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Introducción
La leche se describe como la secreción mamaria normal de animales bovinos, bufalinos y caprinos sanos, que se obtiene mediante ordeños completos, con destino a consumo en fresco o posterior procesamiento industrial y que no ha sido objeto de adulteración mediante la adición de sustancias no autorizadas para la modificación de sus constituyentes 1.
En términos dietéticos, la leche se caracteriza por ser una alimento que aporta proteínas (caseína, albuminas y globulinas), carbohidratos (lactosa), vitaminas (A, E, D, K, B1, B2, B6, B12 y C), minerales (Ca, P, Na, Mg, Fe, Zn, entre otros) y lípidos (ácidos grasos saturados, mono y poliinsaturados) 2. Así como también péptidos bioactivos y ácidos grasos de configuración trans generados en el rumen, lo cual lo confiere la categoría de alimento funcional por sus beneficios en la salud humana 3,4.
La producción anual de leche fresca en Colombia para el 2016 se estimó en 5,4 millones de toneladas 5, con un crecimiento anual en los últimos años de aproximadamente 1,5 % 6. Esta industria genera aproximadamente 580 000 empleos directos y ha registrado un crecimiento para el PIB de leche sin elaborar de 11 % para el 2017 7, por lo cual Quintero Duque et al. 8 afirman que esta industria es parte fundamental de la seguridad económica familiar en la mayor parte de pequeños ganaderos adscritos a este sistema productivo.
Pese a la importancia de la industria lechera en la economía nacional y mundial, en la actualidad existen varios problemas que amenazan el entorno lechero, entre los cuales se resalta la inocuidad de los alimentos y el impacto de la residualidad de medicamentos y contaminantes químicos en la leche para consumo humano. El reporte global de la Organización Mundial de la Salud (WHO, por sus siglas en inglés) 9) para vigilancia de la resistencia antimicrobiana ha indicado que esta situación es una problemática de salud pública de orden mundial, citando entre las causas posibles el mal uso de antibióticos en la industria pecuaria y su permanencia en la cadena alimenticia. Tang et al. 10, en una revisión sistemática que aborda la necesidad de restringir el uso de antibióticos en la producción pecuaria, hallaron 179 documentos asociados a resistencia de antibióticos, de los cuales 23 hacían referencia a ganado bovino y 21 de ellos evidenciaban la presencia de bacterias resistentes en humanos.
Arenas y Melo 11 han documentado la presencia de 22 casos con patógenos resistentes a antibióticos aislados de fuentes ambientales y enfermedades transmitidas por alimentos en Colombia. En esta revisión se citan 6 referencias directamente relacionadas con la leche o glándula mamaria, en las cuales se indica que se ha evidenciado resistencia a antibióticos como Penicilina, Espiramicina, Tetraciclina, Betalactamicos, Ciprofloxacina, Oxitetracilina, Ampicilina, Tetracilina, entre otros. Por su parte, Máttar et al. 12, al evaluar la presencia de antibióticos en leches pasteurizadas y crudas, han indicado la ausencia de residuos antibióticos en la leche pasteurizada, aunque evidenciaron la presencia de antibióticos 217 en 28 % de las leches crudas evaluadas.
El uso indiscriminado de antibióticos se ha relacionado con mecanismos de resistencia asociados a la selección genética de microorganismos resistentes a determinados antibióticos y la posibilidad que tiene estos de transferir la resistencia, incluso a cepas sensibles, a través de procesos biológicos como transferencia de material genético vía plásmidos, transposones o integrones. Entre los mecanismos específicos de resistencia, se citan la expulsión de antibióticos a través de bombas de flujo, la modificación de blancos terapéuticos o la inactivación de antibióticos 11,13.
Una de las enfermedades que más demanda tratamiento antibiótico en la industria lechera es la mastitis. Esta afección se define como la inflamación de la glándula mamaria, principalmente por causas bacterianas, aunque también se evidencian inflamaciones por causas traumáticas 14. El Staphylococcus aureus se cita como uno de los agentes más importantes en presencia de mastitis infecciosa. La importancia radica en que esta bacteria no es un patógeno exclusivo de la ubre, dado que puede existir en el entorno de la ubre como sala de ordeño, piel, heridas, las manos de los ordeñadores 14 e incluso en el agua usada en la bebida y rutina de ordeño 15, lo que favorece su trasmisión. Adicionalmente, cuenta con diferentes mecanismos de virulencia y de resistencia a antibióticos 16. También se citan como agentes causantes de mastitis los micoorganismos como Streptococcus agalactiae y Actinomyces pyogenes, y las enterobacterias Escherichia coli, Klebsiella spp. y Enterobacter spp. 17.
La creciente problemática de resistencia de microorganismos a antibióticos y su potencial impacto en la salud humana ha demandado la búsqueda de alternativas derivadas de principios activos o aceites esenciales en especies vegetales con capacidades bactericidas, para que sean propuestas como potenciales terapias alternativas al control de la mastitis 18. En este sentido, algunos investigadores han identificado que Tithonia diversifolia (Hemsl.) A. Gray (Asteraceae) posee compuestos fitoquímicos con capacidad de inhibir el crecimiento de bacterias 19-21.
T. diversifolia, también conocida como botón de oro, margaritón, falso girasol o girasol mexicano, se ha descrito como una planta perenne de la familia Astearacea originaria de América Central. La planta puede alcanzar una altura de 2 a 3 m y presenta hojas alternadas y dentadas con tres lóbulos con 6 a 8 cm de diámetro, con presencia de flores a través de todo el año 22,23. En esta especie se han descrito una serie de compuestos fitoquímicos y aceites esenciales, entre los que resaltan diter-penos, flavonoides, derivados de ácidos clorogénicos y lactonas sesquiterpennicas, entre otros, con efectos antiinflamatorio, citotóxicos, antimicrobiales, gastroprotectores, quimiopreventivos y antialergénicos 20,24.
El objetivo del presente trabajo fue evaluar la acción antimicrobiana de extractos alcohólico de hojas, tallos y flores provenientes de Tithonia diversifolia sobre el crecimiento de S. aureus y E. coli bajo condiciones de cultivo in vitro.
Materiales y métodos
El experimento se desarrolló en el Centro de los Recursos Naturales Renovables (CRNR)-La Salada-SENA (Caldas -Antioquia), ubicado en las coordenadas 6°3'38''N y 75°37'54'' W a una altura de 1800 msnm, temperatura promedio anual de 20 °C, precipitación media anual de 2000 mm, descrita como una zona agroecológica de bosque muy húmedo premontano (bmh-PM), según Holdridge 25.
Colecta de material vegetal
La colecta de material vegetal se realizó en un banco forrajero establecido con T. diversifolia, con aproximadamente 5 años de antigüedad. El banco forrajero se estableció con semilla sexual, previa mecanización y adecuación edáfica del terreno. Con un manejo agronómico basado en corte manual cada 90 días. El material cosechado fue sometido a lavado con agua destilada, para retirar impurezas asociadas con el área de cosecha.
Extractos de T. diversifolia
La extracción se realizó por vía alcohólica. Se tomaron por separado 200 g de material correspondiente a hojas, tallos apicales y flores. Cada parte de la planta fue sometido a inmersión en alcohol etílico al 96 % de pureza, por espacio de 24 h. Posteriormente el alcohol fue removido por medio de rotoevaporador a 60°C.
Ensayo de susceptibilidad
Los análisis asociados a la evaluación microbiológica se realizaron en el Laboratorio de Servicios Tecnológicos, adscrito a la estrategia SENNOVA del CRNR La Salada (Caldas, Antioquia). La prueba de susceptibilidad en la inhibición de crecimiento en S. aureus y E, coli como efecto de los extractos obtenidos de hojas más tallos apicales y flores de T. diversifolia se realizó siguiendo los lineamientos de CLSI (26). Para tal fin se procedió al cultivo de S. aureus cepa ATCC 25923 y E. coli cepa ATCC 25922 (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA) en cajas de Petri utilizando el medio de cultivo Baird-Parker. El cultivo se mantuvo a 37°C por espacio de 24 a 48 h para garantizar el crecimiento adecuado del microorganismo. La selección de los microorganismos por evaluar se realizó teniendo en cuenta la prevalencia de estos en la zona y la disponibilidad de la cepa en el laboratorio.
Se utilizaron discos de papel filtro estériles de 6 mm, sumergidos en cada uno de los extractos por espacio de 2 minutos. Los discos se aplicaron en las cajas de Petri inoculadas previamente con el cultivo de S. aureus y E. coli tomando como base el patrón McFarland de 0,5, lo que equivale a una concentración aproximada de 108 UFC/ml, los cuales se incubaron a 35±1 °C por 48 h. La viabilidad de cada extracto fue evaluada midiendo el halo de inhibición en el crecimiento del microorganismo alrededor del disco de papel. Esta medición se realizó a las 24 y 48 h posinoculación de los discos de papel, mediante un calibrador digital. Se consideró una inhibición efectiva en el crecimiento con un halo (HI) mayor a 6 mm.
Dentro del experimento se utilizó como control positivo el antibiótico Cloxacillin (5 µg) para S. aureus y Ceftiofur (30µg) para E. coli descrito como eficiente en el control de cepas ATCC.
Diseño experimental y análisis de la información
Los datos se colectaron bajo un diseño de bloques completos al azar. Se consideró como bloqueo la repetición completa del experimento para cada una de las bacterias llevadas a cabo en tres días no consecutivos. La prueba de sensibilidad para cada bacteria se desarrolló bajo un experimento factorial en diseño de bloques completos al azar en un modelo mixto, que consideró los efectos fijos de extractos (tallos-hojas, flores y control positivo), la hora de evaluación (24 y 48 h) y la interacción de estos dos factores y como efectos aleatorios el bloque y el error experimental asociado al modelo. Los datos se analizaron empleando la función lmer del paquete lme427 en el software estadístico R-Project (Team R, 2018). El rechazo de la hipótesis nula se fijó con un p valor de 0,05. En caso de diferencias, en los factores se empleó el test de Tukey.
Resultados y discusión
El análisis de varianza indicó efecto significativo (p<0,05) del extracto en la inhibición del crecimiento de S. aureus y E. coli. En los dos experimentos, el antibiótico evidenció un HI superior a 30 mm, con diferencia significativa comparado con los extractos obtenidos de hojas-tallos y flores en de T. diversifolia. En el caso de S. aureus, los extractos de T. diversifolia no presentaron diferencias significativas, con una media de HI que osciló entre 9,7 y 10,49 mm. Contrario a esto, en E. coli el HI observado en el extracto obtenido a partir de flores presentó 3,25 mm por encima (p<0,05) del observado en el extracto obtenido de tallo-hojas (tabla 1).
Tabla 1 Halos de inhibición (mm) para S. aureus y E. coli sometidas a extractos alcohólicos de hojas-tallos y flores de T. diversifolia y de un antibiótico comercial
* Para S. aureus el halo en el antibiótico corresponde a Cloxacillin y para E. coli a Ceftiofur. RCME expresa la raíz del cuadrado medio del error. Las letras en la columna indica diferencias significativas según test de Tukey.
Fuente: elaboración propia.
Los resultados obtenidos en los HI de extractos a partir de hojas-tallos y flores de T. diversifolia, distaron significativamente del control positivo. Sin embargo, en ambos experimentos se observaron HI superiores a 6 mm y en el caso específico del extracto de flores en S. aureus, superior a 10 mm, el cual ha sido especificado como límite para indicar una actividad parcial (entre 10 y 13 mm) contra el crecimiento de bacterias 28. La reducción en el crecimiento bacteriano asociada a T. diversifolia puede estar relacionada con metabolitos secundarios, entre los cuales se han citado hasta 160 compuestos, con mayor representación de mo-noterpenos (46 %), sesquiterpenos (24,4 %), aldehídos (5,3 %), alcanos (3,4 %), ácidos grasos (3,1 %) entre otros 20, así como también a la presencia de taninos, saponinas y flavonoides 29,30.
Los mecanismos bactericidas citados para los compuestos que pueden encontrarse en T. diversifolia se relacionan con alteración y daño del ADN para compuestos como alcaloides cuaternarios, daño en membranas celulares y pérdida de contenido celular para esteroles, inhibición en la síntesis de ADN y alteración en los mecanismos de transporte en membranas celulares para flavonoides, interacción y daño con compuestos esteroles de membranas celulares para saponinas, inhibición de enzimas extra-celulares y secuestro de sustratos para taninos 31 y reducción inducida de lipopolisacáridos para compuestos como taginitina C, F y A 30.
Para la inhibición en el crecimiento de S. aureus se ha reportado el uso de T. diversfolia con extractos acuosos HI de 6 mm 19, aceites esenciales con HI de 14 mm 20, extractos metanólicos y cloro-fórmicos con HI de 12 y 20 mm, respectivamente 21, metanólicos con un HI de 16 mm 32 y etanólico y acuoso para flores y tallos con HI de 20, 22, 18 y 19 mm, respectivamente 33. En relación con E. coli, los mismos autores han reportado 0 mm en HI para extracto acuoso, 9 mm de HI para aceite esencial, 0 mm de HI para extractos metanólicos y clorofórmicos, 9 mm para extracto metanólico y 11, 12, 16 y 14 mm para extractos etanólicos y acuosos en flores y tallos, respectivamente.
Las causas asociadas al bajo HI reportadas en el presente estudio pueden estar relacionadas con la concentración mínima inhibitoria (MIC) en los extractos, la cual ha sido reportada desde concentraciones bajas entre 1,56 a 2 mg/ml con respuestas en HI de 6 a 14 mm 19,20, hasta concentraciones entre 3,13 y 10 mg/ml con HI que oscilan entre 11 y 22 mm 21,33. En el presente trabajo no se determinó la MIC, pero se supone baja con base en las respuestas en HI y los resultados antes descritos. Otro factores que pudo influir en baja respuesta obtenida en la presente investigación, se asocia a las naturaleza química de los extractos y su relación con las características físico-químicas de los medios de cultivo, en los cuales se han descrito aspectos como la temperatura, el grosor y porosidad que facilitan o limitan el efectos de difusión de los principios activos 34.
Conclusiones
Los extractos obtenidos de T. diversifolia, principalmente el extraído a partir de flores, se pueden perfilar como potenciales controladores del crecimiento en bacterias como S. aureus y E. coli. Los resultados demuestran que se hace necesario explorar otros solventes para extracción como etanol y agua, con la consideración de evaluar la concentración mínima inhibitoria, a fin de obtener un valor objetivo de la efectividad delos extractos.
