INTRODUCCIÓN

La enfermedad de Chagas es causada por el parásito protozoo Trypanosoma cruzi. Es endémica de América Latina, donde afecta a 21 países y es reconocida por la Organización Mundial de la Salud (OMS) como una de las 17 enfermedades tropicales desatendidas en el mundo ^[1]. La enfermedad es transmitida por la subfamilia Triatominae de la chinche, de la cual 123 especies son conocidas por ser vectores naturales del parásito. Además de esto, la enfermedad también se expande geográficamente debido a la migración del vector por el cambio climático y, sin embargo, las opciones de tratamiento siguen siendo limitadas e ineficaces ^[2,3]. Estas consisten en dos fármacos utilizados desde la década de los 70, nifurtimox y benznidazol ^[4]; ambos se activan por medio de una nitrorreductasa tipo I dependiente de NADH localizada a nivel mitocondrial y se ha demostrado que la disminución de la actividad de esta enzima juega un papel importante en la resistencia a estos tratamientos ^[5]. Además de esto, Nifurtimox es un fármaco de estrecho margen terapéutico y el tratamiento puede presentar reacciones adversas tales como: neuropatía periférica y depresión de médula ósea que pueden ser severas y acompañarse de fiebre, inflamación ganglionar y edema que corresponden a síntomas de hipersensibilidad a antimicrobianos ^[6].

Existen diferentes proteínas del parásito que pueden ser blancos moleculares para el desarrollo de nuevos fármacos en el tratamiento de la enfermedad de Chagas. En las últimas décadas se han estudiado diferentes rutas metabólicas del parásito que pueden ser moduladas para obtener resultados terapéuticos tales como las de la biosíntesis de ergosterol y los sistemas enzimáticos redox ^[7]. También se han estudiado proteínas involucradas en la adhesión a las células del huésped como la transialidasa ^[8] y otras proteínas como la tripanotión reductasa y la superóxido dismutasa que actúan protegiendo al parásito del daño generado por las especies reactivas del oxígeno ^[9]. Sin embargo, no se han logrado descubrir ni diseñar inhibidores potentes de estas enzimas ^[8]. Estrategias adicionales se han usado para el descubrimiento de nuevos fármacos entre las que se incluye el modelado in silico de proteínas del parásito homólogas a proteínas de función conocida en otras especies ^[10], presentándose las desventajas derivadas de no disponerse de estructura cristalizada. También se han evaluado compuestos de actividad farmacológica conocida para inhibir rutas metabólicas específicas como la biosíntesis de ergosterol, la glucólisis, el metabolismo del pirofosfato, entre otras rutas ^[11]; así mismo, presentándose desventajas como la alta probabilidad de manifestación de eventos adversos, por lo tanto, la evaluación y aproximación a nuevos blancos moleculares resulta necesaria para el desarrollo de tratamientos adecuados.

La dUTPasa (desoxiuridina trifosfato nucleótido hidrolasa) es una enzima que cataliza la reacción de ruptura hidrolítica del dUTP (desoxi uridin trifosfato) generando pirofosfato y dUMP (desoxi uridin monofosfato) como productos. La función de esta enzima es necesaria para generar los sustratos de la timidilato sintasa que es la responsable de la síntesis de dTMP (desoxi timidin monofosfato) y por lo tanto está relacionada con el aporte del nucleótido timina para la síntesis del ADN. En organismos eucariotas existen vías adicionales para sintetizar los sustratos de la enzima timidilato sintasa, por lo que en estos organismos es de especial importancia una segunda función de la dUTPasa que consiste en mantener el dUTP en muy bajas cantidades evitando que este nucleótido se adicione equivocadamente al ADN. La ADN polimerasa no puede diferenciar entre el dUTP y el dTTP (desoxi timidin trifosfato), por esto, se necesita que la proporción de estos nucleótidos se encuentre en órdenes de 1:1x10⁵, con el objetivo de que el sustrato principal en la síntesis del ADN sea el dTTP y no se adicione uracilo al ADN ^[12,13]. Cuando la cantidad de dUTP aumenta se facilita el ingreso de uracilo al ADN con lo que se inician mecanismos de ruptura y reparación que terminan con una fragmentación del ADN y muerte celular ^[12]; se ha demostrado que el bloqueo o el inadecuado funcionamiento de esta enzima lleva a letalidad en los organismos ^[14].

El grupo más común de dUTPasas, distribuidas en organismos desde mamíferos hasta bacterias y retrovirus, corresponden a un grupo de proteínas homotriméricas, compuestas fundamentalmente de hojas plegadas beta y presentan cinco dominios conservados localizados en las interfases de las subunidades donde se constituyen los sitios activos ^[15]. La dUTPasa de T. cruzi, por el contrario, es una proteína dimérica que no presenta ninguno de los 5 dominios conservados en los sitios de acción de las proteínas homotriméricas y constituye una familia de secuencias diferentes en relación tanto a las proteínas monoméricas como las triméricas ^[16]. Se ha demostrado que la expresión de la dUTPasa es fundamental en Leishmania major y debido al alto grado de similitud de esta proteína entre tripanosomátidos se puede extrapolar la importancia a otros parásitos de la familia como T. cruzi ^{[ 16]}.

MATERIALES Y MÉTODOS

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Se decidió usar pBLAST para realizar la selección del blanco entre las proteínas cristalizadas de T. cruzi disponibles en PDB, considerando que la búsqueda del porcentaje de similitud entre secuencias a través de alineación básica local es un método para aproximarse a la identificación de homología entre proteínas ^[21]. Teniendo en cuenta que se buscaban las proteínas con el menor porcentaje de similitud en relación con proteínas humanas, se decidió tomar el valor límite de 10 % de query cover para evaluar aquellas que presentaban valores iguales o inferiores a dicho valor. Se excluyeron las proteínas que no presentaban similitud significativa (NR), ya que este resultado se puede presentar en secuencias con valor esperado (E value) superior al umbral máximo establecido para el proceso (expect threshold); esto debido a que el valor E se ve afectado por la longitud de la secuencia ^[23]. Igualmente, se realizó la mencionada exclusión, considerando que dicho resultado se obtiene en proteínas con elevadas secuencias de baja complejidad, en las cuales, por el proceso de filtración del alineamiento se alteran los resultados por aumento de significancia estadística sin relación con importancia biológica ^[24].

Se evaluaron 271 secuencias, se excluyeron 51 del total de 322 arrojadas en la búsqueda, al corresponder a microorganismos diferentes a T. cruzi. Como se observa en la tabla 1, se encontraron siete secuencias que corresponde a tres proteínas con un porcentaje de Query cover inferior al 10 %. Dichas proteínas son: la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (código PDB 1112), de la cual se alineó el 8 % de la secuencia con 32 % de identidad; la glucoquinasa (códigos 5BRD, 5BRE, 5BRF y 5BRH) con un 9 % de la secuencia alineada y 32 % de identidad y la dUTPasa (códigos 1OGL y 1OGK) 9 % de la secuencia alineada con 47 % de identidad.

Se seleccionó la dUTPasa considerando que, aunque las tres proteínas participan en vías metabólicas necesarias para la supervivencia del parásito, de la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa y la glucoquinasa ya se han buscado inhibidores en otros trabajos ^[25,26] y que la dUPTasa es una enzima que tiene diferencias estructurales importantes con proteínas de actividad catalítica similar en mamíferos y presenta una ventaja importante que corresponde a su doble función considerando que, además de generar el sustrato de la timidilato sintasa, evita que se aumente la proporción dUTP-dTTP, lo que es necesario para la supervivencia del parásito ^[12]. Revisando entonces los resultados del alineamiento de la dUTPasa se encontró que solo se obtuvo un valor significativo de alineamiento con proteínas humanas y corresponde a la proteína no caracterizada c4orf19 con valor E de 9,1; y al evaluar las dos secuencias se halló que no se presenta similitud en los aminoácidos del sitio activo. Del resultado del PSI-BLAST a la secuencia 1OGK se obtuvo que, para valores de E menores al umbral no se encontró ningún resultado, para valores de E superiores al umbral se obtuvieron 4 resultados en el que el mayor query cover corresponde a la proteína Anillin, en la cual, no se presenta similitud significativa con el sitio activo de la proteína dUTPasa. Demostrando con todo lo anterior, la viabilidad de la proteína como potencial blanco molecular.

Figura 1 A. Alineamiento de secuencias entre la dUTPasa (1OGK) y la proteína no caracterizada c4orf19, único alineamiento de valor significativo con proteínas humanas usando pBLAST. B. Alineamiento con PSI-BLAST entre la dUTPasa y anillin, proteína que presentó el mayor query cover para valores de E superiores al umbral. 

Considerando que se encuentran dos estructuras de la dUTPasa, reportadas por los mismos autores ^[16], las cuales corresponden a los códigos 1OGL y 1OGK, se realizó la evaluación de sus estructuras para realizar la selección. La estructura 1OGL presenta mejores parámetros de cristalización tales como: una resolución de 2,4 A, valor de clashscore de 5,0 y porcentaje de valores atípicos de Ramachandran de 0.0%. Por otra parte, la proteína 1OGK presenta una resolución de 2,85 A, clashscore de 16 y porcentaje de valores atípicos de Ramachandran de 2,3 %. Sin embargo, se decidió usar la estructura 1OGK porque esta estructura se encuentra en complejo con el ligando y contiene las subunidades A y B, esto es necesario teniendo en cuenta que el sitio activo se ubica entre estas dos subunidades ^[16].

Adicionalmente, se revisó el reporte completo de validación de la estructura cristalográfica de la proteína dUTPasa (código 1OGK) ^[27], encontrando que el valor de R, que se usa como medida de la calidad del modelo atómico, presenta un valor de 0,205, muy cercano al valor típico de 0,2 para este parámetro ^[28]. De igual forma, el valor de R-free que corresponde a una medida diseñada para reducir el sesgo presente en el valor R, presenta un valor de 0,267, cercano al valor típico de 0,26 ^[28,29].

Adicionalmente, se evaluó la integridad del sitio activo de 1OGK, que corresponde a la zona que se usó para el cribado virtual y la identificación de potenciales inhibidores. Para esto, se tomó el reporte general de validación de la estructura y se revisaron los aminoácidos con valores atípicos de ángulos de enlace, se observaron valores alterados en 2 aminoácidos del sitio activo que corresponden a los residuos 52 (ácido glutámico) y 77 (ácido glutámico), ambos de la subunidad B; este último residuo presenta un valor atípico de longitud de enlace de 1,61 A (átomos CG-CD) contra un valor ideal de 1,51 A. En cuanto a la revisión de los ángulos diedros, en el mapa de Ramachandran, no se encontró ningún aminoácido con valores atípicos. Considerando que se tiene un valor de clashscore elevado, se evaluaron los solapamientos entre átomos, encontrándose que se reporta solapamiento de un hidrógeno del residuo 209 (tirosina) con un oxígeno del residuo 204 (arginina), ambos de la subunidad B, cuyo valor de superposición es de 0,49 A. En tirosina 209, se reportó una superposición de 0,49 A de un carbono con un hidrógeno de la lisina 63 de la subunidad A y con un carbono de este mismo residuo, lisina 63, con un valor de 0,46 A. Asimismo, al usar la herramienta Protein Preparation Wizard de maestro, se encontró una superposición adicional entre el oxígeno del residuo 201 (asparagina) con un hidrógeno del residuo 205 (glicina) de la subunidad A.

De los 17 aminoácidos del sitio activo se encontraron problemas en 4 de ellos, por lo que se decidió realizar una preparación de la proteína con el módulo Protein Preparation Wizard del software maestro para solucionar los problemas observados desde el reporte de validación ^[27]. Considerando que todos los solapamientos observados en el sitio activo se presentaban con átomos de hidrógenos se decidió remover los hidrógenos originales antes de añadir hidrógenos en maestro y usar la herramienta para minimizar hidrógenos de especies alteradas; además de esto, se estableció un pH de 7,3 y usar la herramienta Propka determinando los estados de ionización de las especies de las cadenas lateralesy las especies tautoméricas estables de las histidinas.

En la figura 2 se presenta el sitio activo de la dUTPasa de T. cruzi tanto en representación 3D como 2D con el ligando de la estructura cristalizada. Se muestran los aminoácidos con los que interactúa el ligando endógeno, en este sitio se ubicó el grid para el proceso de cribado virtual.

Figura 2.A Vista 3D del sitio activo de la dUTPasa de T. cruzi con ligando cristalográfico dUDP (lugar de localización del grid). B. Vista 2D del sitio activo con los aminoácidos que presentan interacciones con el ligando. 

Se usó AutoDock Vina, ya que además de ser el sistema usado por la plataforma Drug Discovery de TACC ^[20], es un programa calibrado con 30 complejos proteína ligando con constantes de acoplamiento determinadas experimentalmente y es uno de los programas que predice las mejores posiciones con los mejores puntajes ^[30]. Para evaluar si las posiciones son correctamente acopladas en relación con la estructura determinada experimentalmente, se tomó la especie química mayoritaria a pH 7,3 del dUTP que se encuentra en un 48 % según se determinó usando software Marvin. El mejor resultado arrojado del proceso de acoplamiento en AutoDock Vina presentó una afinidad calculada de -8,9 kcal/mol, al determinar el valor de RMSD en PyMOL en relación con la estructura del ligando cristalizado se obtuvo un valor de 1,4 A, demostrando que el programa usado para el acoplamiento es capaz de reproducir el modo de unión del ligando cristalizado.

CRIBADO VIRTUAL Y SELECCIÓN DE MOLÉCULAS CANDIDATO

Considerando que se buscan moléculas que puedan actuar como inhibidores competitivos de la enzima, se descartaron los resultados con valores de score más positivos que el obtenido para el dUTP (-8,9 kcal/mol). Así entonces, se descartaron todos los resultados de la base de prueba, ya que el mejor resultado de esta corresponde a la estructura con código ZINC C00001567 de score -8,4 kcal/mol. Después de realizar el análisis y exclusión de resultados por tamaño molecular y estructura química, se realizó un nuevo acoplamiento molecular (in house) de los potenciales candidatos, para confirmar el valor de energía libre de unión calculada usando AutoDock Vina. Se realizó dicho proceso de acoplamiento molecular in house considerando que, aunque la plataforma del TACC permite el acceso a potentes recursos computaciones con una interfaz de acceso intuitivo que permite el uso de una herramienta de acoplamiento molecular robusta como Autodock Vina ^[31], la plataforma tiene un estrecho rango de variables a modificar en los proyectos enviados permitiendo definir el sitio activo, el tamaño del grid, la librería, pero dejando varias variables fuera de alcance.

Por lo anterior, al no poder tener control sobre todas las variables del proceso de acoplamiento molecular, se realizó el acoplamiento in house usando el mismo software manejado por la plataforma, Autodock Vina, para validar los resultados obtenidos teniendo control sobre todos los parámetros del proceso de acoplamiento especialmente sobre la exhaustividad. Al igual que en el caso del dUTP, se evaluó la especie química mayoritaria a pH 7,3 para cada resultado considerando que el estado de protonación de la molécula tiene importancia en las interacciones entre ligando y la proteína, principalmente las electrostáticas que impactarán en la fuerza y especificidad de la unión ^[32]). Se observó que en todos de los casos la especie mayoritaria tenía carga neta de 0 y correspondía a un porcentaje superior al 87 %. En la tabla 2 se presentan los resultados obtenidos del acoplamiento in house para las potenciales moléculas candidato; se puede observar que al controlar todos los parámetros del acoplamiento se presentan cambios en los resultados para algunas moléculas, sin embargo, no se excluyó ningún resultado considerando que todos los valores fueron más positivos que -8,9 kcal/mol. Las variaciones observadas en algunos resultados presentados en la tabla 2, pudieron ocurrir debido a que la exhaustividad usada por el AutoDock Vina del TACC pudo no ser suficiente para reproducir los resultados in house, posiblemente, debido a que el tamaño del grid, al ser superior a 30 A en cada eje, requería un aumento de exhaustividad ^[33].

Para la evaluación de características indicadoras de un adecuado perfil farmacocinético de un fármaco de administración oral, se realizó el análisis del perfil de absorción por vía oral, según las reglas de Lipinski, las cuales enuncian que una adecuada biodisponibilidad se tendrá en moléculas que cumplan al menos 3 de los siguientes criterios: masa molecular menor a 500 daltons, menos de 5 donadores, menos de 10 aceptores de puentes de hidrógeno y un valor de Log P calculado menor a 5 ^[34]). Según los resultados mostrados en la tabla 3, basados en los anteriores criterios, ninguna de las moléculas estudiadas presentaría pobre absorción por vía oral. Se observa que todas las moléculas cumplen al menos 3 de los criterios mencionados anteriormente, sin embargo, aunque alguna de las moléculas hubiera incumplido las reglas de Lipinski, no se excluiría de los análisis posteriores teniendo en cuenta que, a pesar de ser un criterio orientador en el desarrollo de fármacos no implica que el potencial activo sea inviable desde punto de vista farmacocinético, dejando abierta la posibilidad, por ejemplo, de una administración parenteral ^[35]. Así entonces, este análisis se reporta para dar indicios de la vía de administración que podría llegar a ser usada en fases posteriores de investigación.

Tabla 3 Resultado de análisis de criterios de Lipinski para absorción por vía oral de las potenciales moléculas candidato seleccionadas. 

*Determinado usando software MarvinSketch V. 18.24.

**Tomado como la suma de oxígenos y nitrógenos en la estructura molecular.

Adicionalmente, se evaluaron las moléculas bajo los 13 modelos de toxicidad disponibles en el servidor eMoltox que corresponden a toxicidad mitocondrial, hepática, cardiaca, respiratoria, renal, reproductiva, en sistema nervioso central, oral aguda, mutagenicidad/genotoxicidad, carcinogénesis, citotoxicidad, sensibilización en piel y efectos sobre citocromo P450. eMoltox predice la toxicidad usando datos conocidos mediante un desarrollo de aprendizaje automático ^[36]. Se tomaron los datos de la principal acción que presenta el mayor valor de confianza por cada molécula.

Como se puede observar en la tabla 4, para la mayoría de estas moléculas los efectos tóxicos se podrían presentar a nivel hepático, esto se evidencia al predecirse efectos en proteínas como la bomba exportadora de sales biliares que es el principal transportador de lípidos y ácidos biliares en la membrana del canalículo de los hepatocitos y cuya expresión irregular se relaciona con alteración en la secreción de ácidos biliares ^[37]. También se puede observar que en las moléculas con códigos ZINC02157508 y ZINC01040055 se predicen posibles efectos en el receptor hepático X alfa o LRXa con valores de confianza superiores a 0,99; esta macromolécula actúa como sensor de colesterol y se tiene la hipótesis que participa en los mecanismos de regulación de conversión de colesterol a sales biliares regulando la expresión de la enzima 7a-hidroxilasa, se ha demostrado que la actividad de esta enzima también se relaciona con la regulación de los niveles de LDL ^[38]. La molécula código ZINC01777088, según la predicción obtenida, podría tener efectos a nivel del receptor farnesoide X (FRX) que se expresa en altos niveles en tejidos intestinales y hepáticos y se encuentra asociado con la regulación de colesterol, glucosa, lípidos y ácidos biliares ^[39]. Por otra parte, las moléculas en las que se predice in silico la mayor seguridad son ZINC00124103 ya que el principal efecto relacionado con toxicidad corresponde a una inhibición metabólica de CYP 1A2, que corresponde al 13 % del citocromo en el hígado y es una de las enzimas más importantes relacionada con la biotransformación de medicamentos como acetaminofén, amitriptilina, propranolol y warfarina entre otros ^[40], y las moléculas ZINC01044975, ZINC20460463, ZINC20464484 y ZINC15670144, en las que no se encontraron efectos tóxicos en los modelos evaluados.

Tabla 4 Valores de la principal acción tóxica y el valor de confianza de esta para las potenciales moléculas candidato. 

Al evaluar las interacciones entre los potenciales candidatos y la dUTPasa usando free maestro, se evidencia que todas las estructuras presentan interacciones con las regiones de unión a fosfatos, a uracilo y a desoxirribosa del dUTP. Como se observa en la tabla 5, la mayoría de los aminoácidos involucrados en las interacciones de los potenciales candidatos concuerdan con las reportadas para el ligando endógeno ^[16]. De los resultados mostrados en la tabla 5, se puede observar que por lo menos dos de los aminoácidos involucrados en la interacción con fosfatos en el dUDP, resultan ser de alta importancia para las potenciales moléculas candidato, dichos aminoácidos corresponden a Lisina 197 y Arginina 204 de la subunidad B; con el primero, se presentan interacciones tipo ϖ-catión, puente de hidrógeno e interacciones dipolares en dos moléculas diferentes para cada tipo de interacción, en el caso la molécula con mejor puntuación (ZINC00124103), como se puede observar en la figura 3, este aminoácido además de presentar interacción tipo ϖ-catión, actúa como donador de puente de hidrógeno lo que también sucede con la molécula ZINC01044975. En el caso de Arginina 204 de la subunidad B, se puede ver su importancia al presentar interacciones de diferentes tipos, ya sea puente de hidrógeno, ϖ-catión o por dipolos con todas las potenciales moléculas candidato.

Tabla 5 Tipos de interacciones presentadas en la unión de las moléculas seleccionadas con el blanco y aminoácidos involucrados. 

Figura 3 Interacciones de la molécula candidato que presentan la mejor puntuación, ZINC00124103 (4-{3-[3-(trifluorometil)fenil]isoxazol-5-l)pirimidin-2-amina) con el sitio activo de la dUTPasa en vistas A. 3D y B. 2D. 

Se observa que en la región de unión a uracilo resultan ser importantes las interacciones hidrofóbicas al encontrarse que la mayoría de las moléculas evaluadas presentan interacción con metionina 29 de la subunidad B y triptófano 61 de la subunidad A, interacciones que presenta también el ligando endógeno. La naturaleza principalmente apolar de las partes de las moléculas que interactúan con esta región del receptor permite que se presenten interacciones hidrofóbicas con residuos de aminoácidos diferentes a los reportados para el ligando endógeno como leucina 25 y triptófano 42 de la subunidad B. También es importante resaltar que la interacción por apilamiento ϖ-ϖ que presentan las moléculas candidato con triptófano 62 de la subunidad A, en esta región de unión con uracilo, parece tener gran importancia para la afinidad de los potenciales inhibidores teniendo en cuenta que todas las moléculas presentan esta interacción.

En dos de las moléculas en las que se calcularon las menores energías libres de unión (ZINC02157508, ZINC20460463) y por lo tanto en las que se esperarían los complejos de unión más estables, se observa interacción tipo pi-catión con lisina 197 por lo que se podría relacionar esta interacción con el incremento de estabilidad de la formación de complejo enzima-inhibidor.

Se excluye como potencial candidato a fármaco la molécula código ZINC15l70345 considerando que esta solamente se diferencia en un metilo de la molécula código ZINC15670188, la presencia de dicho metilo no muestra interacciones adicionales con los aminoácidos de la proteína lo que es coherente con los resultados del proceso de acoplamiento mostrados en la tabla 2, donde se puede observar que la diferencia entre las puntuaciones de ambas moléculas es solamente de 0,1 kcal/mol siendo mayor en la molécula código ZINC15670188 lo que puede deberse a que la ausencia del grupo metilo en esta molécula favorece la formación de puentes de hidrógeno con Lisina l3 de la subunidad A.

De los resultados obtenidos se puede observar que la molécula que presenta un mejor balance entre los resultados indicadores de actividad y de seguridad in-silico corresponde a la molécula 4-{3-[3-(trifluorometil)fenil]isoxazol-5-l}pirimidin-2-amina con código ZINC00124103 ya que además de calcularse energía libre de unión de -11,4 kcal/mol, no se encontraron efectos severos dentro de los modelos de toxicidad. Así entonces, esta sería una primera opción para evaluación de dinámica molecular y escalado a estudios in vitro de seguridad y efectividad. Sin embargo, las moléculas restantes también podrían llegar a ser opciones viables teniendo en cuenta que en cuatro de ellas no se encontraron efectos de toxicidad in silico.

CONCLUSIONES

La proteína dUTPasa de Trypanosoma cruzi es un blanco viable para el diseño e investigación de nuevos fármacos para el tratamiento de la enfermedad de Chagas, esto se fundamenta entre otros, en la alta diferencia que presenta el sitio activo en comparación con proteínas que ejercen la misma actividad catalítica en humanos; así entonces, se hace viable la investigación de moléculas que actúen sobre este blanco como potenciales moléculas candidato. Debido a esto, se condujo una búsqueda de moléculas que tras procesos de acoplamiento presentan afinidad por la enzima blanco, encontrándose 12 moléculas con potencial unión y bloqueo del sitio activo de la enzima además de adecuadas características moleculares indicadoras de farmacocinética. Entre estas moléculas, la de menor energía libre de unión calculada con la proteína blanco y menores posibilidades de efectos tóxicos corresponde a la 4-{3-[3-(trifluorometil)fenil]isoxazol-5-l}pirimidin-2-amina que puede ser una potencial molécula candidato para estudios posteriores de dinámica molecular y pruebas in vitro en cultivos del parásito.