1.32.
Fuente: Los autores. Dónde: Kp es la rejilla de 5x5 pixeles y Kg la rejilla de 10x10 x pixeles; Df es el valor de la dimensión fractal.
Las superficies del citoplasma se encontraron entre 692 y 1716 pixeles, el núcleo entre 238 y 393 pixeles (ver tabla 1).
Al comparar los valores del citoplasma del eritrocito nucleado No. 4 y 15, se observó que ambos eritrocitos dan como resultado una dimensión fractal de 1.21, debido a que ambos citoplasmas ocuparon los mismos espacios al superponer la rejilla Kp y Kg, sin embargo, los valores de la superficie del citoplasma no son los mismos. Esta misma comparación entre citoplasmas se puede realizar en otro par de eritrocitos como son el eritrocito No. 6 y 14, 16 y 17.
Ahora si la comparación se hace a partir de los valores de la dimensión fractal del citoplasma, se puede observar que los valores de la dimensión fractal de otro par de eritrocitos nucleado como son el eritrocito No. 13 y 19, aunque sean iguales, los cuadros ocupados al superponer las dos rejillas y los valores de su superficie ya no son iguales. Lo anterior muestra que los valores de la dimensión fractal no permiten establecer diferencias entre los diferentes grados de irregularidad de los citoplasmas y núcleos delineados para el estudio, mientras que los espacios ocupados por cada una de estas dos partes del eritrocito y su superficie evaluadas con el método de Box Counting si permiten hacer comparaciones y caracterizar los diferentes grados de irregularidad de los eritrocitos nucleados.
La figura 1, ilustra el proceso de selección de un eritrocito nucleado, la forma como se delineó el contorno del citoplasma y el núcleo. Adicionalmente, se puede observar como el software separó las dos partes del eritrocito para luego ser medidas con el método de Box Counting (ver figura 2). La figura 2 muestra los valores de la rejilla Kp y Kg, así como el valor de la dimensión fractal evaluada con la ecuación 1.
Algunas investigaciones previas en hematología (Rodríguez et al., 2017a, 2018), han revelado que los valores de la dimensión fractal no permiten hacer caracterizaciones morfológicas entre un mismo y diferentes grupos de alteración en la forma del glóbulo rojo. En este estudio se encontró lo mismo, es por esta razón que se afirma que los valores de la dimensión fractal por sí sola no permite hacer caracterizaciones morfológicas entre grupos de eritrocitos nucleados. Estos resultados serán aplicados en una próxima investigación en un grupo mayor eritrocitos nucleados para validar los resultados obtenidos, al igual que se analizarán diferentes eritrocitos con alteraciones morfológicas, para caracterizar su anormalidad y así establecer las nociones de un posible método diagnóstico cuantitativo para los eritrocitos de estas especies.
Otras investigaciones llevadas a cabo mediante la aplicación del método de Box Counting, han logrado evaluar de manera exitosa la irregularidad de diferentes estructuras del cuerpo humano y animal (Rodríguez et al., 2010; Velásquez et al., 2015). Entre ellas se encuentra una investigación que logró establecer un orden matemático a partir de la irregularidad de las arterias coronarias normales hasta re-estenosis, en un modelo experimental de porcino y de esta manera diferenciar las arterias normales de las anormales. Los resultados de esta investigación fueron la base para lograr una inducción matemática con la cual se establecieron todos los posibles prototipos arteriales de normalidad hasta anormalidad (Rodríguez et al., 2010). Continuando con esta línea de investigación, se caracterizó el núcleo y el citoplasma en diferentes células de cuello uterino con el fin de establecer diferencias matemáticas y geométricas entre células normales de las anormales (Velásquez et al., 2015). Estos estudios evidencian los alcances que tiene la aplicación de la geometría fractal, para caracterizar de manera más precisa estados normales y anormales en diferentes estructuras del cuerpo humano y animal.
CONCLUSIONES
Los resultados de este estudio revelan que es posible caracterizar la irregularidad de los eritrocitos nucleados de tilapia roja (Oreochromis spp), a partir de los espacios ocupados por el citoplasma y núcleo al superponer las dos rejillas, así como por el valor de su superficie. Encontrando en cambio, que los valores de la dimensión fractal no permiten caracterizar y hacer comparaciones entre los eritrocitos de esta especie. De acuerdo con lo anterior, la caracterización de los eritrocitos se hizo posible cuando se aplicó las nociones de irregularidad de la geometría fractal y superficie de la geometría euclidiana.