1. Introducción
En la actualidad, los cuerpos de agua superficiales, en su gran mayoría, presentan una alteración en su calidad a causa de los vertimientos domésticos e industriales, que influyen en la salud humana y en los aspectos socioeconómicos de las poblaciones aledañas (Rodríguez, Serna & Sánchez, 2016). Se estima que anualmente en Colombia se vierten 117.000 toneladas de nitrógeno total y 29.400 toneladas de fósforo a los sistemas hídricos, situación que afecta negativamente la riqueza hídrica del país (MADS, 2016). Surge así la necesidad de idear diferentes estrategias para abordar los desafíos de la calidad del agua en las distintas regiones. En este sentido, la biorremediación es una estrategia eficaz para tratar los altos niveles de nutrientes de las aguas contaminadas, la cual es de un bajo costo con respecto a otras tecnologías que se utilizan para tratar aguas residuales (Rawat, Ranjith, Mutanda & Bux, 2011).
La biorremediación se fundamenta en la capacidad natural que poseen determinados microorganismos para incorporar contaminantes en sus procesos metabólicos y usarlos como fuente de energía o carbono (Dzionek, Wojcieszyńska & Guzik, 2016; Mosa, Saadoun, Kumar, Helmy & Dhankher, 2016). Dentro de los microorganismos utilizados en los tratamientos de biorremediación se encuentran las microalgas, las cuales han sido universalmente conocidas como una alternativa eficaz de tratamiento para la remoción de nutrientes como el nitrógeno y fósforo (Bermeo, 2011).
Las microalgas también se emplean para la eliminación de sustancias tóxicas, como: pesticidas, herbicidas y metales pesados, entre otros; esto gracias a su capacidad de acumular importantes concentraciones de compuestos tóxicos, sin afectar su actividad biológica. Otro beneficio de las microalgas es su tendencia de liberar O2 por medio de la fotosíntesis, degradando los compuestos orgánicos y generando una acumulación de biomasa, la cual puede ser reutilizada en sistemas de producción de biocombustibles y/o en procesos de avicultura, acuicultura o agricultura (Mehrabadi, Craggs & Farid, 2015).
La laguna de Ubaque es un cuerpo de agua natural ubicado en el municipio de Ubaque, Cundinamarca, localizada a 4°29’59.25’’ N y 73°56’89’’ W y 2017 m.s.n.m. Según la clasificación Caldas-Lang, esta laguna es una zona fría-húmeda y presenta una humedad relativa del 80%, representando uno de los principales cuerpos de agua del municipio de Ubaque, por su importancia ecológica, cultural y económica (Carmona & Cruz, 2014). De acuerdo con la investigación de Castellanos y Charry (2016), la laguna presenta diversas problemáticas ambientales, como: eutrofización, la colmatación por sedimentos, la presencia de olores fétidos, la pérdida de espejo de agua y el cambio de color, debido a la proliferación de macrófitas como la Elodea (Elodea canadensis) y la Flor de Loto (Nelumbo lutea) a causa de las cantidades altas de nutrientes como fosfatos y nitratos provenientes de vertimientos de aguas residuales de los predios aledaños y el inadecuado manejo de los residuos por parte de los turistas.
A pesar de la situación identificada en la laguna, actualmente no se encuentran estudios que proporcionen alternativas de solución a la contaminación ni para la preservación de dicho ecosistema. En este sentido, la presente investigación tiene como objetivo disminuir los niveles de contaminación por NO3 -, NO2 - y PO4-3 en el agua de la laguna de Ubaque, mediante el proceso de biorremediación con cepas de microalgas Spirulina máxima (Sm), Spirulina platensis (Sp) y Chlorella vulgaris (Cv), a nivel de laboratorio.
2. Materiales y métodos
La figura 1 muestra la relación entre las etapas llevadas a cabo para el desarrollo de la investigación. La primera etapa consistió en la caracterización del agua con el fin de obtener el nivel de nutrientes, posteriormente se llevó a cabo el cultivo y adaptación de las microalgas a las condiciones de la laguna para finalmente realizar el montaje del diseño experimental con las cepas adaptadas; así, se pudo evaluar la eficacia de las tres cepas de microalgas como biorremediadoras en la laguna de Ubaque.
El diseño experimental utilizado en la investigación fue de tipo factorial. Estos diseños son los más eficientes para estudiar el efecto producido por dos o más factores sobre una función respuesta (Ilzarbe, Tanco, Viles & Álvarez, 2007), pues no solo permiten conocer el efecto individual de cada factor sino también el efecto conjunto de los mismos (Ávila, 2006). Por su potencia y sencillez, el diseño factorial posee un campo de aplicación muy amplio (Medina & López, 2011), como consecuencia, varios estudios similares al presente como los de Álvarez (2014) y Bolaños y Martínez (2016), lo han preferido para el desarrollo de sus investigaciones.
2.1 Caracterización del agua
Con el fin de cuantificar los nutrientes de la laguna, se tomó una muestra integrada, la cual se obtiene a partir de la mezcla de muestras puntuales tomadas de diferentes puntos simultáneamente (IDEAM, 2017). Los puntos de muestreo se visualizan en la figura 2. El agua captada se mantuvo a 4°C, en frasco de vidrio ámbar, de acuerdo a lo establecido en la guía PT0093 del IDEAM (2018), donde se establecen los parámetros para la toma y preservación de la muestra.
Las muestras fueron analizadas en el Laboratorio de la Universidad Libre, Bogotá D.C.; se les determinaron los parámetros NO3 -, NO2 - y PO4-3 de acuerdo a los métodos estándar establecidos por el IDEAM (2018), indicados en la tabla 1.
2.2 Cultivo y adaptación de las microalgas
La siguiente etapa del proceso abarca el cultivo y mantenimiento de las microalgas. Los géneros fueron seleccionados por su capacidad de adaptación, generación de biomasa aprovechable y resistencia (Rodríguez et al., 2017; Weizhi, Yating, Yizhan & Haixia, 2017; Forero, Montenegro, Pinilla & Melgarejo, 2015; Cartagena & Malo, 2017). Las cepas fueron cultivadas a nivel de laboratorio, en tres fotobiorreactores abiertos de 10 litros. La tabla 2 muestra las condiciones de cultivo, establecidas con base en las recomendaciones de proyecto Malgas (2013).
Las cepas cultivadas fueron sometidas a un proceso de adaptación durante una semana. Los parámetros controlados se indican en la tabla 3, los cuales fueron obtenidos de la caracterización de la laguna realizada por Castellanos y Charry (2016). Durante todo el proceso se realizó el seguimiento a las concentraciones celulares, determinadas mediante el conteo con la cámara Sedgewick Rafter para la cepa Spirulina y la cámara de Neubauer para la Chlorella vulgaris.
2.3 Diseño experimental
El diseño experimental, tabla 4, fue realizado con el programa Design-Expert, versión 6.0.8 portable. Se utilizó un diseño experimental Compuesto Central Factorial 22 con 5 repeticiones del punto central y 4 puntos axiales; los puntos centrales se replican para proporcionar una excelente capacidad de predicción cerca del centro del espacio factorial (Desing Expert, 2018); los factores que se manejaron fueron tiempo de retención (días) y concentración de la cepa (V/V).
Transcurrido el tiempo de adaptación, cada cepa se cultivó de acuerdo a las especificaciones del diseño experimental; tanto para la fase de adaptación como para el montaje de las pruebas se realizaron tres réplicas. La concentración del inóculo inicial de cada especie fue de 0.5 x 106 células / mL, determinada por conteo celular.
3. Resultados y discusión
3.1 Concentración de nutrientes
En la tabla 5 se presentan las concentraciones de nutrientes encontrados en el agua de la laguna de Ubaque en ppm (mg nutriente /litro de agua).
De acuerdo con la Universidad Tecnológica de Panamá (2006) en aguas superficiales bien oxigenadas, el nivel de nitrito no suele superar 0.1 mg/l, valores entre 0.1 a 0.9 pueden presentar problemas de toxicidad; asimismo, los valores por encima de 1.0 mg/l son totalmente tóxicos y representan un impedimento en el desarrollo de la vida piscícola y el establecimiento de un ecosistema fluvial en buenas condiciones. La concentración de Nitritos obtenida en este caso fue de 0.8 mg/l, el cual está en el rango de toxicidad para ecosistemas acuáticos.
Así mismo, en los trabajos de Moreta (2008) y Pozo (2011), se concluye que nitrógeno y fósforo son en conjunto las causas principales de eutrofización. Las concentraciones elevadas de nitrógeno pueden promover el desarrollo, mantenimiento y proliferación de los productores primarios (fitoplancton, algas bentónicas, macrófitos), contribuyendo al muy extendido fenómeno de la eutrofización cultural de los ecosistemas acuáticos. En la tabla 5 se evidencia que los nutrientes se encuentran en valores considerablemente altos para un cuerpo de agua lentico, como lo es la laguna bajo estudio. Esto ha generado el crecimiento de macrófitas, como la Elodea (Elodea canadensis) y Flor de Loto (Nelumbo nucifera), plantas indicadoras de eutrofización (Zehnsdorf, Hussner, Eismann, Ronicke & Melzer, 2015; Carbiener, Trémolieres, Mercier & Ortscheit, 1990).
3.2 Adaptación de las microalgas
La figura 3 muestra los resultados del proceso de adaptación para las tres cepas. El conteo celular diario permitió obtener la gráfica de la cinética de crecimiento.
Los resultados demuestran que la cepa Chlorella vulgaris presenta una cinética de crecimiento mayor a la registrada por la Spirulina; este comportamiento puede deberse a la gran adaptabilidad que tiene la Cv a las condiciones de la laguna por ser un alga nativa de Colombia. Lo anterior se diferencia del género Spirulina, cuyo crecimiento presentó limitaciones en la fase de adaptación; esto se atribuye a las características de su lugar de origen, el Lago Chad, África, donde la temperatura promedio es de 37° C, la cual es superior a los 20,5 ° C presentes en la laguna de Ubaque.
En cuanto a la Chlorella vulgaris, los resultados se asemejan a los de Bolaños y Martínez (2016), en los cuales se obtuvo un rápido crecimiento exponencial de la cepa Cv hacia los primeros 5 días del experimento, en presencia de un medio enriquecido con nitrógeno.
En las tres réplicas llevadas a cabo del periodo de adaptación, el comportamiento del crecimiento de las tres cepas no varió de manera significativa, manteniendo siempre la misma tendencia presentada en la figura 3.
3.3 Remoción de nutrientes
Remoción de nitratos
La figura 4 muestra el comportamiento de las tres cepas al remover Nitratos; como se observa, la Cv presenta una mayor afinidad con este nutriente.
Con la cepa Cv se obtuvo un porcentaje de remoción máximo del 88.24%, alcanzado en el cuarto día del tratamiento; a partir de este momento los valores de remoción no aumentaron significativamente, lo que permite inferir que la biorremediación en la laguna con la cepa Cv no requiere un tiempo de retención mayor a cuatro días. En el caso de las Spirulina se reportaron valores máximos de remoción de 85.9% para la cepa Sm, y 64% para la cepa Sp, porcentajes que fueron alcanzados a un tiempo de cinco días. Las diferencias en los tiempos de retención entre las tres cepas permiten deducir que la Cv no solo es la más eficaz para remover nitratos, sino que también es la más eficiente por remover a tiempos de retención menores.
Remoción de nitritos
En la figura 5 se observan las superficies de respuesta de remoción de nitritos para cada cepa; al igual que con los nitratos, la Cv mostró el mejor comportamiento como biorremediadora.
El mejor porcentaje de remoción de nitritos se obtuvo con la Cv, con la cual se alcanzó una remoción de 87.2%, a diferencia de las cepas Spirulina las cuales no lograron superar el 82%; en las tres cepas la máxima remoción se alcanzó al final del experimento. Como se observa en las tres curvas de la figura 5, la remoción no varía de manera significativa en el tiempo cuando se aplica una baja concentración de cepa; esto demuestra que gráficamente el factor concentración es más influyente en la remoción de nitritos que el factor tiempo.
Remoción de fosfatos
El comportamiento de las cepas para la remoción de fosfatos se evidencia en la figura 6; para este nutriente, con las cepas Cv y Sm se obtuvieron porcentajes óptimos de remoción.
Los valores de remoción alcanzados por las cepas Cv y Sm superan el 90%, demostrando ser eficaces biorremediadoras de fosfatos. Por otro lado, la cepa Sp logró una remoción de 84%, a pesar de ser un porcentaje alto y significativo no es la mejor opción para remover fosfatos en la laguna.
En las tres curvas de remoción de fosfatos de la figura 6, así como en las superficies de respuesta de nitratos y nitritos, se observa una marcada relación entre los dos factores evaluados, obteniéndose las condiciones más óptimas a tiempos de retención mayores y concentraciones altas.
El comportamiento de la Cv frente a cada uno de los nutrientes se asemeja al reportado por Ramos y Pizarro (2018). Los resultados pueden deberse a la capacidad que posee esta microalga para soportar altas concentraciones de nutrientes contenidos en aguas eutrofizadas; además, su metabolismo es muy activo y resistente a cambios ambientales (Blanch, Cárdenas, Durnin, Herrera & Ortiz, 2017).
En cuanto a las cepas del género Spirulina, aun cuando presentaron inhibición del crecimiento, produjeron cambios adaptativos suficientes para remover los nutrientes en el agua. Sin embargo, los porcentajes de remoción fueron inferiores en comparación con la cepa Cv, lo cual puede deberse a diversos factores, como el nivel de estrés que tuvieron que soportar frente a la concentración alta de nutrientes; así mismo, teniendo en cuenta su lugar de origen, la intensidad luminosa pudo no ser suficiente para que el metabolismo lograra una absorción de nutrientes adecuada. Otro factor que pudo interferir en la remoción de nutrientes es el consorcio microbiano presente en la laguna, pues la relación microalga-bacterias involucra competencia y depredación (Colorado & Moreno, 2017; Ramos & Pizarro, 2018), elementos que pueden llegar a obstaculizar la asimilación de nutrientes.
3.4 ANOVA
Aunque los efectos de los factores tiempo y concentración aparentan ser importantes en su representación gráfica, esto no implica que el efecto correspondiente sea estadísticamente significativo sobre las variables de respuesta. Para afirmar que tales efectos contribuyen a explicar el comportamiento de la respuesta, se debe hacer la prueba estadística del análisis de varianza (Gutiérrez & De la Vara, 2012). Si el “Valor-p” es menor que el nivel de significancia prefijado, 0.05, se concluye que el efecto correspondiente del factor está activo o influye de manera significativa sobre la respuesta; además, mientras más pequeño sea el valor-p de un factor, este último es más importante (Gutiérrez & De la Vara, 2012).
Los resultados del ANOBA se muestran en la tabla 6. En el caso de la Cv se obtuvo un resultado inferior a 0.05 para todos los “Valor-p”; de este modo, se acepta que sí hay efecto significativo de t, C y la combinación tC sobre las respuestas de remoción. Las cepas Sm y Sp no registraron significancia estadística en todos los resultados, lo que se evidencia en los valores de las combinaciones tC de fosfatos, para Sp, y nitratos y fosfatos para Sm; con lo anterior se determina que dichas combinaciones no tienen un efecto significativo sobre la remoción de nutrientes, lo que permite descartar a la cepa Sp como biorremediadora de fosfatos. Igualmente, la Sm tampoco resulta una opción adecuada para remover nitratos y fosfatos en la laguna.
En las tres cepas, los “Valor-p” de magnitud tan pequeña muestran que la significancia es contundente y que prácticamente no se corre ningún riesgo en aceptarla. La cepa Cv fue la que demostró la mejor significancia estadística sobre la remoción de nutrientes.
Al igual que el “Valor-p”, el “Valor Fo” permite determinar la importancia de un determinado factor sobre las respuestas del diseño, entre más alto sea el valor, el efecto e importancia del factor será mayor (Gutiérrez & De la Vara, 2012). Para las cepas Cv y Sm el factor más influyente fue la concentración; por el contrario, para la Sp el tiempo de retención resultó más importante; lo anterior se tuvo en cuenta para la optimización numérica de cada cepa.
3.5 Optimización numérica
La tabla 7 muestra la optimización numérica producto del diseño experimental en Design Expert; en ella se evidencian las alternativas con las cuales es posible obtener resultados de remoción significativos para todos los nutrientes. En la obtención de dichas alternativas no solo se consideró la eficacia, sino también la eficiencia en términos de tiempo retención y concentración, con el fin de optimizar costos de implementación.
4. Conclusiones
La biorremediación con microalgas es una alternativa efectiva para remover los nutrientes, NO3 -, NO2 - y PO4 -3 de la laguna de Ubaque; la cepa más apta para la aplicación del proyecto es la Chlorella vulgaris, la cual demostró una mayor capacidad de adaptación a las condiciones de la laguna y presentó una remoción superior de los nutrientes. Se recomienda que en el proceso de biorremediación, la cepa Cv sea cultivada a una concentración V/V de 12.89% en un tiempo de retención de 3.13 días, con el fin de obtener resultados de remoción eficientes y eficaces.
Como consecuencia de la presente investigación, se sugiere la realización de posteriores estudios enfocados a llevar éste experimento conceptual a lo aplicado. En este sentido, se recomienda la construcción de un sistema de cultivo abierto en el cual la microalga pueda estar expuesta a las condiciones de la laguna, para lograr su adaptación antes de ser utilizada en la remoción de nutrientes.
La interacción microalga/bacteria en la laguna de Ubaque no fue evaluada en el presente estudio, pero teniendo en cuenta que pudo ser un factor determinante en la asimilación de nutrientes, se sugiere su estudio en investigaciones futuras.