Materiales

Determinación del grado de sustitución (GS)

Se determinó mediante titulación ácido-base, a los tres lotes de almidón modificado. Indica el número promedio de grupos hidroxilos sustituidos por mol de anhidroglucosa (AG) [²⁸]. Se dispersaron 2 g de almidón lipofilizado en 40 mL de agua destilada. Se sometió a calentamiento hasta ebullición y se dejó enfriar a temperatura ambiente. Se adicionaron tres gotas de fenolftaleína al 1 % como indicador y se tituló con NaOH 0,01 N hasta coloración rosa leve. El GS se calculó mediante la ecuación 1:

Dónde:

C= normalidad de la solución de NaOH utilizado durante la titulación.

V = volumen (mL) consumido de la solución de NaOH.

W = peso (g) de la muestra analizada.

162 es el peso molecular de la unidad de glucosa.

210 es el peso molecular del OSA.

Caracterización por espectroscopía infrarroja

El AÑ y el AÑS se caracterizaron mediante espectroscopia infrarroja (infrarrojo, Shimadzu IRPrestige-21), en un rango de longitud de onda entre 4000 y 500 cm^-1, las mediciones fueron realizadas con el aditamento ATR, siguiendo la metodología descrita por la USP 42 [²⁹].

Caracterización del aceite esencial de tomillo

La composición del aceite esencial de tomillo se analizó mediante la técnica instrumental de cromatografía de gases acoplada a detector de masas con impacto electrónico (GC-MS/EI), siguiendo la metodología de Fernandes et al. [³⁰] con algunas modificaciones. Todos los análisis fueron llevados a cabo en un equipo Thermo Scientific™ Trace™ 1300, conectado a un ISQ QD espectrofotómetro de masas simple cuadropolo y a un auto-muestreador AL1310 (Thermo Fischer, Massachusetts, EE.UU.) en modo de inyección líquida, bajo las siguientes condiciones: como muestra se tomaron 20 [iL de aceite esencial que se disolvieron en 480 μL de acetato de etilo. De esta solución se inyectaron 2 μL en modo split 20:1 a una temperatura de 220 °C. Se empleó una columna capilar de polydimethylsiloxane, 5 % phenyl, 30 m x 0,25 mm ID con un espesor fase estacionaria de 0,25 μL de Thermo (Massachusetts, EE.UU.), empleando helio como gas de arrastre (≥ 99,99% de pureza). El horno fue trabajado con gradiente de temperatura iniciando a 40 °C por un minuto, con una rampa de 4 °C por minuto hasta 180 °C, seguido de un incremento de 30 °C por minuto hasta alcanzar los 250 °C para un tiempo total de corrida de 38,3 min. El espectrofotómetro de masas fue trabajado en rango de escaneo de m/z 50-600 u.m.a. en modo de impacto electrónico y una energía de ionización de 70 eV. La temperatura de la línea de transferencia fue de 280 °C y la de la fuente de ionización de 230 °C.

La evaluación de los datos fue llevada a cabo mediante el software Chromeleon^® 7-Chromatography versión 7.2.2.6394. La identificación de los componentes del aceite esencial se determinó por comparación entre los espectros de masas obtenidos de las muestras y los reportados en la librería NIST-2007 del programa.

Preparación de las emulsiones

Mediante ensayos preliminares se determinaron las condiciones de emulsificación para formar una emulsión con estabilidad aceptable y apropiada para llevar a cabo el proceso de microencapsulación. Esto comprendía la selección del agente o mezcla de agentes que conformarían la matriz biopolimérica GA, M o AÑS, la relación de las fases oleosa y acuosa, la velocidad y el tiempo de homogenización. A partir de las composiciones de las matrices definidas se evaluaron distintas relaciones de fases oleosa/acuosa tales como 1:4, 1:5 y 1:6. La velocidad de homogenización se probó entre 10 000-15 000 rpm y el tiempo entre 15 y 30 min. Los biopolímeros se dispersaron previamente en agua durante 12 h, a fin de asegurar su dispersión o hinchamiento, con contenidos totales de sólidos del 20 %. Para la matriz GA/M se definió una proporción 50:50 de cada dispersión y para la matriz GA/M/AÑS se definieron proporciones equivalentes de cada material (1/3: 1/3: 1/3).

Se prepararon las emulsiones de aceite esencial de tomillo con la matriz de recubrimiento seleccionada mediante un proceso convencional en caliente para emulsiones Pickering. Se siguió la técnica propuesta por Song et al. y Chevalier and Bolzinger [³¹, ³²], que consiste en iniciar con la suspensión del sólido que cumplirá el papel de estabilizante de la emulsión en la fase acuosa, por lo cual se dispersó el almidón succinatado en agua, permitiendo su hidratación durante 12 h a 50 °C. Una vez disperso, el aceite esencial de tomillo se fue adicionando a la dispersión anterior, homogenizando con el equipo de dispersión Ultraturrax T18, IKA, bajo las condiciones establecidas en los ensayos preliminares.

Caracterización de las emulsiones

Para el éxito de la microencapsulación fue necesario asegurar una estabilidad idónea de las emulsiones, por lo cual se evaluó la viscosidad y apariencia. La viscosidad de la emulsión debía estar en un rango entre 100-300 cp para ser bombeable por el equipo de secado por atomización. Este parámetro se midió por triplicado a 100 g de la emulsión, utilizando un viscosímetro Brookfield modelo RVDV-E a 50 rpm, empleando la aguja 2 y a 18 ± 2 °C. Asimismo, se observó el aspecto visual de la emulsión a temperatura ambiente y de refrigeración en un lapso de 7 días, considerando la presencia o ausencia de separación de fases.

Elaboración de las micropartículas

La obtención de las micropartículas se llevó a cabo mediante el proceso de secado por atomización en un equipo Mini Spray Dryer Buchi B-290, con Inert Loop B-295 integrado, equipado con un generador de nitrógeno (Proton on Site Nitrogen N341M) que provee una atmosfera inerte durante el secado, para reducir la oxidación del aceite esencial, siguiendo la metodología de Kusonwiriyawong [³³]. La emulsión fue bombeada peristálticamente en el equipo y pasó a través de una boquilla (1,5 mm de diámetro interno), donde se atomizó en forma de finas gotas. Las condiciones de trabajo fueron: temperatura de inyección: 137-138 °C, flujo de nitrógeno: 414 L/h, tasa de aspiración de aproximadamente: 32 m³/h y velocidad de alimentación de aproximadamente: 3 mL/min.

Las condiciones de obtención y composición de los microencapsulados se definieron mediante un diseño estadístico experimental (DEE) fraccionado 2⁵, cuyas variables de ensayo fueron: tipo de matriz polimérica, temperatura de inyección, flujo de nitrógeno, flujo de alimentación y flujo de aspiración; mientras que las variables respuesta fueron: rendimiento, eficiencia de encapsulación, tamaño de partícula e índice de dispersión. Se realizaron ensayos previos con el propósito de encontrar las condiciones de partida para el DEE, evidenciando, por ejemplo, que la temperatura de inyección no podía estar por debajo de 138 °C ya que no permitía el secado total del solvente. Finalmente, se establecieron las condiciones del DEE como se describe en las tablas 1 y 2.

Caracterización de las microcápsulas: variables respuesta del DEE

Los microencapsulados se caracterizaron mediante pruebas que permitieron evaluar las propiedades de mayor interés para el objetivo propuesto. Se evaluaron el rendimiento del proceso, la eficiencia de encapsulación, el tamaño de partícula y el índice de polidispersidad.

Rendimiento del proceso

Se calculó el rendimiento del proceso llevado a cabo por secado por aspersión de acuerdo con la ecuación 2:

Donde el peso de los componentes emulsificados corresponde a la masa de los biopolímeros y el aceite esencial adicionado en la emulsión sin tener en cuenta la masa de agua utilizada para preparar la dispersión de sólidos [³⁰].

Eficiencia de encapsulación

Para determinar la eficiencia de la encapsulación se realizó una extracción por ultrasonido (Ultrasonido, Cole-Parmer^®) a muestras de 1 g de microencapsulados, exactamente pesadas, durante una hora en 5,0 mL de acetato de etilo, luego se centrifugaron por 10 minutos a 8000 rpm (Ultracentrifuga, Megafuge 16 Thermo^®), posteriormente, se filtraron y completaron a volumen en balones aforados de 5,0 mL. Para su análisis, se preparó una dilución tomando 40 μL del filtrado y llevándolo a 1,0 mL en acetato de etilo; esta muestra se analizó mediante GC-MS/EI, según la metodología reportada previamente en la identificación del aceite esencial de tomillo.

Se realizó una semicuantificación siguiendo el método de estándar externo de único punto y normalización de áreas [³⁴], preparando dilución del aceite esencial puro como estándar de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente. La eficiencia de la encapsulación (EE por sus siglas en inglés, Encapsulation Efficiency) se calculó de acuerdo con la ecuación 3, mientras que la eficiencia de carga (LC por sus siglas en inglés, Loading Capacity) con la ecuación 4 [³⁵].

Contenido de aceite superficial

Para la determinación del aceite superficial se tomaron muestras exactamente pesadas de 500 mg de microcápsulas, las cuales se lavaron 5 veces con 1 mL de acetato de etilo, se filtraron y recuperaron para llevar a volumen de 5,0 mL [³⁰]. Para su análisis, se preparó una dilución tomando 40 μL del filtrado y llevándolo a 1,0 mL en acetato de etilo; esta muestra se analizó mediante cromatografía de gases acoplada a detector de masas, de igual forma que lo reportado previamente.

Tamaño de partícula e índice de dispersión

Parala determinación del tamaño de partícula de las microcápsulas obtenidas se empleó un equipo de dispersión de rayo láser Masterizer^® 3000, Malvern Panalytical, equipado con una unidad de dispersión de muestra húmeda, con un índice de refracción de 1,0 y precisión de ±1%, empleando agua como medio de transporte a 20 °C.

Las micropartículas se suspendieron en agua y se sometieron a la dispersión de luz empleando un láser de helio-neón a 633 nm y un ángulo de 173° utilizando una celda de alta concentración ZEN 1010. Se realizaron tres mediciones por muestra, en el mismo tiempo, con el fin de evitar el hinchamiento de los polímeros.

El índice de dispersión (Span) que indica la distribución del tamaño de las micropartículas y se calculó mediante la ecuación 5:

Donde:

Dv90= tamaño de partícula que poseen el 90% de las partículas.

Dv10= tamaño de partícula que poseen el 10% de las partículas.

Dv50= el tamaño del 50% de las partículas.

Análisis estadístico realizado a las variables cuantitativas derivadas del DEE

Se realizó un análisis de efectos principales y su significancia estadística (p>0,05) a partir de los resultados de las variables respuesta evaluadas, con el fin de encontrar la influencia de las variables de ensayo. De esta manera se definieron las condiciones de operación para la obtención del microencapsulado.

Evaluaciones realizadas a la formulación elaborada bajo las condiciones seleccionadas

A la formulación obtenida bajo las condiciones establecidas se le realizó una caracterización organoléptica y morfológica, un estudio de estabilidad, su comportamiento de liberación y se llevó a cabo su evaluación como posible promotor de crecimiento en un estudio de campo empleando pollos de engorde.

Caracterización organoléptica

Para definir las características organolépticas de las microcápsulas se determinaron los parámetros: color y aspecto mediante determinación visual, por observación directa de las muestras y se evaluó el olor.

Morfología

Se identificó la morfología mediante microscopía electrónica de barrido en un equipo Fei Quanta 200. Las superficies de las microcápsulas fueron recubiertas con oro a un grosor de aproximadamente 20 nm utilizando un sistema combinado de recubrimiento por sputter y por evaporación de carbón, Quorum Technologies Q150R ES.

Estudio de estabilidad

Se evaluaron 3 lotes del microencapsulado elaborados bajo las condiciones definidas, incluidos en viales de vidrio inerte con cierre hermético, que fueron colocados en una cabina de estabilidad (Cámara climatizada Memmert^® HPP750) a temperatura de 30 °C y 75 % de humedad relativa. Se realizaron muestreos en los siguientes tiempos: 0 h, 24 h, 72 h, 7 días y 20 días. Cada muestra fue procesada según la metodología descrita para el ensayo de eficiencia de encapsulación y se analizó mediante cromatografía de gases acoplada a detector de masas (Thermo^®, Trace 1300 Mainframe MS), siguiendo lo planteado para la identificación del aceite esencial de tomillo, mediante semi-cuantificación por el método de estándar externo de único punto y normalización de áreas.

Evaluación del comportamiento de liberación

Se emplearon dos métodos, uno basado en la pérdida de peso en función del tiempo a una temperatura específica y el otro fue un ensayo empleando un medio de disolución, en el que se cuantificó el aceite de tomillo liberado en función del tiempo.

Evaluación basada en la pérdida de peso

Se siguió una metodología similar a la realizada en un trabajo previo [³⁶]. Se pesaron aproximadamente 2,5 g de los microencapsulados por triplicado, los cuales se llevaron a una temperatura de 37 °C durante 3 h (Estufa universal, UN 55, Memmert GmbH + Co. KG), muestreando a los tiempos 0, 20, 40, 60, 90, 120 y 180 minutos. Se determinó el peso a cada tiempo evaluado y se calculó la diferencia del peso encontrado respecto al tiempo cero. Este valor corresponde a lo liberado de aceite de tomillo. Con los resultados se determinó la cinética de liberación, considerando el mejor ajuste al modelo, empleando las ecuaciones que se presentan en la tabla 3.

Tabla 3 Ecuaciones correspondientes a los modelos cinéticos de liberación. 

Evaluación basada en la cuantificación del aceite esencial de tomillo en un medio de disolución

Se dispersaron 3,2 g de las micropartículas en 3 mL en un medio que contenía buffer de acetato de sodio a pH 5,0 y polisorbato 40 al 0,03 %. Esta dispersión se introdujo en una bolsa de diálisis (membrana de acetato de celulosa con tamaño de poro de 12 kDa (Sigma)) que se sumergió en un vaso de precipitados que contenía 100 mL del medio de liberación, manteniendo la temperatura a 37 °C. El muestreo se hizo durante 3 h, tomando alícuotas de 5 mL en el medio receptor a los mismos tiempos evaluados en el ensayo anterior: 0, 20, 40, 60, 90, 120 y 180 minutos. Las condiciones establecidas buscaron simular las condiciones digestivas del pollo [³⁷, ³⁸]. Para la cuantificación del aceite esencial de tomillo se realizó una curva de calibración, siguiendo una metodología analítica por UV a 274,2 nm (UV-Vis 1800, Shimadzu) y en ella se interpolaron los resultados obtenidos. Como blanco se emplearon las microcápsulas vacías, a las que se les aplicó el mismo procedimiento empleado para las microcápsulas con el aceite de tomillo. Se evaluó el modelo cinético a que mejor se ajustaban los datos, de manera similar a lo explicado previamente y considerando las ecuaciones de la tabla 3. El montaje del ensayo se muestra en la figura 1.

Figura 1 Fotografía del montaje del ensayo de liberación empleando bolsa de diálisis. 

Evaluación del desempeño del microencapsulado de aceite esencial de tomillo en la producción de pollos de engorde

El estudio se realizó siguiendo una metodología similar a la reportada por [³⁹-⁴¹], en el municipio de Fusagasugá, Cundinamarca, vereda Usatama, el cual cuenta con las siguientes características agroclimatológicas: ubicado entre los 1550 a los 3050 m s.n.m, temperatura promedio 20 °C y humedad relativa media: 85 %. Se evaluaron un número total de 45 pollos de la raza Ross 308 AP, empleando un diseño experimental aleatorizado, distribuidos en tres tratamientos que consistían en 5 repeticiones con 3 aves por repetición, para un total de 15 pollos por tratamiento. El tratamiento 1 correspondió al grupo control (dieta basal), a los pollos se les dio el pienso sin incluir ningún promotor de crecimiento; el tratamiento 2, correspondió al pienso al que se le adicionaron 32 mg del microencapsulado que contenía el aceite de tomillo, considerando estudios recomendados por la literatura científica [⁴², ⁴³] y el porcentaje de encapsulación encontrado para el producto desarrollado; y el tratamiento 3 era el alimento comercial que contenía el promotor de crecimiento (control positivo). Los pollos (machos) de un día de edad se criaron hasta los 42 días y fueron alimentados con una dieta de iniciación (del día 1 al 21) y una de crecimiento (del día 22 al 42). Todas las aves se mantuvieron en condiciones similares de manejo durante todo el período experimental. Se proporcionó alimento y agua para consumo ad libitum. Durante los 42 días del estudio se determinó el peso y la ingesta de cada uno de los individuos. A partir de esta información se determinaron la ganancia de peso (GDP), el consumo de alimento acumulado (CAA) y la conversión alimenticia (CA). La mortalidad se registró diariamente para corregir los datos de conversión alimenticia.

La GDP se obtuvo por la diferencia entre los pesos iniciales y pesos finales. El CAA se calculó semanalmente a partir del peso del alimento sobrante de los comederos de cada tratamiento. Al peso del alimento inicial suministrado se le restó el peso final del alimento restante en comederos y a partir de eso se calculó el promedio acumulado semanal.

La CA se calculó mediante la ecuación 6 al cierre de cada semana.

Los resultados de la distribución de peso del pollo fueron graficados en función del tiempo, incluyendo todas las réplicas para observar la variabilidad entre tratamientos. Basado en los resultados se estableció un análisis estadístico para los datos de la GDP correspondientes al último tiempo de estudio de los 3 tratamientos, aplicando la ecuación 7:

Con estos resultados, se estableció la significancia del modelo, se realizó un Anova de una vía con una significancia del 5 %, previamente, se demostró la normalidad y homocedasticidad del modelo mediante las pruebas de Shapiro y Breush-Pagan, respectivamente.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Obtención y caracterización de los almidones de ñame nativo y lipofilizado

El rendimiento del proceso de extracción del almidón de ñame nativo fue de aproximadamente 20 %, siguiendo la metodología descrita. El material obtenido fue de color blanco grisáceo, libre de material extraño, olor y textura parecida a la del almidón de maíz y mantuvo estas características organolépticas luego de su modificación como se muestra en la figura 2.

Figura 2 Aspecto del almidón de ñame succinatado. 

Análisis por espectroscopia infrarroja (IR)

La modificación del almidón de ñame se confirmó mediante IR, comparando las diferencias entre los espectros del almidón nativo con el modificado, corroborando las interacciones entre el grupo OH de la glucosa y el grupo carboxilo del anhídrido tal como se presenta en la figura 3.

Figura 3 Espectro infrarrojo del almidón de ñame nativo y del almidón modificado (succinatado). 

En el espectro infrarrojo se observa la señal característica del almidón modificado, que corresponde a la vibración del grupo carbonilo (C=O) en la región de 1705,07 cm-1 perteneciente al carboxilo de la cabeza que queda libre del anhídrido succínico y que estaría ausente en el almidón nativo [⁴⁴-⁴⁷], así como la vibración del grupo (O-C=O) en la región de 1566,20 cm-1, resultado similar a lo encontrado por Matiz [²⁵].

Caracterización del aceite esencial de tomillo

Para efectos de control de calidad (y para la posterior cuantificación del aceite retenido en las microcápsulas) se realizó el análisis de cromatografía GC-MS/EI al aceite esencial de tomillo, que permitió identificar 24 componentes. El perfil de composición se presenta en la tabla 5, en el que se identifica como componente principal al d-limoneno, por lo cual fue seleccionado como marcador analítico. La figura 4 muestra el cromatograma correspondiente.

Figura 4 Cromatograma obtenido mediante GC/MS con impacto electrónico del análisis del aceite esencial de tomillo (20 μL/980 μL). 

De acuerdo con estos resultados, la composición química identificada corresponde a un quimiotipo de Thymus Vulgaris, que hasta la fecha no ha sido reportado, al cual nombraremos quimiotipo D-limoneno, ya que es el monoterpeno dominante en este aceite esencial. Los diferentes quimiotipos de aceite esencial de tomillo se presentan dependiendo del suelo, del clima, de la época y tiempo de recolección, entre otros aspectos que inciden en la existencia de estos polimorfismos químicos [⁴⁸]. Los quimiotipos más comunes que se han identificado previamente corresponden a geraniol, a-terpineol, tuyanol-4, linalol, carvacrol, timol, 1,8-cineol [⁴⁹-⁵¹], borneol, hidrato de sabineno y ciclocitral/verbenol [⁵²].

Condiciones de preparación y caracterización de las emulsiones

Las condiciones de emulsificación determinadas se describen en la tabla 6. Los dos tipos de matriz definidos, GA/M y GA/M/AÑS, permitieron la emulsificación del aceite. La relación de fases oleosa/acuosa que emulsificó fue 1:6. La velocidad de homogenización adecuada fue de 13 000 rpm y el tiempo entre 15 y 20 min. La viscosidad de ambas emulsiones se encontraba muy por debajo del límite máximo permitido (300 Cp) para la alimentación en el equipo de secado por aspersión.

El aspecto visual observado de los sistemas en los que se obtuvo una emulsión fue adecuado, sin evidenciar separación de fases durante 24 h ni gotículas de aceite sin emulsificar. No obstante, al cabo de 7 días sí se evidenció la separación de fases durante el almacenamiento, a temperatura ambiente y de refrigeración, esto fue más evidente en la medida que transcurría más tiempo (resultados no mostrados). Cabe anotar que con la agitación mecánica se logró dispersar nuevamente las fases separadas. La elevada concentración de los biopolímeros lograda en los sistemas que emulsificaron con relación al aceite esencial de tomillo (relación 1:6) es una ventaja importante porque es uno de los factores que contribuyen a tener eficiencias de encapsulación más altas, debido a al mayor número de interacciones intermoleculares que se presentan entre los biopolímeros y el aceite esencial, de acuerdo con lo reportado por otros autores [⁵³].

Microencapsulación y caracterización

De acuerdo con lo planteado en la metodología, aplicando el DEE 2⁵, se obtuvieron los resultados de las variables respuesta que se presentan en la tabla 7.

Tabla 7 Resultados de las variables respuesta asociadas al diseño estadístico experimental. 

GA: goma arábiga, M: maltodextrina, AÑS: almidón de ñame succinatado, TEMP: temperatura, REND: rendimiento, EE: eficiencia de encapsulación, DV90: tamaño de partícula, Span: índice de dispersión.

El análisis estadístico realizado demostró que la variable de ensayo que tiene una influencia estadística significativa con un p<0,05, es el tipo de matriz polimérica. Las demás variables de ensayo no tienen una influencia estadísticamente significativa en las variables respuesta, como se muestra en la figura 5.

Figura 5 Diagramas de Pareto en los que se relaciona las variables del ensayo sobre cada una de las cuatro variables respuesta. A: matriz polimérica; B: flujo de nitrógeno; C: flujo de aspiración; D: flujo de alimentación y E: temperatura de inyección. 

De esta manera, considerando el efecto deseado para cada variable respuesta, de acuerdo con el tipo de producto a desarrollar (tabla 8) y su significancia estadística (figura 5), se eligieron las condiciones señaladas por el DEE para la variable de ensayo A. Las demás no presentaron un efecto estadísticamente significativo, el nivel elegido dependió del efecto deseado. Así, la variable A quedó definida en su nivel superior que corresponde a la matriz GA/M/AÑS. La variable B cuando está en su nivel superior favorece el aumento del rendimiento (se busca que sea el más alto posible), la eficiencia de encapsulación (el interés es que sea alta) y el tamaño de partícula (que sea lo más grande posible). Las variables C y D, si están en un nivel inferior, favorecen el aumento de las variables-respuesta mencionadas. En cuanto a la variable E, se eligió en su valor inferior considerando que favorece el efecto deseado para tres de las cuatro variables respuesta. Este mismo criterio, de favorecer el mayor número de variables respuesta de acuerdo con el efecto deseado se consideró para el resto de las variables del ensayo.

Tabla 8 Resumen de la significancia estadística de cada variable de ensayo y del efecto deseado para cada variable respuesta. 

: aumento de la variable; : disminución de la variable; No: la variable de ensayo no tiene efecto estadísticamente significativo sobre la variable respuesta; +: la variable de ensayo tiene efecto estadísticamente significativo sobre la variable respuesta.

A partir del análisis estadístico se establecieron como condiciones de la formulación y del proceso las siguientes: matriz del microencapsulado G/M/AÑS (nivel +), flujo de nitrógeno 601 L/h (nivel +), flujo de aspiración 32 m³/h (nivel -), flujo de alimentación 3 mL/min (nivel -) y temperatura de inyección 138 °C (nivel -) que coincidieron con las del experimento 7 del DEE.

Los resultados correspondientes a las propiedades evaluadas para la formulación 7 muestran un rendimiento adecuado, una alta eficiencia de encapsulación, un tamaño de partícula grande y un índice de dispersión no tan alto. De acuerdo con lo discutido previamente, este comportamiento era el deseado. La alta eficiencia de encapsulación lograda (87,5%), refleja una muy buena interacción de los biopolímeros, dentro de los que se destaca al AÑS, que al incorporar una larga cadena hidrocarbonada en su estructura lo hace más lipofílico, haciendo posible que el aceite quede incluido en la micropartícula en una mayor proporción, al tener una naturaleza química similar entre ellos [⁵⁴]. Porcentajes menores de encapsulación, señalados entre paréntesis, se encontraron con otro tipo de aceites y para diferentes condiciones de emulsificación y secado por aspersión, empleando como material de pared: a la GA-M (79 %) [¹⁵], GA-M (45,45 %) [¹⁸], valor que mejoraba si en vez de GA se incluía un almidón modificado lipofilizado (60,22 %) [¹⁸], GA (36,34 %) [³⁰] y GA-M (75,5 %) [⁵⁵]. Estos resultados son variados y dependen de la composición del tipo de aceite que se quiera encapsular, algunos resultados pueden ser parecidos [¹⁵] y [⁵⁵] y otros muy diferentes [¹⁸], a pesar de emplear los mismos materiales de pared. De manera similar a la tendencia encontrada en el presente estudio, la inclusión de un almidón modificado lipofilizado mejora el porcentaje de encapsulación, lo que confirma la importancia de las interacciones intermoleculares entre el aceite a encapsular y él o los biopolímero(s) que haga(n) parte del material de la microcápsula.

Evaluaciones realizadas a la formulación elaborada bajo las condiciones seleccionadas

A continuación, se presentan los ensayos realizados a las micropartículas obtenidas bajo las condiciones definidas previamente, de acuerdo con lo planteado en la metodología.

Caracterización organoléptica y morfología

Los microencapsulados elaborados bajo las condiciones seleccionadas fueron de color blanco, textura de polvo suelto y olor característico a aceite de tomillo. En la figura 6 se pueden observar las imágenes tomadas mediante microscopía electrónica de barrido, en la que se define una morfología ovoide tendiente a esférica, como es lo esperado para la obtención de micropartículas por secado por aspersión [⁵⁴]. Se evidencia la presencia de aceite en su interior.

Figura 6 Aspecto de las micropartículas que contienen aceite esencial de tomillo visualizadas por microscopía electrónica de barrido. 

Estudio de estabilidad

En la figura 7 se presentan los resultados de la variación de la concentración de D-limoneno. en los sistemas microparticulados en función del tiempo para los tres lotes evaluados.

Figura 7 Resultados de la variación de la concentración de D-limoneno incluido en las micropartí-culas, en función del tiempo. 

De acuerdo con los resultados del estudio, se estableció que el máximo porcentaje en el que se disminuyó la concentración fue de 45,1 %, que corresponde a lo ocurrido en el día 20 con el lote 3. Para los lotes 1 y 2, estos valores fueron de 36,5 % y 37,7 %, respectivamente. Los resultados mostraron que en los cromatogramas se mantiene la señal de los componentes principales del aceite esencial de tomillo y aparecen algunas otras señales posiblemente relacionadas con productos de degradación (en muy bajas proporciones), que no fueron identificadas (resultados no mostrados). La disminución en la concentración podría atribuirse a la degradación de los compuestos presentes en el aceite, aunque se presume que esto ocurrió en baja proporción de acuerdo con lo descrito anteriormente, mientras una gran parte del aceite esencial de tomillo posiblemente se volatilizó.

En la literatura científica se evidencian comportamientos similares con compuestos volátiles microencapsulados, que al incluirlos dentro de un sistema reservorio, hace que las paredes sólidas que se forman debida a los biopolímeros aumenten su estabilidad, regulando la liberación del aceite esencial y por lo tanto reduciendo la evaporación [⁵⁵].

Evaluación del comportamiento de liberación

De acuerdo con lo planteado en la metodología se realizaron dos tipos de ensayos: uno basado en la pérdida de peso y el otro mediante cuantificación del aceite de tomillo empleando un medio de disolución.

Evaluación basada en la pérdida de peso

Este ensayo es una manera sencilla y de algún modo preliminar de mostrar que la liberación del aceite de tomillo se va dando paulatinamente en función del tiempo. Como se observa en la gráfica de la figura 8, se alcanza un máximo de pérdida de peso, que corresponde al aceite de tomillo volatilizado, de alrededor de 25 % en un lapso de 3 h, lo que indicaría que la pared de la microcápsula sí está ejerciendo una protección a la volatilización o en otras palabras sí se está dando una modulación de la liberación. Desde lo planteado existen dos miradas para analizar lo sucedido: una desde la óptica de la estabilidad física y la protección que está brindando el sistema al aceite de tomillo incluido en él, disminuyendo su velocidad de volatilización a pesar de que el microencapsulado se está sometiendo a 37 °C de temperatura (simulando una temperatura fisiológica) y sin envase alguno; y la otra mirada es desde su comportamiento de liberación, que como se mencionó se está presentando un control de este parámetro, que se refleja en la pérdida del 25 %; si no hubiera una modulación de la liberación se podría estar evidenciando un 100 % de pérdida de peso en un lapso de 30 min.

Figura 8 Comportamiento de la pérdida de peso de los sistemas (aceite volatilizado) en función del tiempo. 

Los datos presentan un ajuste lineal, reflejando una cinética de orden cero con un R² de 0,9938 y una constante de velocidad de liberación de 0,129 mg/min. No se evaluaron los modelos de Higuchi y Korsmeyer-Peppas, debido al bajo porcentaje liberado. Estos parámetros son propios del sistema desarrollado y demuestran que la liberación se está dando independientemente de la cantidad de aceite esencial que vaya quedando dentro de la micropartícula, en otras palabras, que el control en la pérdida que se está dando depende de la barrera propia del sistema reservorio.

Evaluación basada en la cuantificación del aceite de tomillo en un medio de disolución

El comportamiento de la liberación del aceite de tomillo a partir del sistema microparticulado se muestra en la figura 9. A diferencia del estudio por pérdida de peso, en este caso las partículas entran en contacto con un medio de disolución, simulando las condiciones fisiológicas del ave, por lo que se alcanza cerca del 100% de aceite de tomillo liberado durante el tiempo de estudio.

Figura 9 Comportamiento de la liberación del aceite de tomillo a partir de las micropartículas en función del tiempo. 

En la tabla 9 se muestran los parámetros derivados de evaluar el ajuste a los modelos cinéticos señalados en la metodología. Para cada modelo cinético se presenta su coeficiente de determinación y la constante de velocidad de liberación correspondiente. Los mejores ajustes se dan con los modelos de Higuchi y Korsmeyer-Peppas. Esto implica que la difusión es uno de los mecanismos importantes que gobiernan el proceso de liberación. El valor del exponente n del modelo de Korsmeyer-Peppas, revela que la liberación se está dando de manera anómala, es decir, una combinación de difusión e hinchamiento [⁵⁶]

Estos resultados muestran una modulación en la liberación durante las 3 h del estudio, lo que lleva a sugerir que el producto podría comportarse adecuadamente in vivo.

Evaluación del desempeño del microencapsulado de aceite de tomillo en la producción de pollos de engorde

La distribución de peso en función del tiempo, de todos los resultados experimentales se presentan en la figura 10, en la que se observa que los tres tratamientos tienen una distribución de datos similar, destacándose una mayor variabilidad en los datos del tratamiento 3. Se observa que el crecimiento de los pollos a lo largo de tiempo se ajusta a un modelo exponencial y existe una mayor variabilidad en los pesos de los últimos días.

Figura 10 Distribución de peso de los pollos en función del tiempo para cada tratamiento. 

Para evidenciar si estas diferencias son estadísticamente significativas se realizó un análisis de varianza (Anova) de la GDP al tiempo 42, de acuerdo con lo planteado en la metodología. Se encuentra que los tratamientos 2 y 3 son estadísticamente diferentes con el tratamiento 1, mientras los tratamientos 2 y 3 son similares estadísticamente entre ellos. Al existir una diferencia con el tratamiento 1, que es el grupo al que no se le administró promotor de crecimiento, se demuestra que tanto el producto en estudio (tratamiento 2) como el producto comercial (tratamiento 3) influyen en el aumento de peso del pollo, por lo que se estaría evidenciando la actividad del microencapsulado con aceite de tomillo como promotor de crecimiento. Adicionalmente, en las tablas 10 y 11 se presentan los resultados de la CA y del CAA.

Como era de esperarse para la CA este valor tiende a aumentar en función del tiempo, y se presenta un comportamiento diferente de la semana 2 a la 4 para el tratamiento 2, tiempo durante el cual la CA es mayor en comparación con los otros dos tratamientos. Respecto al CAA, los resultados muestran un menor valor para el tratamiento 2, es decir hubo un menor consumo de alimento, sin embargo, en la figura 10 se evidenció que el comportamiento del peso a lo largo del tiempo fue similar a los tratamientos 1 y 3. Estos resultados sugieren que los pollos del tratamiento 2 presentan un mayor aprovechamiento de los nutrientes. Se ha reportado que el tomillo tiene beneficios en la producción de aves de corral [⁵⁷-⁵⁹]lo cual es de esperarse dado la actividad antimicrobiana de este que hace que se disminuyan la pérdida de nutrientes por la presencia de microorganismos, modificando la flora intestinal como lo han reportado algunos autores [⁴²].