INTRODUÇÃO
A faringoamigdalite caracteriza-se pela colonização das amígdalas e orofaringe por uma gama de micro-organismos que inclui bactérias e vírus. Porém, uma constante preocupação médica são as infecções causadas pelo Streptococcus pyogenes, uma bactéria β-hemolítica do grupo A de Lancefield, que é potencialmente capaz de causar complicações em órgãos vitais [1, 2].
As observações populares sobre o uso e a eficácia de plantas medicinais contribuem de forma relevante para a divulgação das virtudes terapêuticas dos vegetais, utilizados com frequência pelos efeitos benéficos que produzem, apesar de não terem todos seus constituintes químicos conhecidos [3]. Grande parte da população que procura nos remédios caseiros a cura para sua enfermidade recorre aos raizeiros/curandeiros das suas regiões para tal fim.
O Centro de Educação Popular (Cenep), organização não-governamental localizada no município de Nova Palmeira (PB), desenvolve a prática do uso de remédios caseiros. Nessa instituição são utilizadas várias plantas do bioma caatinga, e além dos remédios naturais, também são oferecidas terapias complementares.
Gargarejo é um produto utilizado por agitação de infuso, decocto ou maceração na garganta pelo ar que se expele da laringe, não devendo o líquido ser engolido ao final [4]. É uma das principais alternativas caseiras e complementares no combate a afecções da garganta, que podem ser bastante eficazes sem oferecer muito risco aos usuários. Existem vários produtos que podem ser associados nas preparações de gargarejo, inclusive, mistura de plantas medicinais que vão fornecer ação antibacteriana, anti-inflamatória e analgésica.
Em estudo realizado por Oliveira et al. [5], 27 plantas utilizadas na forma de gargarejo para tratamento de afecções bucais foram mencionadas. Alencar et al. [6] destacou em seu estudo a utilização da casca de romã na forma de gargarejo do macerado e chá para o tratamento de afecções como, gengivite e faringite. A Punicagranatum além de possuir uma abundância de flavonóides, antocianinas, catequinas e derivados elágicos hidrolisáveis específicos, são ricas também em lignanas [7].
Entretanto, assim como qualquer outro medicamento, aqueles baseados em plantas devem comprovar sua eficácia e segurança para uso, exigindo que procedimentos de controle de qualidade sejam estabelecidos em toda a sua cadeia produtiva, desde o seu plantio até a droga vegetal ou fitoterápico, prontos para dispensação [8].
Tendo em vista a grande incidência de infecções nas vias aéreas superiores, e o uso de produtos naturais para o seu tratamento, o trabalho se justifica na investigação da atividade antimicrobiana de um produto tradicional a base de plantas utilizadas sobre essas infecções do trato respiratório, além de demonstrar a presença dos compostos fitoquímicos responsáveis por essa atividade, e também na comparação da eficácia com produtos já estabelecidos no mercado, utilizados para o mesmo fim. Diante disso, o trabalho teve como objetivo avaliar parâmetros de qualidade e a eficácia antimicrobiana in vitro do gargarejo produzido na Oficina de Remédios Caseiros do Cenep.
MATERIAIS E MÉTODOS
As análises foram realizadas nos Laboratórios de Controle da Qualidade e de Microbiologia do Curso de Bacharelado em Farmácia da Universidade Federal de Campina Grande, no Centro de Educação e Saúde, Cuité (PB).
Foram analisadas três amostras (A, B e C) do gargarejo à base de associação de plantas medicinais (romã, gengibre e tansagem) provenientes da Oficina de Remédios Caseiros do Cenep.
Avaliação microbiológica
A contagem de micro-organismos viáveis foi realizada através do método de semeadura em profundidade, a partir de diluições em série de 1:10, 1:100 e 1:1000 conforme descrito na Farmacopeia Brasileira [9]. Foi utilizado Ágar Caseína-Soja (ACS), incubado à 35°C por 5 dias e Ágar Sabouraud Dextrose (ASD) à 25°C por 7 dias, para a contagem de bactérias e fungos, respectivamente.
Os patógenos pesquisados foram Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa, conforme estabelecido na Farmacopeia Brasileira para produtos de preparação para uso tópico (oromucosa e gengival), utilizando ágar manitol salgado e ágar cetrimida, seguido de provas bioquímicas específicas [9].
Todos os meios utilizados eram da marca Kasvi® e os sais utilizados para a preparação de soluções e reagentes da marca Dinâmica®.
Para a identificação dos fungos filamentosos foi utilizada a técnica de microcultivo. Após incubação, os fungos provenientes do crescimento, foram analisados macroscopicamente operando um microscópio óptico com objetiva de 40x.
Comprovação do potencial antimicrobiano do gargarejo contra S. pyogenes
Para a realização dos testes de comprovação da eficácia antimicrobiana do gargarejo, foi utilizado o método de difusão em ágar. Para isto, usou-se uma cepa de Streptococcus pyogenes proveniente de isolado clínico e fornecida pelo laboratório de microbiologia clínica da mesma instituição. O inóculo foi preparado a partir de um repique recente em ágar nutriente inclinado e incubado por 24 h, seguido de suspensão em solução salina 0,9% e padronização a 25% de transmitância, com densidade microbiana de aproximadamente 0,5 x 108 UFC/mL.
O método de difusão em ágar [9] consistiu, inicialmente, na preparação de uma camada base de meio ágar nutriente a 50°C e distribuídos sobre as placas de Petri uniformemente em uma superfície nivelada, e posteriormente adicionada à camada semeada com 2% de suspensão padronizada de S. pyogenes.
Em seguida, dispôs-se quatro cilindros de aço inoxidável em cada placa de Petri adequadamente para que não houvesse sobreposição dos halos. Em cada cilindro foi adicionado um tipo de solução diferente, sendo o gargarejo puro (Gp), o gargarejo diluído (Gd) de acordo com as instruções de uso estabelecidas pelo Cenep, e os outros dois cilindros com produtos já estabelecidos no mercado, um antisséptico (C1) composto por hortelã, aroeira, eucalipto e romã, e um Colutório (C2) composto por aroma de menta, álcool e outros constituintes.
O procedimento foi realizado utilizando-se cinco placas para cada amostra (A, B e C). Os halos foram medidos com auxílio de um paquímetro e documentados de acordo com as amostras utilizadas na placa de Petri.
Controle de qualidade físico-químico
Foram realizados ensaios para determinação de pH, resíduo seco, densidade e características organolépticas, conforme especificações da Farmacopeia Brasileira [9].
Caracterização fitoquímica
Inicialmente 10 mL do gargarejo foi diluído em 25 mL de água, conforme a orientação de uso. Foram utilizados quatro tubos de ensaio para a detecção, sendo o primeiro referente à pesquisa de alcaloides, dois para taninos, um para flavonoides e um branco. Cada tubo de ensaio continha 2 mL da solução obtida do gargarejo seguido da adição dos reagentes necessários para identificação de cada grupo metabólito secundário (tabela 1). A evidenciação foi realizada conforme especificações da Sociedade Brasileira de Farmacognosia, sendo a mudança na coloração ou turvação da solução, o indicativo da presença dos compostos ativos.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados obtidos a partir do levantamento bibliográfico sobre as plantas que compõem o gargarejo estão ilustrados no tabela 2, os quais descreveram diferentes constituintes responsáveis pelas atividades terapêuticas.
Nome popular | Nome científico | Metabólitos secundários | Uso etnofarmacológico | Referência |
---|---|---|---|---|
Romã | Punica granatum | Taninos, flavonoides, alcaloides | Doenças inflamatórias e infecciosas | [10] |
Gengibre | Zingiber officinale | Alcaloides, antraquinonas | Anti-inflamatório, antiemético, antibiótico | [10, 11] |
Tansagem | Plantato major | Taninos, flavonoides, alcaloides | Afecções de boca e garganta | [4, 10] |
Muitos trabalhos científicos pesquisaram as propriedades medicinais da romãzeira ( P. granatum). No entanto, ainda não há estudos etnofarmacológicos, farmacognósticos e toxicológicos suficientes para elucidar os mecanismos de ação e efeitos dos constituintes químicos derivados da romã. Somente recentemente observou-se que a punicalagina, um tanino elágico extraído do fruto da romanzeira, é provavelmente um dos principais constituintes antimicrobianos deste fruto [12].
Popularmente, o gengibre vem sendo empregado por meio de soluções e sprays, na cavidade oral, devido a sua ação cicatrizante, anti-inflamatória e antimicrobiana. Pesquisas mostram que óleos e extratos de Z. officinalle apresentam ação inibitória sobre bactérias Gram-positivas e negativas, porém ainda há poucos estudos que relacionam o gengibre aos micro-organismos prevalentes na cavidade bucal, visto que esta apresenta uma microbiota bastante variada e que pode desencadear inúmeras patogenias [13].
Plantago major é utilizada tradicionalmente para múltiplas enfermidades, variando de acordo com a parte da planta utilizada. As folhas são usadas como antissépticas, depurativas, hemostáticas, antibacterianas, supurativas, diuréticas, desinfetantes, anti-infla-matórias, antipiréticas, entre outras [14].
Contagem de micro-organismos viáveis
Pode-se observar crescimento bacteriano e fúngico em todas as amostras de gargarejo, embora não tenha sido observada em todas as diluições utilizadas. Os resultados obtidos após contagem dos micro-organismos estão ilustrados na tabela 3. Os níveis de micro-organismos aeróbios mesófilos viáveis totais encontrados variaram de 2,0 x 101 a 3,7 x 102 para fungos e 1,0 x 102 a 1,6 x 103 para bactérias.
Amostras | Fungos (UFC/mL) | Bactérias (UFC/mL) |
---|---|---|
A | 2,0 x 101 | 1,6 x 103 |
B | 5,5 x 101 | 6,0 x 102 |
C | 3,7 x 102 | 1,0 x 102 |
Fonte: Dados da pesquisa.
As preparações de uso tópico (oromucosa, nasal, gengival, cutâneo e auricular), devem apresentar contagem total de bactérias aeróbias menor que 102 UFC/mL e menor que 101 UFC/mL para fungos [15]. Houve crescimento bacteriano e fúngico em todas as amostras do gargarejo, porém, para produtos de origem vegetal para uso oral, a farmacopeia estabelece o limite microbiano para bactérias aeróbias menor que 104 UFC/mL e menor que 102 UFC/mL para fungos. Por se tratar de um produto de origem natural, o gargarejo estudado se enquadrou dentro dos limites estabelecidos.
Os produtos comercializados, incluindo os fabricados a base de plantas medicinais, estão sujeitos à presença de variados tipos de contaminantes, sendo a contaminação microbiológica de importância significativa na medicina, pois pode oferecer riscos potenciais à saúde dos usuários. Em função da origem da planta, diversos tipos de micro -organismos podem estar presentes, desde bactérias até fungos, tendo como possíveis fontes de contaminação a poluição na água de irrigação, atmosfera, solo, condições da coleta, manipulação, secagem e estocagem das matérias primas vegetais [16].
Pesquisa de patógenos
No rastreamento de S. aureus utilizando o meio manitol salgado, foi possível observar a formação de colônias amareladas características para esse tipo de micro-organismo nas três amostras (A, B e C). Porém, a confirmação da presença desse micro-organismo foi negada através da realização do teste de DNAse.
Na pesquisa da presença de Pseudomonas aeruginosa em ágar cetrimida, observou-se que não houve formação da presença de pigmento azulado em nenhuma das amostras com crescimento bacteriano, comprovando a ausência desse micro-organismo nas amostras do produto.
A farmacopeia apenas estabelece que para produtos de uso tópico (oromucosa, nasal, gengival, cutâneo, auricular), devem ter contagem total de fungos/leveduras inferior a 101 UFC/mL. Embora não haja exigências quanto à identificação de fungos de acordo com o que é estabelecido na Farmacopeia Brasileira [9], os fungos foram identificados macroscopicamente e microscopicamente.
Macroscopicamente, nas amostras de gargarejo, as colônias apresentaram-se veludas, penugentas e superfície áspera, topografia elevada e colorações que variaram de cinza-esverdeado ao cinza-claro, marrom-esverdeado e negro (figura 1a). Microscopicamente, as colônias apresentaram-se com coloração marrom escuro, característico de fungos demáceos, organizados com aspecto de cachos em cadeia ramificadas e apresentando hifas finas, septadas, ramificadas, e forma de "galhos de árvore" (figura 1b). Essas características são compatíveis com os fungos pertencentes ao gênero Cladosporium [11]. Desta forma, todas as amostras de gargarejo apresentaram contaminação fúngica pelo fungo citado.
O gênero Cladosporium spp., identificado como contaminante das amostras de gargarejo, é um dos fungos de maior concentração no ar, particularmente em regiões quentes, como no Seridó da Paraíba [17]. Cladosporium spp. são fungos filamentosos, caracterizados por apresentarem uma coloração escura. São fungos saprófitos, normalmente encontrado em plantas colonizadoras ou no solo [18]. Embora não seja relatado que espécies de Cladosporium produzam micotoxinas de grande preocupação, é válido ressaltar que são fungos produtores de compostos orgânicos voláteis associados com odores que alteram as características organolépticas [19]. Há relatas que o gênero Cladosporium spp. ocorre sobre inúmeras espécies vegetais, especialmente como componente da microflora das sementes, ainda no campo e durante a estocagem e armazenamento [20].
Verificação do potencial antimicrobiano do gargarejo
As médias dos diâmetros dos halos de inibição das amostras de gargarejo variaram de 15,4 a 18,6 mm na forma de gargarejo puro, e 10,5 a 14,0 mm na sua forma diluída (tabela 4).
Amostra | Diâmetro dos halos (mm) | |
Gargarejo puro mmédia ± DP | Gargarejo diluído (2:5) média ± DP | |
A | 15,4 ± 0,52 | 10,5 ± 0,54 |
B | 16,2 ± 1,60 | 11,2 ± 0,80 |
C | 18,6 ± 0,09 | 14,0 ± 1,54 |
Todas as amostras de gargarejo apresentaram halos de inibição frente ao Streptococcus pyogenes variando de 15,4 a 18,6 mm quando puras e 10,5 a 14,0 quando diluídas, destacando-se a amostra C com os melhores resultados. No entanto, os produtos comerciais avaliados, caracterizados como antisséptico (C1) e colutório (C2), não apresentaram halo de inibição contra o micro-organismo testado conforme observado da figura 2.
Pereira et al. [21] também demonstraram a eficácia do extrato da romã sobre outras espécies de Streptococcus, são elas: S. mitis, S. mutans, S. sanguis, S. sobrinus e Lactobacillus casei, tendo-se observado halos de inibição que variaram de 10 a 25 mm, e sendo considerado ativo o extrato que mostrou halos de inibição superior a 15 mm.
Controle de qualidade físico-químico
As amostras de gargarejo apresentaram aspecto de suspensão, com precipitado castanho -esverdeado, conforme observado no tubo 5 da figura 3a. Odor e sabor característicos das plantas utilizadas na sua composição.
As amostras de gargarejo apresentaram pH de 4,39 ± 0,16, resíduo seco médio 14,43 ± 1,00 e densidade média de 1,013 ± 0,010 (tabela 5).
Amostra | Parâmetro | ||
pH | Resíduo seco (%) | Densidade (g/mL) | |
A | 4,48 | 14,50 | 1,005 |
B | 4,48 | 13,40 | 1,004 |
C | 4,21 | 15,40 | 1,030 |
Média ± DP | 4,39 ± 0,16 | 14,43 ± 1,00 | 1,013 ± 0,010 |
Fonte: dados da pesquisa.
A amostra C apresentou maior porcentagem de resíduo seco (15,40 %), fato que pode justificar a obtenção dos maiores halos de inibição sobre o Streptococcus pyogenes corroborando a indicação da maior eficácia antimicrobiana como consequência da presença de uma maior quantidade de extrativos vegetais.
É importante ressaltar que a variação de pH de uma formulação pode modificar as características físico-químicas dos ativos veiculados, influenciando atributos relacionados a estabilidade, biodisponibilidade e biocompatibilidade, comprometendo a segurança e eficácia terapêutica da formulação [22].
Estudos destacam que todos os parâmetros físico-químicos (pH, resíduo seco e densidade) podem afetar a segurança e eficácia do produto e causar prejuízos ao consumidor especialmente porque fitoterápicos, na sua grande maioria, são produtos cuja venda independe de prescrição médica [23].
Triagem fitoquímica
Todos os testes realizados para comprovação da presença de metabólitos secundários tiveram resultados positivos (Tabela 6). Os testes aplicados para comprovação da presença de grupos de metabólitos secundários nas amostras A, B e C, demonstraram através de reações intensas, presença de taninos, flavonoides e alcaloides (figura 3a). Contudo, quando aplicados à uma amostra comercial, com composição vegetal semelhante às amostras de gargarejo, apresentam reação negativa para a presença de flavonoides e reação fraca quanto à presença de taninos e alcaloides (figura 3b).
A romã (Punica granatum Linn.) é basicamente composta por taninos (substâncias polifenólicas) e alcaloides que são substâncias dotadas de ação antimicrobiana [24].
Em relação à composição do gengibre, em um estudo que analisou o perfil fitoquímico e biológico do extrato hidroalcoólico dos rizomas do gengibre, foram detectados a presença de polifenóis através do doseamento em espectrofotômetro, porém em pequenas concentrações [25].
Em um estudo da análise farmacognóstica e atividade antibacteriana de extratos vegetais empregados em formulação para a higiene bucal, confirmaram a presença de alcaloides e flavonoides para a espécie Plantago major (Tanchagem) [26]. Um estudo comprovou que as folhas do P. major L. apresentaram um perfil fitoquímico composto por flavonoides, taninos, saponinas, terpenos, glicosídeos e alcaloides.
Os resultados obtidos após análise fitoquímica do gargarejo, corroboram os dados encontrados na literatura em relação à sua composição. Esses compostos são os responsáveis pela eficácia do gargarejo no combate às afecções da garganta.
O presente estudo expõe resultados inéditos, apresentando fitoquímica qualitativa, além de realizar uma associação do uso popular com a comprovação experimental da eficácia, ainda que in vitro, do gargarejo fitoterápico. Havendo necessidade de realizar testes in vivo nos próximos estudos.
CONCLUSÃO
O gargarejo produzido na Oficina de Remédios Caseiros do Cenep (Nova Palmeira), apresentou parâmetros que qualidade adequados do ponto de vista microbiológico e físico-químico, com um perfil fitoquímico composto por taninos, alcaloides e flavonoides, corroborando dados encontrados na literatura em relação à composição das plantas medicinais utilizadas na sua preparação, bem como, mostrou-se adequado do ponto de vista da indicação terapêutica popular, tendo em vista que o mesmo demonstrou atividade antimicrobiana contra S.pyogenes, um dos micro-organismos responsáveis pela faringoamigdalite, sendo mais eficaz em inibir o micro-organismo quando comparado aos produtos disponíveis no mercado utilizados neste trabalho. Este estudo fortalece a valorização e a preservação do conhecimento popular, em especial para a população de Nova Palmeira, que entre tantas regiões também faz uso desse recurso terapêutico alternativo com segurança, eficácia e qualidade.