Desarrollo y optimizacion de una metodologia multiresiduo por metodo Simplex para el analisis de plaguicidas en miel de abejas

Development and optimization of a multiresidue method for pesticide analysis in honey bee using Simplex method

Desenvlovimiento e otimização de uma metodologia de resíduos múltiplos para o método Simplex para a análise de pesticidas em abelhas

Danny Rodriguez¹, Amanda C. Diaz², Diego A. Ahumada¹, Jairo A. Guerrero¹*

¹ Laboratorio de Analisis de Residuos de Plaguicidas, Departamento de Quimica, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, sede Bogota, Crr. 30 No. 45-03, Bogota D.C., Colombia.
² Instituto de Ciencia y Tecnologia de Alimentos-ICTA. Universidad Nacional de Colombia, Bogota D.C., Colombia.
* Autor para correspondencia: jaguerreod@unal.edu.co

Recibido: 15 de enero de 2013 • Aceptado: 15 de abril de 2013

Resumen

La aplicacion de plaguicidas en cultivos cercanos a las zonas de produccion apicola puede afectar la supervivencia de las abejas y la calidad de los productos derivados de la colmena; por tanto, es de gran importancia realizar estudios de residualidad de estos agroquimicos en mieles y otros productos apicolas. Para esto es indispensable desarrollar metodologias que permitan detectar y cuantificar la presencia de estos contaminantes en los productos apicolas. Este trabajo muestra los resultados del desarrollo y optimizacion de una metodologia multiresiduo para el analisis de 30 plaguicidas en miel de abejas (organoclorados, organofosforados y piretroides). El metodo consistio en una extraccion liquido-liquido, seguida de un paso de limpieza en fase solida usando una columna cargada con silica gel/florisil. El analisis de los plaguicidas fue realizado por cromatografia de gases con detectores de nitrogeno fosforo (NPD) y microcaptura electronica (μ-ECD). La optimizacion de las variables experimentales presentes en los pasos de pre-tratamiento, extraccion y limpieza se realizo mediante el empleo del metodo Simplex modificado. Con este fin, se escogieron 14 variables las cuales se optimizaron en 21 experimentos. Los resultados mostraron que los porcentajes de recuperacion obtenidos para la mayoria de los plaguicidas se encuentran entre 78.8% y 114.5%, con coeficientes de variacion inferiores al 20%.

Pesticide application near to beekeeping areas can affect the survival of the bees and the quality of the products derived of the hive, therefore it is of great importance to assess the residual of these agrochemicals in honey and other bee products. So many methods have been developed for determining pesticide residues in honey samples. Thus, a multi-residue method to determine 30 pesticides in honey bee (organochlorine, organophosphorus, and pyrethroids) has been developed and optimized. The method is based on a liquid–liquid extraction followed by a clean-up step on a silica gel/florisil solidphase column. Pesticides were determined by gas chromatography with micro-electron capture (μ-ECD) and nitrogen phosphorus detection (NPD). The optimization process was performed using the modified Simplex method, to make this 14 variables were chosen and the optimization was conducted in 21 experiments. The results indicated that the method show recoveries between 78.8 and 114.5% and coefficients of variation below 20%.

Keywords: Honey, pollution, pesticides, Simplex.

Resumo

A aplicação de pesticidas em áreas de cultivo próximos a apicultura pode afetar a sobrevivência das abelhas e a qualidade dos produtos da colmeia, por isso é muito importante estudar o efeito residual destes produtos químicos no mel e outros produtos apícolas. Para isso é essencial para o desenvolvimento de metodologias para a análise de contaminantes em produtos de abelha. Este documento mostra os resultados para o desenvolvimento e optimização de um método de resíduos múltiplos para a análise de 30 pesticidas, incluindo pesticidas organoclorados, organofosforados e piretróides mel. O método consistiu em uma extracção líquido-líquido, seguido por uma etapa de limpeza, usando uma coluna de fase sólida, cheia de gel de sílica/florisil. Análise de pesticidas foi realizada por cromatografia gasosa com detector de nitrogênio e fósforo (NPD) e microcaptura eletrônico (μ-ECD). A optimização das variáveis experimentais presentes nas etapas de pré-tratamento, de extracção e limpeza foi efectuada por utilização do método simplex modificado. Para o efeito, foram escolhidas 14 variáveis que foram optimizadas em 21 experiências. Os resultados mostraram que as recuperações obtidas para a maioria dos pesticidas estão entre 78,8% e 114,5%, com coeficientes de variação inferiores a 20%.

Palavras-chave: Mel, poluição, agrotóxicos, Simplex.

Introducción

En la actualidad, la contaminacion ambiental es una de las areas de mayor investigacion por parte de la comunidad cientifica, asi como uno de los principales temas de discusion en las diferentes organizaciones y/o entidades gubernamentales que, dia a dia, emiten nuevas legislaciones en pro de la conservacion de los recursos naturales y la proteccion de la flora y fauna. Adicionalmente, el creciente interes por el consumo de productos inocuos ha inducido a que muchos grupos de investigacion centren sus esfuerzos en evaluar la presencia de contaminantes en los alimentos de origen agropecuario, a traves de una amplia variedad de herramientas analiticas desarrolladas para identificar y cuantificar la presencia de estas moleculas en dichas matrices.

Los alimentos de origen natural, como los productos apicolas, ademas de hacer parte de la dieta humana, se utilizan como bioindicadores ambientales debido a que diversos estudios demuestran que las abejas, en el proceso de recoleccion de nectar, transportan una amplia variedad de contaminantes presentes en la zona que son almacenados y concentrados en la colmena (1). En consecuencia, los productos derivados de la colmena, como la miel, se contaminan con residuos de diversos plaguicidas (2). Adicionalmente, el uso de productos quimicos para el control de enfermedades en la colmena es otra fuente importante de contaminantes en los productos apicolas (1, 3). A fin de impedir que mieles contaminadas afecten a los consumidores, algunas organizaciones han establecido limites maximos de residuos para un extenso numero de plaguicidas en este alimento (4).

Este panorama ha promovido el desarrollo de metodos multiresiduo que permiten la determinacion simultanea de mas de un residuo en una extraccion simple, reduciendo el tiempo de analisis y el consumo de solventes (3, 5). Para obtener el mejor desempeno de una metodologia multiresiduo es indispensable realizar la optimizacion de las variables experimentales involucradas. Para este fin, se pueden emplear metodos de optimizacion auto-dirigidos, como el metodo Simplex, que permite estudiar y mejorar un proceso de extraccion multiresiduo que involucra mas de una variable experimental, teniendo en cuenta las posibles interacciones entre las mismas y con un numero de ensayos razonable, respecto a otros metodos de optimizacion (6).

El metodo Simplex ha sido utilizado ampliamente para la optimizacion inequivoca de diferentes procedimientos analiticos; particularmente en aquellos casos en los que existe interdependencia entre las variables que se desean optimizar. En comparacion con otros metodos de optimizacion, que se basan en disenos experimentales o superficies de respuestas, el metodo Simplex generalmente permite llegar al punto optimo de forma mas simple y rapida. Por estos motivos este metodo se ha empleado exitosamente en la optimizacion de diversos sistemas: condiciones de operacion de instrumentacion analitica (7), metodos de separacion cromatografica (8), cristalizacion de proteinas (9), extraccion de contaminantes en suelos mediante fluidos supercriticos (10), entre otros usos.

De esta manera, el presente trabajo describe los resultados obtenidos en el desarrollo de una metodologia multiresiduo para el analisis de plaguicidas en miel de abejas y su posterior optimizacion mediante el metodo Simplex. La metodologia se basa en una extraccion con metanol/acetato de etilo, limpieza con florisil/silica y analisis cromatografico mediante GC/μ-ECD/NPD.

Materiales y métodos

Materiales de referencia, reactivos y soluciones

Se trabajo con estandares de plaguicidas de pureza mayor al 95%, proveniente de las casas comerciales Dr. Ehrenstorfer y Chemservice. Las soluciones madre fueron preparadas en concentraciones cercanas a 1000 μg/mL en acetato de etilo y almacenadas en frascos ambar a –20°C. La mezcla de plaguicidas se preparo tomando diferentes volumenes de cada una de las soluciones madre hasta obtener las concentraciones que se presentan en la Tabla 1. Esta solucion se almaceno en un frasco ambar a –20°C. Los solventes empleados en este estudio fueron J.T. Baker grado HPLC y grado residuos.El florisil y la silica empleados corresponden a grado residuos (60-100 mesh), activados previamente con calentamiento a 150°C por 4 horas. El sulfato de sodio anhidro (12-60 mesh) igualmente fue secado a 150°C por 4 horas.

Instrumentos y equipos

La extraccion se realizo en un agitador de rotacion universal marca Heidolph modelo Reax-2^®. La determinacion y cuantificacion de los plaguicidas se realizo en un cromatografo de gases HP6890^®plus, equipado con un inyector automatico 7683 Agilent Technologies (Palo Alto, CA, EE.UU.) con control electronico de presion y un inyector spli /splitless, el cual se conecto a traves de una columna capilar sin fase estacionaria (1 m; 0.32 mm d.i.) a un divisor de flujo de cuarzo en forma de 'Y', unido a una columna capilar HP-5 (30 m; 0.32 mm d.i.; 0.25 μm) acoplada a un detector de micro-captura electronica ⁶³Ni (μ-ECD) y a una columna capilar HP-50 (30 m; 0.32 mm d.i.; 0.25 μm) acoplada a un detector de nitrogeno-fosforo (NPD) en paralelo. Las condiciones de operacion fueron: gas de transporte nitrogeno, volumen de inyeccion 2 μL, temperatura del inyector de 256 °C, inyeccion en modo splitless pulsado con presion de pulso de 152 kPa durante 0.8 min, tiempo de purga de 0.6 min y flujo de purga de 40 mL/min. La temperatura del detector μ-ECD fue de 310°C con flujo de gas auxiliar (nitrogeno) de 10 mL/min. El detector NPD se trabajo a 330°C con flujos constantes de gas auxiliar (nitrogeno), hidrogeno y aire de 3,10 y 60 mL/min, respectivamente. El programa de temperatura del horno inicio a 52°C (0 min), incrementandose la temperatura a una velocidad de 4°C/min hasta alcanzar 100°C, consecutivamente se aumento la temperatura hasta 110°C a 2°C/min, a continuacion se incremento. hasta 130°C a una velocidad de 20°C/min, luego se llevo hasta 195°C a 4°C/min y finalmente se llego a una temperatura de 280°C a una velocidad de 5°C/min.

Desarrollo de la metodología

Se utilizo una muestra blanco compuesta por mieles provenientes de cuatro regiones de Colombia. Estas muestras de miel fueron cosechadas en regiones donde las aplicaciones de plaguicidas son muy bajas o nulas. Fueron analizadas por cromatografia de gases y se confirmo que no presentaban presencia de ninguno de los plaguicidas en estudio.

Para la fortificacion de las muestras, se pesaron 1000 g de miel blanco en un tubo de fondo conico de 50 mL, se adicionaron 32 μL de la mezcla de plaguicidas que se presenta en la Tabla 1 y, posteriormente, se dejaron las muestras en reposo por un tiempo de 20 min con el proposito de permitir la evaporacion del solvente.

Pre-tratamiento. Esta etapa consistia en disolver la miel con el proposito de reducir su viscosidad y mejorar la extraccion de los plaguicidas. Para esto, se ensayo la adicion de diferentes cantidades de metanol, 1 mL de agua, 1mL de buffer de citratos (pH 5.5 y concentracion de 0,15 g/mL) y/o 1 mL de buffer de citratos (pH 5.5 y concentracion de 0.15 g/ mL) con cloruro de sodio (0.5 g/mL).

Extraccion. Se realizaron diferentes ensayos en los que se evaluaron variasfases extractantes, tales como acetato de etilo, metanol, hexano o mezclas acetato de etilo:n-hexano (3:2, 4:1) y acetato de etilo:metanol (4:1, 1:1 y 1:4); en esta evaluacion se encontro que la fase extractante que mejores resultados ofrecia corresponde al acetato de etilo; así mismo, en estos ensayos se encontro que al realizar una doble extraccion se obtiene el mayor numero de compuestos con porcentajes de recuperacion superiores al 70% (11). De esta manera, la extraccion se realizo como se detalla a continuacion: la primera extraccion se realizo con 10 mL de acetato de etilo y agitacion mecanica por 15 min. Posterior a ello, se centrifugo la mezcla de extraccion y se recolecto la fase organica en un balon pera. Para la segunda etapa de extraccion se adicionaron 5 mL de acetato de etilo y se dejo nuevamente en agitacion. Se centrifugo la mezcla de extraccion y se recolecto la fase organica para ser combinada con el extracto de la primera extraccion. Se concentro la mezcla en un rota-evaporador hasta obtener aproximadamente 1mL de extracto y se adicionaron 2 g de sulfato de sodio anhidro.

Limpieza. La limpieza de los extractos se realizo mediante el empleo de dos tecnicas, la primera correspondio a cromatografia de permeacion en gel (CPG), cuyas condiciones se encuentran reportadas en otros estudios (12). La segunda tecnica que se empleo correspondio a cromatografia clasica en columna (CCC), para lo cual se evaluaron distintas fases moviles y diferentes fases adsorbentes. El procedimiento general para esta tecnica se detalla a continuacion: al interior de una columna de vidrio con llave para el control del flujo y un tapon de algodon ubicado en la parte inferior, se adicionaron 10 mL de n-hexano. A continuacion se agregaron en la columna 2 g de sulfato de sodio anhidro, 2 g de fase estacionaria (silica gel desactivada y/o florisil) y 3 g de sulfato de sodio anhidro, de tal forma que no quedaran burbujas de aire. El nhexano en exceso se expulso de la columna sin permitir que la fase solida se secara. Se cargo la columna con el extracto organico y se eluyo con la fase movil a evaluar. El extracto se concentro en el rota evaporador hasta alcanzar un volumen aproximado de 0.2 mL y luego se llevo a un volumen de 1.0 mL

Optimización de la metodología

La construccion del Simplex de partida se realizo con base en los resultados experimentales obtenidos a partir de los ensayos llevados a cabo en el desarrollo de la metodologia, siguiendo el metodo descrito en la literatura (7, 13). La Tabla 2 muestra las variables experimentales seleccionadas (k = 14), el tamano de paso y las condiciones de referencia utilizadas para la construccion del Simplex de partida.

Resultados y discusión

Desarrollo de la metodología: pre-tratamiento y extracción

En el caso de la miel de abejas, algunos reportes de literatura concuerdan en que, durante el proceso de extraccion liquido-liquido (ELL), es posible aumentar el porcentaje de recuperacion de un amplio numero de plaguicidas (14). Una de las principales opciones consiste en la disolucion previa de la miel de abejas en agua o en metanol. En este sentido, se decidio ensayar la adicion de metanol en el paso de pre-tratamiento con el proposito de mejorar la recuperacion de algunos compuestos, respecto a los resultados obtenidos de la ELL directa con diversos solventes (11). La Figura 1 presenta un resumen de los resultados obtenidos en el pre-tratamiento con metanol previo a la extraccion para los 30 plaguicidas bajo estudio en miel.

La Figura 1 muestra que la adicion de metanol durante la fase de pre-tratamiento de la miel, aumenta el numero de plaguicidas extraidos con porcentajes de recuperacion entre 70% y 120%. Esto se debe a la reduccion de la viscosidad de la miel cuando es disuelta en metanol, lo cual facilita el contacto entre la matriz y el solvente de extraccion; adicionalmente, la presencia de metanol durante el proceso de extraccion aumenta la polaridad de la fase extractante, lo que permite recuperar un mayor numero de plaguicidas polares y medianamente polares. La Figura 1 muestra, asi mismo, que los mejores desempenos se alcanzaron al usar 3 mL de metanol, siendo mas eficiente la adicion de 1,5 mL de metanol antes de la primera extraccion y 1,5 mL de metanol antes de la segunda extraccion. Por ultimo, se observa que adiciones superiores a 3 mL de metanol generan un descenso en el numero de plaguicidas recuperados, lo cual se atribuye a la co-extraccion de compuestos de la matriz que interfieren en la deteccion mediante μ-ECD que impiden identificar y cuantificar algunos plaguicidas como 4,4'-DDT, heptenofos, diclorvos, cimoxanil, α-HCH, β-HCH, dimetoato, clorotalonil, metilparation y profenofos.

Estos ensayos presentan un bajo desempeno en la extraccion de los plaguicidas organoclorados, razon por la cual se decidio realizar una modificacion en la constante dielectrica del medio en la etapa de pretratamiento. Esta modificacion se realizo mediante la adicion de 1 mL de agua, 1 mL de buffer de citratos (pH 5.5 y concentracion de 0.15 g/ mL) y 1mL de buffer de citratos (pH 5.5 y concentracion de 0.15 g/mL) con cloruro de sodio (0.5 g/mL); estos resultados tambien se presentan en la Figura 1.

Adicionalmente, la Figura 1 permite observar que los pre-tratamientos con agua y con buffer citratos/NaCl mostraron un buen desempeno; sin embargo, la extraccion con buffer citrato ofrecio el mayor numero de plaguicidas con porcentajes de recuperacion entre 70% y 120%. Esto se explica porque la adicion del buffer regula el pH y evita perdidas por hidrolisis de algunos plaguicidas, los cuales, por lo general son estables bajo condiciones similares en un rango de pH entre 5 y 7; adicionalmente, esta fase reduce la viscosidad de la miel lo que facilita el proceso de transporte de los plaguicidas desde la matriz hasta la fase extractante.

De esta manera, la metodologia de pre-tratamiento y la extraccion incluyen la adicion de 1.5 mL de metanol previo a la adicion del acetato de etilo (en cada una de las etapas), la adicion de 1 mL de buffer de citratos (pH = 5.5 y concentracion = 0.15 g/mL), adicion de 10 mL de acetato de etilo en la primera extraccion, agitacion durante 15 min, centrifugacion, una segunda extraccion con 5 mL de acetato de etilo, agitacion por 15 min y centrifugacion. Finalmente, se reunen los dos extractos de acetato de etilo, se concentran hasta aproximadamente 1 mL en un evaporador rotatorio y se someten al proceso de limpieza.

Bajo las condiciones citadas previamente se presentaron algunos inconvenientes tales como la perdida de los plaguicidas polares heptenofos, diclorvos, metamidofos, acefato, cimoxanil y monocrotofos; ademas, se dificulto la identificacion y cuantificacion de los compuestos organoclorados α-HCH, β-HCH, endosulfan α y endosulfan β por la elucion de interferentes. Por lo tanto, se decidio implementar un proceso de limpieza con el proposito de reducir algunas de estas limitaciones.

Desarrollo de la metodología: limpieza

En analisis de residuos de plaguicidas, la limpieza de los extractos previa al analisis instrumental es uno de los pasos determinantes en el desarrollo de una metodologia analitica. Las tecnicas mas empleadas para esta etapa corresponden a la extraccion liquido-liquido (ELL), extraccion en fase solida (EFS), cromatografia en columna clasica (CCC) y cromatografia de permeacion en geles (CPG). Debido a la constante dielectrica del acetato de etilo y la diversidad de propiedades fisicoquimicas de los analitos, se decidio no emplear la ELL como metodo de limpieza, pues es una de las tecnicas que presentan menor eficiencia (15). Por otro lado, la EFS con cartuchos se descarto por los costos que implica, pues no se pueden emplear fases estacionarias convencionales, sino que, de acuerdo a algunas publicaciones, se emplean fases estacionarias modificadas (15-17). Por lo anterior, se decidio evaluar la CPG y la CCC como tecnicas de limpieza.

Los resultados mostraron que mediante CPG se obtenian porcentajes de recuperacion aceptables para la mayoria de los plaguicidas evaluados; sin embargo, en el detector de μ-ECD se presentaba una gran cantidad de interferentes que imposibilitan el analisis de algunos compuestos como: heptenofos, diclorvos, cimoxanil, α-HCH, β-HCH dimetoato, clorotalonil, clorpirifos, metilparation y fenitrotion; por lo cual el empleo de CPG fue descartado.

La evaluacion de CCC se realizo para diferentes combinaciones de fase estacionaria y fase movil, las cuales se escogieron de acuerdo a reportes de literatura (3, 14, 18). Algunas de las fases moviles ensayadas corresponden a: acetonitrilo, n-hexano, acetato de etilo, mezclas de acetato de etilo/n-hexano y acetato de etilo/metanol. El mejor desempeno durante la evaluacion de la limpieza por CCC se obtuvo al realizar la elucion con 15 mL de acetato de etilo/n-hexano (1:1).

La Figura 2 resume los resultados de los diferentes ensayos de limpieza. Esta figura muestra que: i) las tres fases estacionarias permiten obtener porcentajes de recuperacion en el rango de aceptacion de la Union Europea; no obstante, la fase estacionaria conformada por Silica/ Florisil (1:1) presenta un mayor numero de compuestos con porcentajes de recuperacion dentro de este rango, en comparacion con las demas fases; ii) el numero de compuestos con porcentajes de recuperacion entre 70% y 120% obtenidos con CPG es el mas bajo debido al gran numero de interferencias presentes durante la evaluacion cromatografica; iii) el desempeno de la silica durante la limpieza es ligeramente inferior al del Florisil, lo cual se debe a que esta ultima fase estacionaria es capaz de retener un mayor contenido de moleculas polares, entre estos los azucares.

De acuerdo a los resultados mostrados en la Figura 2, el mayor numero de compuestos con mejores porcentajes de recuperacion se obtienen al emplear 2 g de Florisil/silica (1:1) como fase estacionaria y 15 mL de n-hexano-acetato de etilo (1:1)como solvente de elucion.

Finalmente, como resultado de los experimentos llevados a cabo en el desarrollo de la metodologia, las tres fases que la componen son: i) pre-tratamiento de la miel, la cual consiste en la disolucion de la miel en buffer citratos y en metanol; ii) extraccion 1 y 2, realizadas con acetato de etilo y asistidas con agitacion mecanica; y, iii) limpieza mediante CCC, empleando Florisil y silica gel desactivada como fase estacionaria y n hexano: acetato de etilo como fase movil para la elucion.

Optimización de la metodología

Como se menciono anteriormente, mediante los ensayos realizados en la etapa de desarrollo del metodo se logro establecer las variables de mayor impacto en el desempeno de la metodologia, al igual que las condiciones iniciales para construir el Simplex de partida.

Asi, la Tabla 2 muestra las 14 variables incluidas en la optimizacion de los tres pasos analiticos. En esta tabla es posible observar que los tamanos de paso empleados para las diferentes variables fueron establecidos de tal manera que el desplazamiento en el sistema fuera moderado, debido a que los ensayos preliminares realizados durante el desarrollo de la metodologia multiresiduo indicaron que se estaba trabajando a condiciones cercanas al punto optimo, pues se estaban recuperando la mayoria de los plaguicidas; sin embargo, el metodo presentaba coeficientes de variacion altos y un gran numero de interferentes en la deteccion por μ-ECD.

En la Tabla 3 se muestran los 15 experimentos que conforman el Simplex de partida (S₁ a S₁₅), al igual que las proyecciones resultantes realizadas durante el proceso de optimizacion de la metodologia.

Para la optimizacion mediante el metodo Simplex, es fundamental definir una respuesta que permita evaluar los diferentes ensayos y asi, continuar con las proyecciones correspondientes (6). Por tanto, la expresion 1 corresponde a la respuesta empleada para evaluar cada uno delos vertices del Simplex.

En la Ecuacion 1, N es el numero de plaguicidas extraidos con porcentaje de recuperacion entre 70% y 120%, el cual es el criterio de aceptacion del documento Sanco de la Union Europea para el analisis de residuos de plaguicidas en alimentos (19); Pr es el valor promedio del porcentaje de recuperacion de los plaguicidas extraidos y R es el ruido normalizado obtenido al dividir el ruido cromatografico de los blancos de miel en el ruido cromatografico del acetato de etilo, en los rangos de tiempo que eluyen los plaguicidas. Como se observa en la Ecuacion 1, la respuesta del Simplex es adimensional.

La Ecuacion 1 muestra que cada uno de los terminos incluidos en esta respuesta permite evaluar algun parametro de interes. Por ejemplo, como se trata de una extraccion multiresiduo, se hace necesario tener una medida del numero de compuestos que el metodo pueda extraer adecuadamente, por lo cual se incluyo el termino N. Por otro lado, como el rango de 70% a 120% resulta muy amplio, se adiciono a la ecuacion el promedio de los porcentajes de recuperacion obtenidos; asi, al tratarse de una optimizacion, se tiene en cuenta el numero de plaguicidas recuperados y la eficiencia del metodo para extraer dichos compuestos. Finalmente, se decidio incluir el ruido presente en los perfiles cromatograficos debido a que, por la baja especificidad y selectividad del detector μ-ECD, los compuestos presentes en la miel que se coextraen generalmente ocasionan interferencias en la deteccion. De tal forma, mediante la inclusion de esta relacion de ruidos se asegura que se obtenga un metodo mas especifico, lo que a su vez asegura unos mejores limites de deteccion.

En la Figura 3 se muestra la respuesta obtenida para cada vertice efectuado, despues de realizar la extraccion e inyeccion cromatografica del Simplex de partida. La Figura 3, muestra que solamente los puntos S₃ y S₁₅ exhiben una respuesta inferior a la obtenida para el punto de partida S₁. Esto indica que la adicion de un alto volumen de buffer en la extraccion (ver Tabla 3, S₃) o un aumento considerable de la polaridad de la fase de elucion durante la limpieza (ver Tabla 3, S₁₅), reducen la eficiencia de estas dos etapas experimentales.

Evaluación de la optimización

La evaluacion de la optimizacion se realizo comparando los resultados obtenidos para las condiciones experimentales de partida contra las condiciones determinadas en el vertice S₁₆ (ver Tabla 3). De esta manera, el primer punto en comparacion correspondio a la especificidad de la metodologia; asi, la Figura 4 muestra los cromatogramas obtenidos para la muestra blanco en las dos condiciones mencionadas.

La Figura 4 muestra como en el vertice S₁₆ se redujo considerablemente el numero de interferencias presentes en el detector μ-ECD, siendo notable para los tiempos de retencion entre 10 minutos y 32 minutos. Este cambio indica que el Simplex permitio obtener una mejora en la fase de limpieza del metodo multiresiduo. Esta reduccion de coeluyentes en el analisis instrumental tiene un impacto directo en los valores obtenidos para los limites de deteccion y cuantificacion de la metodologia; asi mismo, reduce considerablemente el deterioro del sistema cromatografico, pues la miel es una matriz con un alto contenido de carbohidratos y otros compuestos que suelen acumularse en el sistema de inyeccion (20).

Las Figuras 5 y 6 muestran los porcentajes de recuperacion y los coeficientes de variacion de los plaguicidas obtenidos bajo las condiciones experimentales de partida y las condiciones que generaron la mejor respuesta S₁₆. En la Figura 5 se observa que mediante el metodo optimizado se logro obtener porcentajes de recuperacion dentro del rango de aceptacion del documento SANCO para los plaguicidas cimoxanil, α-HCH, β-HCH,endosulfan α, profenofos, endosulfan β, fenitrotion y difenoconazol. Asi mismo, se mejoro considerablemente la recuperacion de los plaguicidas organoclorados 4,4'-DDD y 4,4'-DDT en comparacion con el metodo inicial. Por otro lado, en la Figura 5, se encuentra que compuestos muy polares como acefato, diclorvos, heptenofos, monocrotofos y metamidofos presentaron recuperaciones bajas, lo cual se atribuye a su alta polaridad; sin embargo, al comparar los valores obtenidos se encuentra que en todos los casos mediante el metodo optimizado se obtienen mayores recuperaciones, respecto a las condiciones de partida.

Finalmente, la Figura 6 muestra que en la mayoria de los casos, a excepcion de dimetoato y profenofos, se presentan coeficientes de variacion mas bajos al utilizar el metodo optimizado. Asi mismo, se observa que para algunos compuestos como cimoxanil, metamidofos, metilparation, entre otros, con la optimizacion se logra disminuir los coeficientes de variacion a valores inferiores a 20%, criterio de aceptacion de la Union Europea.

Conclusiones

Se desarrollo una metodologia multiresiduo para el analisis de plaguicidas en la miel que se fundamenta en una doble extraccion con acetato de etilo y limpieza mediante cromatografia clasica de columna (CCC),empleando como fase estacionaria una mezcla de silica-Florisil (1:1). El analisis de los extractos se realizo mediante cromatografia de gases con detectores NPD y μ-ECD en paralelo.

La optimizacion mediante el metodo Simplex permitio determinar las condiciones experimentales capaces de duplicar el desempeno del metodo de extraccion en comparacion con las condiciones de partida. Para este fin se requirieron 21 ensayos, dentro de los cuales seis correspondieron a movimientos de proyeccion. El experimento S₁₆ mostro los mejores resultados respecto a especificidad, precision y exactitud, puesto que se logro una reduccion de la cantidad de interferentes en el analisis instrumental, aumentaron los porcentajes de recuperacion para 9 de 30 plaguicidas y disminuyeron los coeficientes de variacion para 25 de los 30 plaguicidas extraidos. Finalmente, despues de la optimizacion, el metodo multiresiduo permite el analisis adecuado de 27 de los 30 plaguicidas extraidos de la miel.

Agradecimientos

Expresamos nuestros agradecimientos al proyecto "Seleccion de Indicadores Fisicoquimicos Mediante Aplicacion de Nariz Electronica para la Catalogacion de Productos Apicolas" financiado por el Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural.

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