INTRODUCCIÓN

La floricultura en Colombia es una de las actividades económicas que más genera ingresos de divisas internacionales, el 95 % de la producción total de flores cultivadas en nuestro país son exportadas a Estados unidos, Japón y Rusia (^{Manrique et al., 2014}). El clavel representa el 11,7% del total de la producción generada (^{Asocolflores, 2018}), es por ello que gran parte del clavel que comercializan en los mercados internacionales provienen de Colombia, posicionándolo como el segundo productor a nivel mundial (^{Asocolflores, 2015}).

A pesar de su importancia, la producción de esta flor y las ganancias que genera al sector floricultor han disminuido debido al marchitamiento vascular causado por el hongo Fusarium oxysporum f. sp. dianthi (Fod) (^{Castellanos et al., 2010}; ^{Soto-sedano et al., 2012}). Actualmente, para el control de Fod se emplean estrategias de tipo químico y físico, las cuales son costosas y generan un control apenas aceptable de la enfermedad. Por esta razón, el desarrollo de alternativas más eficaces de control, compatibles con los sistemas de producción actuales e inofensivos para el medio ambiente, se convierte en una necesidad para el fortalecimiento de cultivo de esta flor. Sin embargo, para tales fines se requiere conocer la interacción entre el patógeno y el clavel, así como estudios básicos sobre los procesos en los que se fundamenta la resistencia de la enfermedad en las variedades resistentes.

Se ha determinado que la respuesta de defensa en plantas infectadas con formas especialis de Fusarium oxysporum puede estar regulada, dependiendo de la especie vegetal, por las vías de señalización que involucran a las hormonas ácido salicílico (SA, por sus siglas en inglés Salicylic acid) en algunos casos, o el ácido jasmónico (JA, por su sigla en inglés Jamonic acid) y el etileno (ET), en otros (^{Berrocal-lobo y Molina 2007}; ^{Qi et al., 2012}; ^{Di et al., 2016}). El SA es predominantemente asociado con resistencia a patógenos biótrofos y hemibiótrofos (^{Makandar et al., 2012}; ^{Dinolfo et al., 2016}) y, aunque no se conocen de manera detallada los procesos bioquímicos en los que se encuentra involucrada esta hormona, su rol en resistencia para varias enfermedades ha sido ampliamente reportado. Algunos estudios han permitido determinar que la respuesta de defensa asociada a esta hormona puede incluir la acumulación de especies reactivas de oxígeno (EROS), la síntesis de proteínas relacionadas a patogénesis y la activación de enzimas relacionadas a defensa. Entre estas últimas se encuentra la fenilalanina amonio liasa (PAL, por su sigla en inglés Phenylalanine ammonia-lyase), enzima regulatoria de la ruta fenilpropanoide y para la que se ha propuesto un papel importante en la biosíntesis de SA. Así mismo, se destacan la Guayacol Peroxidasa (GPX) y la Polifenoloxidasa (PFO), que participan en procesos oxidativos involucrados en el reforzamiento de la pared celular y la Fosfolipasa D (PLD, por su sigla en inglés Phospholipase D), la cual está relacionada con procesos tempranos durante el incremento de EROS en la respuesta de defensa vegetal (^{Yamaguchi et al., 2004}; ^{Ardila y Higuera, 2005}; ^{Cuervo et al., 2009}; ^{Zhao, 2015}).

Si bien una buena parte de los mecanismos bioquímicos mencionados previamente han sido involucrados en la resistencia a diferentes patógenos del género Fusarium sp. (^{Makandar et al., 2012}; ^{Li y Wang, 2018}), a la fecha no se conocen, para varios de los casos, cuáles son las rutas de señalización involucradas en su activación. Entre las razones para tal limitación, se encuentra que no existe una relación directa entre las respuestas y las rutas de señalización; algunas de las respuestas asociadas al SA, también se han encontrado para el ácido jasmónico. En nuestro modelo clavel-Fod, en donde se ha determinado que la actividad de PAL, GPX y PFO aumentan en variedades resistentes infectadas con el patógeno (^{Ardila y Higuera, 2005}; ^{Cuervo et al., 2009}; ^{Ardila et al., 2011}), es poco lo que se conoce sobre las rutas de señalización involucradas que determinan dicha activación. De hecho, a la fecha no se tienen estudios que determinen la acumulación de hormonas asociadas a la resistencia durante la interacción clavel-Fod. Es por ello que, en el presente trabajo de investigación, se estableció si la hormona ácido salicílico aumenta sus niveles a nivel de simplasto y si estos cambios, se relacionan estadísticamente con la activación de mecanismos de defensa durante la infección con Fod. Para ello, se evaluó la respuesta de algunas enzimas que han sido ampliamente asociadas con resistencia al marchitamiento vascular, como son la PAL, GPX, PFO y PLD, y se correlacionó estadísticamente con el aumento en los niveles de la hormona SA, a nivel de simplasto, de tallos de clavel infectados con el patógeno. Al ser el simplasto vegetal, la fracción citoplasmática en donde se presentan los eventos más tempranos de transducción de señales y acumulación de hormonas en diferentes tipos de estrés biótico, era de esperarse que esta evaluación permitiera obtener los mayores niveles de sensibilidad en la determinación.

Por otro lado, esta evaluación nos permitirá conocer si la activación se presenta en fases tempranas, donde se presume se activan los mecanismos de defensa más importantes relacionados con resistencia (1 a 2 dpi), o si se presentaban de manera tardía, en donde se presume, se activa la fase necrotrófica de este patógeno (7 y 14 dpi) (^{Ardila et al., 2014}; ^{Martínez et al., 2017}; ^{Vanegas Cano, 2019}). Los resultados presentados se constituyen en el primer estudio que se realiza para el modelo clavel-Fod sobre rutas de señalización y acumulación de hormonas de defensa. Por lo tanto, esta información es fundamental para futuros estudios en esta interacción planta-patógeno

MATERIALES Y MÉTODOS

RESULTADOS

Cuantificación de salicilato de metilo y ácido salicílico en simplasto de tallo de clavel inoculados con Fod

Los resultados obtenidos indicaron que existe un aumento en los niveles de MeSA y SA, en simplasto de tallo de clavel por efecto de la inoculación en la variedad resistente y susceptible. Se encontró que los niveles de MeSA aumentaron a tiempos tempranos y tardíos en la variedad resistente (p < 0,05), mientras que, en la variedad susceptible, se presentó un incremento sólo a 2 dpi (Fig. 1a). En cuanto al SA, en tiempos tempranos, al parecer no se presenta su acumulación en el simplasto de este órgano de la planta; sus niveles siempre se encontraron por debajo de los límites de cuantificación de la técnica empleada. No obstante, a tiempos tardíos, para esta hormona existe una acumulación en la variedad resistente desde los 7 dpi que se mantiene hasta los 14 dpi, mientras que el aumento en la susceptible sólo se presentó a los 14 dpi (Fig. 1b) (p < 0,05).

Figura 1 Concentración de salicilato de metilo (a) y ácido salicílico (b) en simplasto de tallo de clavel, durante la interacción con Fod en variedades Resistente y Susceptible. Las barras verticales corresponden a la desviación estándar de cada promedio (n = 3). Las letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05). 

Evaluación de la actividad enzimática en simplasto de tallos de clavel inoculados con Fod

Los niveles simplásticos de las enzimas PAL y PFO en tallo se presentan en la Fig. 2. Se evidenció que, por efecto de la inoculación en la variedad resistente, la enzima PAL presentó un aumento significativo a 1 dpi, mientras que, a los 2 y 7 dpi, la inoculación generó una disminución de la actividad en ambas variedades (Fig. 2a). En lo que respecta a la enzima PFO, se presentó un incremento de la actividad a 1 dpi en la variedad resistente, mientras que, en la variedad susceptible, esta enzima incrementó su actividad a 1 y 7 dpi (Fig. 2b).

Figura 2 Niveles de actividad enzimática PAL (a) y PFO (b) en simplasto de tallo de clavel, durante la interacción de Fod en las variedades Resistente y Susceptible. Las barras verticales corresponden a la desviación estándar de cada promedio (n = 3). Las letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05). 

Por su parte, se evidenció que, para la GPX se presentaron diferencias significativas a 1 dpi en la variedad resistente, mientras que una disminución en la actividad de GPX se presentó en los días 2 y 7 post-inoculación (p < 0,05). En cuanto a la variedad susceptible no se evidenció inducción de esta enzima para ninguno de los tiempos evaluados; de hecho, la actividad disminuye significativamente en el tratamiento inoculado a 1, 2 y 7 dpi, respecto a los tratamientos control (Fig. 3a). En el caso de la actividad PLD, la inoculación generó un aumento a 1 dpi en la variedad resistente, mientras que en la variedad susceptible se generó un incremento a los 2 dpi, menos dramático que el registrado en la variedad susceptible (Fig. 3b). En todos los demás tiempos, no se presentaron cambios significativos para ninguna de las variedades.

En relación a las correlaciones de Pearson entre los parámetros bioquímicos evaluados en la interacción clavel-Fod, se tuvieron sólo en cuenta las correlaciones significativamente positivas (p < 0,05) que existieran entre los parámetros. De acuerdo con los resultados obtenidos, en la variedad resistente se presentó una relación positiva entre la acumulación de MeSA y el incremento en la actividad de las enzimas GPX y PLD (p < 0,05) (Tabla 1), así mismo, se presentaron correlaciones positivas entre algunas de las enzimas objeto de estudio, como es el caso de la PLD con las enzimas PAL (0,937) y GPX (0,937). Por su parte, la variedad susceptible no presentó una relación significativa entre la acumulación de las hormonas SA y MeSA, y la actividad enzimática PAL, PFO, GPX y PLD.

Figura 3 Niveles de actividad enzimática GPX (a) y PLD (b) en simplasto de tallo de clavel, durante la interacción de Fod en las variedades Resistente y Susceptible. Las barras verticales corresponden a la desviación estándar de cada promedio (n = 3). Las letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05). 

Tabla 1 Correlaciones de Pearson entre los parámetros bioquímicos evaluados en la interacción clavel-Fusarium oxysporum f. sp. dianthi. N variable definido por la matriz de datos* valores significativos con un p < 0,05 

PAL: Phenylalanine ammonio lyase; PFO: Polifenoloxidasa; GPX: Guaiacol peroxidasa; PLD: Fosfolipasa D; SA: Salicylic acid; MeSA: Methyl salicilate.

DISCUSIÓN

La ruta de señalización que involucra a la fitohormona ácido salicílico (SA, Salicylic acid), es bien conocida por participar en la regulación de la respuesta de defensa a patógenos y en otros procesos fisiológicos asociados con el estrés vegetal (^{Makandar et al., 2012}; ^{Jing et al., 2017}). En el presente estudio se evidenció que el éster metílico del ácido salicílico, conocido como salicilato de metilo (MeSA, Methyl salicilate), se acumula en mayor cantidad y más temprano en tallos de clavel de una variedad resistente a la enfermedad durante la interacción con el patógeno (Fig. 1a). Estas diferencias en la acumulación de este compuesto entre las dos variedades objeto de estudio, evidencian el papel potencial de esta vía de señalización en la resistencia al marchitamiento vascular, tal y como ha sido reportado para otros modelos que involucran patógenos de la especie F. oxysporum (Makandar et al., 2010; ^{Di et al., 2016}).

Fue evidente que la acumulación de MeSA no se presentó de manera simultánea con la hormona libre; de hecho, la acumulación del éster metílico se presenta de manera más temprana (1 dpi) si se compara con el SA, que aumenta sus niveles a los 7 y 14 dpi. Esta diferencia en los tiempos de acumulación para estas dos hormonas en el tallo, puede estar relacionado a distintos escenarios entre los que se destacan: a) la conversión inmediata del SA generando MeSA por medio de la enzima ácido salicílico metiltransferasa (SA methyl transferase, SAMT), haciendo los niveles del SA indetectables en este órgano, y por tanto elevados los niveles de MeSA a 1 dpi o b) que la acumulación detectada del MeSA sea debida a una respuesta sistémica que involucra la traslocación de esta hormona desde la raíz, primer punto de contacto con el patógeno. Esta última propuesta estaría sustentada en evidencia experimental en otros modelos, que proponen que, algunos procesos asociados con el transporte de hormonas de este tipo, se pueden presentar durante la interacción con patógenos (^{Dempsey y Klessig 2012}; ^{Gao et al., 2015}) y a resultados del grupo de investigación que evidencian un aumento significativo de SA y MeSA en raíces infectadas con el patógeno a tiempos tempranos (Resultados no mostrados).

No obstante, con la presente investigación se evidencia que, en cualquiera de estos posibles escenarios planteados, la activación de esta ruta de señalización puede estar asociada con la resistencia a la enfermedad del marchitamiento vascular, lo cual es acorde con lo reportado para este tipo de patógenos del género Fusarium sp., a los que se les ha propuesto una posible fase biotrófica inicial y en donde el papel de MeSA y su posible conversión al ácido salicílico ha sido ya documentado (^{Makandar et al., 2012}; ^{Di et al., 2016}).

Es evidente que la respuesta simplástica en los tallos de clavel implica la acumulación de diferentes enzimas con actividades metabólicas diversas (Figs. 2 y 3). De acuerdo a los resultados descritos, el aumento diferencial en la actividad PAL a 1 dpi debido a la presencia del patógeno en el tallo, evidencia la estimulación de la ruta fenilpropanoide; esta es una de las principales rutas de biosíntesis de compuestos fenólicos a nivel de simplasto, los cuales pueden tener un papel central en resistencia, debido a su actividad antimicrobiana y a su papel como precursores para el reforzamiento de la pared celular (^{Ardila et al., 2011}; ^{Cho y Lee 2015}).

Considerando que la biosíntesis de estos compuestos Fenólicos conlleva a la acumulación importante de estos metabolitos, era de esperarse que otras enzimas, como las PFO, aumentarán sus niveles como parte de la respuesta al patógeno. El papel de esta enzima a nivel de simplasto puede relacionarse con la diversificación estructural de compuestos fenolicos, lo cual ha sido ampliamente documentado para estas enzimas ubicadas principalmente en formas latentes a nivel del cloroplasto (^{Fuerst et al., 2014}; ^{Boeckx et al., 2015}). El aumento de la PFO se ha asociado a la activación transcripcional de los genes codificantes para esta enzima o por la liberación de formas latentes (^{Taranto et al., 2017}), con el fin de estimular la oxidación de los compuestos fenólicos que pueden convertirse en estructuras lignificadas una vez son transportadas al apoplasto (^{Raj Niranjan et al., 2006}; ^{Fuerst et al., 2014}; ^{Taranto et al., 2017}). Este tipo de respuestas de defensa ha sido reportado previamente en clavel, en donde la lignificación de la pared celular y la formación de tilosas, tiene un rol importante para evitar la movilidad de Fod a distintas partes de la planta a través del xilema (^{Baayen et al., 1996}; ^{Higuera y Ebrahim-Nesbat, 1999}).

Otra de las enzimas que tradicionalmente ha sido asociada a las respuestas bioquímicas de las plantas, son las peroxidasas de clase III, ubicadas principalmente a nivel apoplástico (^{Daudi et al., 2012}; ^{Sabaterjara et al., 2014}). Sin embargo, la presencia de peroxidasas a nivel citosólico ha sido ampliamente documentado en el reino vegetal, teniendo un papel central en la regulación de Especies Reactivas de Oxígeno (EROs) en organelos como los peroxisomas y vacuolas (^{Foyer 2018}; ^{Huang et al., 2019}; ^{Choudhary et al., 2020}) . Al parecer, en el caso del clavel, la acumulación de esta enzima a nivel del simplasto en el primer día post-inoculación (Fig. 3a), debe tener un papel central en la regulación de especies oxidantes, como el peróxido de hidrógeno. Este compuesto se acumula de manera importante en tejidos infectados por este patógeno (^{Cuervo et al., 2009}; ^{Ardila et al., 2014} ), siendo necesario la activación de mecanismos citoplasmáticos de regulación antioxidante. Los resultados son acordes con diferentes estudios en apoplasto y en tejido completo en tallo de clavel, en donde se ha propuesto que la inducción diferencial de la actividad GPX busca contrarrestar la acumulación significativa de H₂O₂, que puede favorecer la fase necrotrófica del patógeno Fod. Estos resultados también están de acuerdo con la inducción temprana de GPX durante la interacción con patógenos del género Fusarium sp., en genotipos resistentes de otras especies (^{Madadkhah et al., 2012}; ^{Thakker et al., 2013}).

La respuesta simplástica temprana en la variedad resistente descrita en el presente estudio, esta corroborada con la inducción diferencial de la enzima PLD (1 dpi), la cual se encuentra exclusivamente a nivel citosólico y está involucrada con la generación del ácido fosfatídico (PA, Phosphatidic acid), cuya molécula señal es central en la activación de respuestas a estrés biótico o abiótico (^{Kalachova et al., 2012}; ^{Singh et al., 2012}; ^{Li et al., 2017}). Se ha demostrado que la PLD y la formación de PA son señales requeridas para la generación de especies reactivas de oxígeno (EROS) (^{Yamaguchi et al., 2004}; ^{Singh et al., 2012}) esto debido a que puede interactuar directamente con homólogos de oxidasas (RBOH) en la membrana plasmática y regular la producción de H₂O₂ (^{Zhao, 2015}; ^{Li y Wang, 2018}). Al considerar la intensidad de la respuesta de PLD para la variedad susceptible, la cual fue de menor magnitud y más tardía, es de considerar que esta respuesta bioquímica es mucho más rápida e intensa en el genotipo resistente. De acuerdo a los análisis de correlación realizados (Tabla 1), es posible que la actividad PLD puede estar involucrada en la activación temprana de enzimas como GPX y PFO, las cuales como se discutió anteriormente, están relacionados a procesos de eliminación de EROS y fortalecimiento de la pared celular; esto estaría de acuerdo con la ya descrita respuesta coordinada en contra del patógeno determinada por la resistencia multigénica del hospedero (^{Ben-Yephet et al., 1992}; ^{Soto-sedano et al., 2012}).

En general, la inducción diferencial de las enzimas objeto de estudio, a excepción de la PLD, había sido previamente reportada en nuestro modelo planta-patógeno, y es probable que estén relacionada con la resistencia del clavel a la enfermedad (^{Ardila y Higuera, 2005}; ^{Ardila et al., 2011}; ^{Ardila et al., 2014}). Así mismo, un aumento en la actividad de estas enzimas ha sido previamente asociado a la activación de la vía de señalización del ácido salicílico en otros modelos vegetales (^{Taşgin et al., 2006}; ^{Kalachova et al., 2012}; Wani et al., 2016). Sin embargo, la comparación simultánea en el mismo tejido de los niveles de hormonas relacionadas y de estas enzimas determinarán por primera vez las correlaciones estadísticas entre los fenómenos bioquímicos objeto de estudio. Así mismo considerando estos resultados y la información reportada para otros modelos en la presente investigación se puedan proponer algunas relaciones preliminares de causa y efecto entre ellas. Esta alternativa ha sido usada para tal fin en diferentes estudios bioquímicos relacionados (^{Taşgin et al., 2006}; ^{Makandar et al., 2012}; ^{Ardila 2013}). Con esta aproximación se encontró que, un aumento en la concentración de MeSA en tallo, puede estar relacionada con un incremento en los niveles de actividad enzimática PAL, GPX y PLD (Tabla 1). Considerando que estas relaciones solo se presentan para el genotipo resistente, es probable que la activación de dichas rutas esté asociada directamente con la resistencia al patógeno Fod (Fig. 2 y 3).

Se evidenció que, en el caso de la variedad susceptible, existe una respuesta bioquímica de menor intensidad y más tardía que la encontrada en el genotipo resistente; solo presentó actividad de la enzima PFO al 1 y 7 dpi, y la PLD a 7 dpi (inducción apenas significativa), sin estar correlacionada con la acumulación de MeSA (Tabla 1). Sin embargo, la acumulación de algunas de estas enzimas, sobre todo a tiempos tardíos, podría estar asociada a la activación de la fase necrotrófica del patógeno, que generaría descompartimentación de los organelos y aumento de la actividad y/o secreción de enzimas por parte del patógeno (^{Kubicek et al., 2014}; ^{Lyu et al., 2015}; ^{Chowdhury et al., 2017}). La propuesta que sea parte de los mecanismos de defensa tardíos puede estar sustentada en el hecho que la actividad de PLD estuvo relacionada estadísticamente con el incremento en la concentración de MeSA (Fig. 1a). En general la disminución de la actividad para algunos de los tiempos, se ajusta al conocido comportamiento modular de estas respuestas, que se activan con el fin de mantener la eficiencia energética de la planta evitando sacrificar crecimiento y sus funciones normales.

La evidencia experimental presentada en esta investigación es fundamental para profundizar en la regulación y posible potencialización de los fenómenos bioquímicos relacionados con resistencia. Se hace necesarios estudios adicionales que permitan confirmar las relaciones causa efecto preliminarmente propuestas en esta investigación, con el uso de mutantes de clavel afectados en las rutas de señalización del ácido salicílico.

CONCLUSIONES

De manera general, en este estudio se presentan mecanismos de defensa asociados a la acumulación de hormonas y enzimas a nivel de simplasto, y que posiblemente están involucrados con la resistencia de clavel ante el marchitamiento vascular causado por Fod. La evidencia acá presentada permite correlacionar estadísticamente la acumulación de hormonas y enzimas durante la interacción, indicando posibles relaciones causa y efecto basadas en lo reportado para otras especies vegetales. Sin embargo, es importante mencionar que se deben realizar estudios adicionales donde se comprueben las propuestas realizadas, así como la participación de otras posibles hormonas y su relación con otras respuestas asociadas de defensa. Un conocimiento básico y detallado de estos procesos bioquímicos es el sustento para la generación de nuevas herramientas de control de la enfermedad causada por este patógeno en el clavel.