Introducción
Covid-19 es una enfermedad infecciosa resultado de la infección por el SARS-CoV-2, un coronavirus responsable del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-Cov-2 por sus siglas en inglés Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2), reportada por primera vez en diciembre de 2019 en la ciudad de Wuhan en China1 y rápidamente propagada a través del mundo, decretándose en marzo 11 del 2020 la declaración de pandemia por parte de la Organización Mundial de la Salud2. A 27 de Julio de 2020 el mundo registra oficialmente 16.296.635 casos y 649.662 muertes según el observatorio de información sobre la infección por SARS-CoV-2 de la Universidad Johns Hopkins, reportándose para Colombia 248.976 casos y 8.525 muertes asociadas a la enfermedad3.
Esta enfermedad puede cursar con un amplio espectro de manifestaciones clínicas, las cuales pueden ir desde malestar general, astenia, adinamia, fiebre, tos, mialgias, ofinofagia, cefalea, hasta neumonía, síndrome respiratorio severo agudo y falla multiorgánica4. Igualmente se ha observado que un alto porcentaje de los individuos infectados pueden cursar la infección sin presentación de síntomas clínicos evidentes5.
El curso y desenlace de la enfermedad se ha asociado a una desregulación y excesiva respuesta inmune por parte del hospedero infectado6-8. Así las cosas, se ha evidenciado en pa cientes infectados con SARS-CoV-2 una concentración fluc tuante y dependiente de acuerdo a la condición de cada indi viduo de los niveles de citoquinas y quimioquinas proinflama torias como Interleuquina (IL)-1, IL-6, IL-8, IL-17, IL-17, Factor de Necrosis Tumoral (TNF por sus siglas en ingles Tumor Necrosis Factor), Factor Estimulante de Colonias de Granulo citos (G-CSF por sus siglas en ingles de Granulocyte Colony- Stimulating factor), Proteína Inducida por Interferón Gamma de 10 kDa (IP-10 o CXCL10 por sus siglas en inglés Interferón Gamma-Induced Protein 10), Proteína Quimioatrayennte de Monocitos (MCP-1 por sus siglas en inglés (Monocyte Che moattractant Protein) y Proteína Inflamatoria del Macrófago (MIP por sus siglas en ingles de macrophage inflammatory protein). Particularmente, se ha asociado de manera directa mente proporcional un incremento en la producción de IL-6 con un empeoramiento de la condición de los pacientes4,9.
Estudios in vitro demuestran un retardo en la fase temprana en la liberación de citoquinas y quimioquinas en células epitelia les, células dendríticas y macrófagos infectados con SARS-CoV, seguido de una baja secreción de Interferones (IFN) y una ele vada producción de IL-1, IL-6, TNF y diversas quimioquinas8.
Hallazgos similares se han evidenciado en pacientes con el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS por sus si glas en ingles de Middle East respiratory síndrome), infección ocasionada por el coronavirus MERS-CoV9, Se ha identificado patrones diferentes en los niveles serológicos de citoquinas en individuos infectados con cuadros severos de la enferme dad al compararse con aquellos que presentaron manifesta ciones leves o moderadas9. Choe y cols en 2016 evidenciaron niveles de IL-6 e IP-10 aumentados de manera significativa en individuos con infección severa de la enfermedad, mien tras no se observaron niveles detectables de IFN-a10.
Las evidencias a la fecha recolectadas soportan la hipótesis de complicaciones generadas por la tormenta de citoquinas, la cual se asocia como el factor desencadenante de la presentación del Síndrome de Dificultad Respiratoria Aguda (ARDS por sus siglas en ingles de Acute Respiratory Distress Syndrome) y de las fallas multiorgánicas extrapulmonares asociadas a esta patología, eventos críticos en la exacerbación de las manifestaciones clínicas e incluso la muerte, ocasionados por el daño celular, epitelial, vascular y alveolar generado por la liberación de citoquinas proinflamatorias11. Sin embargo, es importante conocer si la diferencia en las manifestaciones clínica observadas en pacientes colombianos con COVID-19 se asocia a perfiles de citoquinas diferentes que puedan explicar o predecir los desenlaces clínicos.
Por esto, en el presente estudio evaluamos las diferencias en los niveles séricos de citoquinas pro y antinflamatorias de pacientes asintomáticos y sintomáticos con y sin complica ciones colombianos infectados con SARS-CoV-2.
Materiales y métodos
Población y muestras de suero
32 muestras de suero fueron recolectadas a partir de la toma de muestra de sangre periférica de mujeres y hombres mayores de edad (entre 22 y 84 años de edad) quienes fueron categorizados en 4 grupos clínicos correspondientes a: (A) individuos asintomáticos con resultado positivo de la prueba de SARS-CoV-2 por RT-PCR (n=8); (SD) individuos sintomáticos hospitalizados en casa bajo seguimiento y monitoreo clínico con resultado positivo de la prueba de SARS-CoV-2 por RT-PCR (n=8); (SH) individuos hospitalizados en sala general o en unidad de cuidados intensivos (UCI) en la Clínica Universitaria Colombia, Colsanitasen la ciudad de Bogotá D.C con resultado positivo de la prueba de SARS-CoV-2 por RT-PCR (n=8); (N) individuos con síntomas respiratorios y resultados de la prueba de SARS-CoV-2 por RT-PCR negativos (n=8)12.
Determinación de anticuerpos IgM, IgG e IgA
La determinación de la presencia y niveles de anticuerpos contra el SARS-CoV-2 se reportó en el artículo publicado por Delgado y cols12. Brevemente, los isotipos de las inmunoglobulinas IgM, IgG e IgA frente a SARS-CoV-2 fueron determinadas mediante el uso del kit ELISA NovaTec® de Quimiolab (ciudad, País), siguiendo las instrucciones del fabricante. Los resultados se expresaron a través de Unidades Arbitrarias de Inmunoglobulinas (UAI).
Cuantificación de citoquinas pro y antinflamatorias
50 μL de los sueros recolectados fueron incubados durante 3 horas a temperatura ambiente y protegidas de la luz con una mezcla de 50 μL de las perlas de captura de las citoquinas IFN-g, TNF, IL-10, IL-6, IL-4 e IL-2 (resuspendidas en el reactivo Serum Enhancement Buffer (SEB)), y 50 μL del reactivo de detección de PE, siguiendo las instrucciones del fabricante (Becton Dickinson Biosciences, Pharmingen™ - San José, CA, USA). Paralelamente, el mismo protocolo experimental fue llevado a cabo para el montaje de la curva de calibración (0, 20, 40, 80, 156, 312.5, 625, 1250, 2500 y 5000) pg/mL para cada una de las citoquinas.
Posteriormente, las mezclas fueron lavadas mediante centrifugación con el fin de remover el exceso de anticuerpo de detección no unido, y resuspendidas en Wash Buffer, para su posterior lectura utilizando el citómetro de flujo FacsCanto II de Becton Dickinson (BD Biosciences - San Diego, CA, USA) con los canales de detección FL2 (para la determinación de la concentración) y FL3 (para la diferenciación de la citoquina evaluar). Los programas FACSDiva TM (BD Biosciences - San Diego, CA, USA) y FCAP Array TM (Soft Flow Hungary Ltd - Pecs, Hungría) fueron utilizados para los procesos de adquisición y análisis, respectivamente.
Análisis
La concentración de cada una de las citoquinas es reportada en pg/mL a través de la aplicación de una ecuación de regresión logística de 5 parámetros utilizando el software FCAP Array TM (Soft Flow Hungary Ltd - Pecs, Hungría).
Las comparaciones entre los niveles de producción de citoquinas por grupos se realizaron mediante la aplicación de la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis, y la comparación entre grupos y generó se realizó a través de la prueba no paramétrica no pareada Mann-Whitney. Las pruebas de correlación se realizaron mediante la aplicación de la prueba de Spearman teniendo en cuenta únicamente las muestras de los grupos A, SD y SH. Para todos los casos la significancia estadística se definió por un valor de significancia (p. value) menor a 0.05 (p.value < 0.05). Todos los análisis fueron realizados mediante el uso el software estadístico GraphPad Prism 6.01 (demo) (Graph Pad Software Inc, Estados Unidos).
Resultados
Diferencias en los niveles de producción de citoquinas pro y antiinflamatorias en individuos hospitalizados por SARS-CoV-2
Derivado de los análisis de cuantificación de las citoquinas IFNg, TNF, IL-10, IL-6, IL-4 e IL-2 a través de citometría de flujo en muestras de sueros de individuos por prueba de RT-PCR positiva para la detección del virus SARS-CoV-2 (grupos A, SD, SH) y de individuos con prueba negativa de RT-PCR para SARSCoV- 2 pero con síntomas para otra afección respiratoria (grupo N), se evidenció una tendencia generalizada a la disminució en la concentración de citoquinas proinflamatorias (tales como IFN-g, TNF e IL-2) y en una citoquina de perfil antiinflamatoria (IL-4), así como un aumento diferencial en los niveles de la IL-6 (una citoquina con propiedades pro y antiinflamatorias) en el grupo de pacientes pertenecientes al grupo SH.
En línea con lo anterior, se destaca una disminución significativamente estadística en la producción de las citoquinas IFNg (p. value <0.05), TNF (p. value <0.01), IL-2 (p. value <0.01) e IL-4 (p. value <0.01) al comparar la concentración sérica detectada en los grupos clínicos N (↑) y SH (↓), así como un aumento con significancia estadística para la producción de IL-6 (p. value <0.001) al comparar los niveles entre los grupos SD (↓) y SH (↑) (Figura 1).
Adicionalmente, al realizar la evaluación y análisis entre los niveles de producción de citoquinas de acuerdo con el género en los distintos grupos clínicos definidos en el presente estudio, se evidenciaron diferencias significativas al comparar la producción de IL-2 en los individuos pertenecientes al grupo A, siendo significativamente mayor el nivel cuantificado en las mujeres comparado con los hombres (p. value 0.0286) (Figura 2).
La gráfica muestra la concentración en pg/mL de la IL-2 diferenciada por género y grupo clínico. Se muestran los resultados a través de la media y el error estándar de la media para cada uno de los casos. N: corresponde al grupo de individuos negativos; A: al grupo de asintomáticos; SD: al grupo de sintomáticos con seguimiento en domicilio; SH: al grupo de sintomáticos hospitalizados. Las columnas sin relleno corresponden a la producción de citoquinas en mujeres y las columnas con relleno a la producción en hombres. Las barras horizontales reflejan los grupos con diferencias significativas (p. value < 0.05)
Niveles de producción de anticuerpos en individuos con infección por SARS-CoV-2
Con respecto al análisis de determinación de la presencia de los isotipos de inmunoglobulinas tipo IgM, IgG e IgA, a nivel general se evidencia un incremento en los niveles séricos de los diferentes isotipos de Ig en la medida en la que se presenta un mayor grado de severidad en el curso de la enfermedad, siendo menor los niveles en los individuos pertenecientes al grupo A, seguido por un ligero aumento (sinsignificancia estadística) en los individuos del grupo SD, y au mento más marcado en los individuos del grupo SH (con sig nificancia estadística para el caso de la IgG al compararse con los grupos A (p. value < 0.01) y SD (p. value < 0.05), y de la IgA al compararse con el grupo A (p. value < 0.01) (Figura 3).
La gráfica muestra la concentración en UAI (Unidades Arbitrarias de Inmunoglobulina). Se muestran los resultados a través de la media y el error estándar de la media para cada uno de los casos. N: corresponde al grupo de individuos negativos; A: al grupo de asintomáticos; SD: al grupo de sintomáticos; SH: al grupo de sintomáticos hospitalizados en sala general o UCI. Las barras horizontales reflejan los grupos con diferencias significativas (p. value < 0.05).
Correlación en los niveles de citoquinas y producción de anticuerpos
A nivel del análisis de correlación sobre los niveles de producción de las citoquinas, se identificaron tendencias correlación positiva (r > 0.7 con significancia estadística) entre los niveles de producción de citoquinas tales como TNF con IL-2 (r=0.8434), IL-4 con IL-2 (r=0.8372), IL-4 con TNF (r=0.7970) e IL-6 con IL-10 (r=0.7424) (Figura 4A).
Un fenómeno similar se evidenció en el análisis de correlación de la concentración de cada una de las citoquinas detectadas en el presente estudio con los niveles de los diferentes isotipos de anticuerpos, observándose correlaciones positivas con significancia estadística para el caso de las citoquinas IL-10 e IL-6 con los niveles de IgM (r=0.6400 y r=0.5126, res pectivamente), IgG (r=0.5509 y r=0.4320, respectivamente) e IgA (r=0.6416 y r=0.5525, respectivamente) (Figura 4B).
Discusión
En el presente estudio, analizamos los perfiles de citoquinas y de isotipos de inmunoglobulinas predominantes inducidos frente a la infección por SARS-CoV-2, y su asociación con la severidad de la enfermedad, teniendo en cuenta la importancia que juega el sistema inmune en el control y desenlace de la enfermedad. Los resultados aquí obtenidos permiten dar cuenta de una relación de la respuesta inmune efectora desarrollada con el curso severo de la patología, evidenciándose una disminución generalizada de citoquinas propias del perfil activador de células Th1 en el grupo de individuos con mayor grado de afectación en su estado de salud (es decir, el grupo SH, de personas sintomáticas hospitalizadas) al compararse con los otros (A y SD), así como un aumento en la producción de citoquinas antiinflamatorias (como por ejemplo IL-10) o de una citoquina con un rol dual en el montaje de la respuesta inmune (como lo es la IL-6) en el mismo grupo clínico.
Con los hallazgos arrojados en el presente estudio, se encuentran en concordancia con lo referido por diversos autores acerca de la implicación de la respuesta inmune en la fisiopatología de la enfermedad, resaltándose en particular la bajo-regulación de citoquinas tipo IFN (las cuales juegan un papel esencial en el desarrollo de una respuesta antiviral efectiva, activando diversas subpoblaciones celulares esenciales en el control del virus) y la sobre regulación de citoquinas como la IL-6. (una potente citoquina con propiedades pro y anti-inflamatorias).
Así las cosas, existen reportes que exponen la capacidad de virus de la familia coronavirus de evadir y suprimir la respuesta asociada a la activación celular mediada por IFN, a través diferentes mecanismos, entre los que se destacan alteraciones en las vías se señalización intracelular y las funciones de liberación 13. Un ejemplo de lo anterior fue lo reportado por Blanco-Melo y cols en 2020, quienes demostraron la produc ción elevada de citoquinas y quimioquinas proinflamatorias con niveles no detectables de IFN (tipo I y III)14.
Un fenómeno similar fue reportado por Cheung y cols en 2005 con células dendríticas infectadas con SARS-CoV, las cuales mostraron una baja expresión de IFN-α, IFN-β e IFN-γ, así como una moderada sobre regulación de la expresión de TNF-α e IL-6, y una significativa sobre regulación de la expre sión de quimioquinas proinflamatorias, tales como MIP-1α, IP-10, MCP-1 y RANTES15.
Por su parte, Liu y cols demostraron una relación entre el grado de linfopenia y la sobre producción de citoquinas proinflamatorias con la severidad de la infección por SARSCoV- 2, observando una disminución en el conteo periférico de células T (particularmente CD8+), así como un incremento sérico en los niveles de IL-6, IL-10, IL-2 e IFN16, resultados que concuerdan parcialmente con lo aquí observado, en donde se evidenció un aumento únicamente para el caso de la IL-6 y la IL-10 y lo descrito por Zhang Z et al. quienes también encontraron asociación entre la elevación de IL-6 e IL-8 con severidad clínica.
Aunque hay diferencias en los hallazgos de los perfiles de citoquinas, lo que si parece ser una constante es la elevación de la IL-6 en los pacientes severos, tal como lo encontramos en este estudio y por ende empieza a ser considerado de mal pronóstico. La importancia que juega la IL-6 en los procesos proinflamatorios, destacándose su papel en procesos tales como: la proliferación y migración celular; el control del me tabolismo de adipocitos, hepatocitos y músculo estriado; la promoción de vías catabólicas; disfunción renal; producción de fibrinógenos, entre otros, podrían fácilmente explicar su papel en la fisiopatología de la COVID-1917-19.
En este sentido, estudios derivados de la emergencia mundi al por la pandemia por COVID-19 dan cuenta de afectaciones a nivel de coagulación en las personas con cuadros severos ocasionados por SARS-CoV-2, y a pesar de que el mecanismo por el cual se da esta complicación aún no se ha descifrado claramente, se postula que la patogénesis asociada a esta particularidad se debe al incremento en los niveles de Pa trones Moleculares Asociados a Daño (DAMPs por sus siglas en ingles de Damage-Associated Molecular Patterns) y al in cremento en la producción de citoquinas proinflamatorias, lo que genera daño endotelial asociado a muerte celular20.
Particularmente para el caso de la IL-6, se ha evidenciado su capacidad de inducir la activación de la cascada de coagu lación e incrementar la permeabilidad vascular, fenómeno que se asocia con la diseminación rápida de la inflamación y daño en tejido pulmonar en los individuos con manifestacio nes severas de la infección por SARS-CoV-27.
Axelsson y cols en 2016 evaluaron 12 biomarcadores para el monitoreo y evaluación de la progresión de la enfermedad cardiovascular en un estudio que involucró a 543 pacientes, observándose a la IL-6 como uno de los biomarcadores más robustos al momento de realizar el seguimiento y evaluación de la predicción de mortalidad21.
En línea con lo anterior, estudios realizados por Yang dem ostraron el incremento de los niveles de IL-6 como un marca dor de mal pronóstico frente a la infección por SARS-CoV-2, asociándose a trastornos de los procesos de coagulación e in flamación, repercutiendo de manera directa en la mortalidad de la enfermedad22. Estos hallazgos a su vez permiten explorar las opciones terapéuticas basadas en inhibidores de la IL-6 como el tocilizumab, cual podría ser una opción prometedora, especialmente en pacientes con cuadros clínicos relacionados no solo relacionados con la tormenta de citoquinas23.
Por otro lado, llama la atención las evidencias sobre el nivel de anticuerpos observado en pacientes asintomáticos frente a pa cientes sintomáticos (en particular en aquellos individuos hospi talizados), en donde se detectaron niveles inferiores de anticu erpos en pacientes con mejor prognosis de la enfermedad en comparación con los niveles de anticuerpos de pacientes hospi talizados quienes mostraron un aumento significativo. Estos hallazgos, se encentran en concordancia con lo reportado por Tang y cols en 2020, quienes demostraron que el grupo de individuos infectados con SARS-Co-2 asintomáticos se caracterizan por el desarrollo de una respuesta inmune más débil, al compararse con el grupo de individuos con infecciones sintomáticas24. Adicionalmente en la cinética de los anticuerpos se ha detectado que hay una caída del nivel de anticuerpos a medida que pasa el tiempo25, lo que podría limitar su detección e interpretación a medida que el tiempo desde la infección sea mayor. No obstante, aún no se sabe si esta menor presencia de anticuerpos en los pacientes con síntomas leves se asocie a una menor protección e incluso Sekine Y et al, sugiere con sus hallazgos que estas personas con síntomas leves sin producción de anticuerpos podrían tener una respuesta inmune celular robusta y protectora26. Nuestros hallazgos si permitieron correlacionar la concentración de Inmunoglobulinas con la de citoquinas séricas, pero sin poder afirmar su papel en la severidad o en a protección.
Por otra parte, con base en los reportes que sugieren una mayor severidad en el curso de la enfermedad en pacientes del género masculino28-30, en el presente estudio comparamos además los niveles de citoquinas circulantes entre los pacientes según su sexo, evidenciándose únicamente diferencias significativas en la producción de IL-2 en el grupo A (con un mayor nivel en hombres). Estos hallazgos, no permiten arrogar mayor evidencia que permitan atribuir el desarrollo de una respuesta particular con el género de los pacientes.
Nuestro estudio tiene varias limitaciones y es que no evalúa la cinética de los niveles de las citoquinas séricas y anticuerpos en forma longitudinal sino corresponde a un momento de la evolución de la infección en cada paciente. Es conocido que los niveles podrían ser diferentes dependiendo no solo de la severidad clínica sino del momento de la infección. Además, se ha descrito que incluso hay diferentes inmunofenotipos que pueden expresar diferentes respuestas inmunes y por lo tanto afectar la respuesta inmune observada27. En este análisis no se hizo correlación con inmunofenotipos que nos permitiera orientar los tipos de respuesta. Una tercera limitación es el tamaño de cada uno de los grupos (n=8), pero a pesar de ello las diferencias encontradas en algunas de las citoquinas fueron significativas.
Los fenómenos aquí reportados reflejan la importancia de realizar mayores estudios de los componentes de inmunidad adaptativa y su interrelación con las diferentes manifestaciones clínicas, los cuales permitan aportar al entendimiento de la fisiopatología de la enfermedad. No obstante, los hallazgos de este estudio permiten corroborar que las manifestaciones clínicas podrían asociarse a patrones de respuesta inmune y por ende se hace necesario evaluar el papel que juegan los anticuerpos, sus isotipos y sus subclases en el control de la infección, así como citoquinas como la IL-6 y el IFN, en el desenlace de la enfermedad. Finalmente se sugiere y explorar las posibles diferencias no solo en severidad clínica, género y evolución en el tiempo.