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INTRODUCCIÓN
Entre los factores que más limitan la producción de café a nivel mundial se encuentra la broca del café, Hypothenemus hampei (Ferrari), que ha sido considerado el principal insecto plaga, y cuyo ataque causa pérdidas económicas superiores a US $ 500 millones de dólares anuales en los países productores del grano (Infante, 2018). Aunque originaria del continente africano, la broca del café fue introducida al continente americano, específicamente a Brasil, en 1913, y solo hasta 1988 llegó a Colombia, año en el que fue detectada por primera vez en el sur del departamento de Nariño (Bustillo, 2006). El control de este insecto plaga es poco efectivo por dos factores principales: la naturaleza críptica del insecto (es decir protegido dentro de la cereza de café), y la disponibilidad permanente de granos de café en el campo, que facilita la persistencia del insecto plaga de una generación a la siguiente (Infante, 2018).
La quitina, el segundo polisacárido natural más abundante después de la celulosa, es un homopolímero lineal de unidades de N-acetilglucosaminas (GlcNAc) unidas por enlaces glucosídicos ß-1,4 (Merzendorfer y Zimoch, 2003). Este polisacárido, que está distribuido ampliamente en la naturaleza, es sintetizado principalmente por artrópodos, nematodos, y hongos (Merzendorfer, 2006). La cutícula presente en el exoesqueleto de los artrópodos está constituida principalmente por quitina, y contribuye significativamente a su éxito en el medio ambiente dado que esta molécula proporciona fuerza, soporte, protección contra patógenos, y evita la pérdida de agua (Chapman, 1998). Sin embargo, la rigidez de su estructura hace que los insectos recurran a mecanismos fisiológicos como la ecdisis para reemplazarla; facilitando su crecimiento y desarrollo (Merzendorfer, 2006). Durante este proceso biológico, el metabolismo de síntesis de la quitina se activa para producir en el insecto un nuevo exoesqueleto. La nueva cutícula es esclerotizada, por lo que adquiere dureza y se torna de color oscuro en los insectos (Kramer y Muthukrishnan, 2005). Actualmente se sabe que la quitina es un componente central de la epidermis, la tráquea y la matriz peritrófica (MP) de los insectos; esta última está estrechamente relacionada con el proceso digestivo (Zhuo et al., 2014), y representa una línea de defensa del insecto contra patógenos ingeridos (Tellam y Eisemann, 2000; Kelkenberg et al., 2015). Estudios recientes han mostrado que la MP puede considerarse un objetivo potencial para el desarrollo de nuevos métodos que permitan controlar insectos plaga (Wang y Granados, 2000; Wu et al., 2016).
El paso final en la ruta de síntesis de quitina es catalizado porla enzima quitina sintasa (CHS; EC 2.4.1.16), una proteína que pertenece a la familia de las glicosiltransferasas, que transfieren restos de azúcares desde los donantes activados hacia los aceptores específicos, dando como resultado la formación de un enlace glucosídico (Merzendorfer, 2006).
En los insectos se han reportado dos genes de quitina sintasa (CHS1 y CHS2) que participan en la síntesis de quitina en la cutícula y otras estructuras presentes en ellas, y que se expresan a lo largo de su ciclo de desarrollo (Zhu et al., 2002; Arakane et al., 2004). Así mismo, en otros estudios Moreira et al. (2007), Arakane et al. (2008), Mansur et al. (2014) reportaron que los genes relacionados con la síntesis de quitina se expresan en estructuras reproductivas como los ovarios y huevos de diferentes insectos como Aedes aegypti, Tribolium castaneum y Rhodnius prolixus.
Hasta la fecha, las enzimas CHS se han clonado y secuen-ciado en varias especies de insectos de diferentes órdenes, como Lepidópteros (Bolognesi et al., 2005; Ampasala et al., 2011; Zhuo et al., 2014), Dípteros (Zhang et al., 2012; Yang et al., 2013), Hemípteros (Bansal et al., 2012; Alvarenga et al., 2016) y Coleópteros (Shi et al., 2016; Macedo et al., 2017). Estudios recientes se enfocan en las funciones de los genes CHS, ayudados por el mecanismo del ARN de interferencia (RNAi). Esta estrategia molecular hace uso de secuencias de ARN de doble cadena (ARNcd) para activar el mecanismo de silenciamiento génico, conduciendo a la degradación del ARN mensajero endógeno (ARNm) del insecto (Siomi et al., 2011). Estos estudios de expresión de las CHSs se han efectuado en insectos holometábolos y hemi-metábolos como: T. castaneum (Arakane et al., 2005; Arakane et al., 2008), Spodoptera exigua (Tian et al., 2009), Locusta migratoria (Zhang et al., 2010; Liu et al., 2012), Laodelphax striatellus, Nilaparvata lugens (Wang et al., 2012), Anthonomus grandis (Firmino et al., 2013), Bactrocera dorsalis (Yang et al., 2013) y Drosophila melanogaster (Wang et al., 2015).
Una de las estrategias potenciales para el control de insectos plaga es el uso del mecanismo natural de RNAi para lograr una reducción significativa en la expresión relativa de un gen vital, y cuyo resultado fenotípico depende de la supresión eficiente del transcripto asociado al gen y la consecuente reducción en la expresión de la proteína codificada (Scott et al., 2013). Los resultados de Wang et al. (2019), llevados a cabo en Sogatella furcifera, un insecto plaga que afecta los cultivos de arroz en algunos países de Asia y el Pacífico, demostraron que el silenciamiento génico basado en ARNi inhibe los niveles de expresión de transcriptos (ARNm) de CHS en ninfas del insecto que se inyectaron con ARN de cadena doble específicos para SfCHS1, SfCHS1a y SfCHS1b. Dichos insectos desarrollaron malformaciones fenotípicas y la consecuente muerte de la mayoría de las ninfas tratadas. De la misma manera, otros estudios demostraron que la disminución del gen AgraCHS2 mediada por ARNi, la CHS más importante del gorgojo del algodón (Anthonomus grandis), afecta el desarrollo de este insecto, resultando en una reducción de la oviposición del 93 % y una mortalidad del 100 % de los adultos (Macedo et al., 2017).
Actualmente se sabe que el silenciamiento génico de transcriptos involucrados en la vía de síntesis de quitina en la MP tiene un gran potencial como estrategia insecticida. Estudios realizados por Arakane et al. (2008) y Alves et al. (2010), indicaron que el silenciamiento del gen CHS2 en los insectos del orden coleóptero Diabrotica virgifera virgifera y T. castaneum generan trastornos graves en la asimilación de nutrientes por parte del insecto como consecuencia de la malformación de la MP; lo que causa la posterior muerte de los insectos tratados. En el presente estudio se demuestra la presencia del gen de la quitina sintasa (CHS1) en H. hampei (HhCHS1) y se determinan los perfiles de expresión del gen CHS1 en diferentes etapas de desarrollo del insecto, así como la disminución de su expresión en hembras, mediada por el ARNi. Los resultados obtenidos contribuyen significativamente a un mejor entendimiento de su función biológica en el metabolismo del insecto, lo que permitirá plantear futuras estrategias para el manejo de este insecto plaga, a través del empleo del mecanismo de ARNi.
MUESTRAS DE INSECTOS
Insectos adultos de la broca de café fueron removidos de grano cereza proveniente de plantas infestadas en el campo en Palestina, Caldas (5 0'28.735" N, 75 36'44.153" W), y posteriormente criados en granos de café pergamino tratado con el fungicida Carbendazim (0,3 % v/v), para evitar una posible contaminación. Las muestras de larvas (L1 y L2) y adultos (machos y hembras) de la broca del café empleadas en los diferentes ensayos se obtuvieron de las colonias que fueron establecidas y mantenidas en laboratorio de cría (2200 m. s. n. m. a 25 °C y 75 % HR), adscrito a la Universidad de Caldas en Manizales, Caldas, Colombia (5 3'22" N, 75 29'34.08" W).
Los insectos se colectaron entre los meses de abril y junio de 2019 y se mantuvieron en tubos de micro-centrifuga de 1,5 mL, libres de ARNasas, con 1 mL de solución de estabilizadora de ARN (RNAlater® solution, EE. UU.), y posteriormente fueron almacenados a -80 °C hasta su procesamiento. Para la extracción de ARN total se utilizaron muestras de 20 mg del cuerpo completo de cada etapa de desarrollo del insecto.
EXTRACCIÓN DE ARN Y SÍNTESIS DE ADNc
El ARN total se extrajo de cada etapa de desarrollo de H. hampei usando el Mini Kit RNeasy (Qiagen, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La integridad del ARN se confirmó por electroforesis en gel de agarosa al 1 % (p/v), y su concentración se determinó en NanoDrop-1000 (Thermo-Fisher-Scientific, EE. UU.). La síntesis de ADNc se llevó a cabo con 1 µg de ARN total de cada muestra y el kit de transcripción inversa QuantiTect (Qiagen, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante. El ADNc se almacenó a -20 °C hasta su uso.
DISEÑO DE CEBADORES
Los cebadores para RT-qPCR y RT-PCR semicuantitativa se diseñaron con el software Primer3Plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi/) (Tabla 1). Para el diseño de los primers T7 se partió de la secuencia completa del gen, obtenida del transcriptoma ensamblado de la broca (Noriega et al., 2019), y con ayuda del programa Standalone usando Blast local; donde se seleccionó un fragmento nucleotídico (amplicón) de 438 bp, al que se le adicionó la secuencia T7 (TAATACGACTCACTATAGGG) al inicio de la región 5' de cada cebador (sentido y anti sentido) (Tabla 1). Para los análisis de RT-qPCR se usó el gen de la actina como referencia (Barros Rodrigues et al., 2014; Basu et al., 2019).
Tabla 1 Secuencia de cebadores empleados en los análisis de RT-qPCR y PCR-semicuantitativa (RT-PCR). La secuencia T7 para el gen CHS1 aparece en negrilla. F: forward; R: reverse.
PCR SEMI-CUANTITATIVA
El ADNc de los diferentes estados biológicos del insecto se sintetizó a partir de 1000 ng de ARN total usando el kit de síntesis de ADNc (RNeasy MiniKit (Qiagen, EE. UU.), según las instrucciones del fabricante. El ADNc sintetizado se empleó como plantilla para la amplificación y detección del transcripto de quitina sintasa (HhCHS1) en cuatro diferentes etapas del desarrollo de H. hampei. El nivel de expresión del transcripto se evaluó en una mezcla de reacción que contenía 0,25 µL de cada cebador (10 µM), 2 µL de ADNc (1:50), 5 µL de SYBR Green y agua libre de nucleasas (Tabla 1). La reacción de PCR se llevó a cabo en un volumen final de 10 µL. Las condiciones de PCR fueron: 95 °C durante 5 min, 95 °C durante 30 s, 60 °C durante 30 s, seguido de 25 ciclos y extensión de 1 min a 72 °C. Todos los productos de PCR se resolvieron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 % (p/v).
PCR EN TIEMPO REAL (qPCR)
Los experimentos de qPCR se realizaron usando el kit SYBR® Green Supermix (Bio-Rad, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La mezcla para PCR contenía 2 µL de ADNc sintetizado (1:50), 0,2 µL de cada cebador (10 µM), 5 µL de SYBR Green, y 2,6 µL de agua libre de nucleasas. Todas las reacciones se llevaron a cabo con cuatro repeticiones técnicas y dos repeticiones biológicas, en un volumen final de 10 µL. Las reacciones de qPCR se llevaron a cabo en el sistema 7500 Fast Real-Time PCR (Applied Biosystems, EE. UU.). El programa para la qPCR incluyó una etapa de sostenimiento de 95 °C durante 20 s seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 3 s y un anillamiento / extensión a 60 °C durante 30 s. Al final de cada reacción de qPCR se generó una curva de fusión para confirmar la producción de un único pico y descartar la posibilidad de formación de dímeros con los cebadores, y la generación de productos o amplicones inespecíficos. El gen de la actina se utilizó como control endógeno para todas las etapas del desarrollo (Barros Rodrigues et al., 2014). Las larvas del primer estadio se seleccionaron como etapa de referencia para las comparaciones entre experimentos. El método 2-AACt (Livak y Schmittgen 2001) se usó para calcular el nivel de expresión relativa de los genes.
DISEÑO Y SÍNTESIS DEL ARNcd
Se diseñó un fragmento de 438 pb del ARNcd in silico y se sintetizó en el laboratorio de la Universidad de Caldas en Manizales, Caldas. Brevemente, se utilizó ADNc como plantilla para la primera reacción de PCR, junto con los cebadores con el promotor T7 del gen CHS1 (5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGTGCGACCACCCAAGAAAA-3') y (5' TAATACGACTCACTATAGGGCCGGGACTACAAAGTACGCA-3'), con condiciones de corrida que fueron descritas anteriormente. Seguidamente, se empleó el amplicón de esta reacción como molde para la síntesis del ARNcd con la ayuda del HiScribe™ T7 High Yield RNA Synthesis Kit (Cat. E2040S, New England Biolabs, EE. UU.), y según las instrucciones del fabricante. La reacción de síntesis de ARNcd se incubó a 37 °C en un termociclador durante un periodo de 16 h, y al cabo de este tiempo se elevó la temperatura de este a 80 °C durante 5 minutos con el fin de desactivar la enzima T7. Después de la transcripción in vitro se determinó la concentración de ARNcd sintético resultante usando un NanoDrop-1000 (Thermo-Fisher-Scientific, EE. UU.). La integridad de la molécula de ARNcd se determinó usando electroforesis en gel de agarosa al 1 % p/v.
SILENCIAMIENTO MEDIADO POR INGESTIÓN DE ARNcd
El silenciamiento del gen de la quitina sintasa de la broca (HhCHS1) se hizo mediante administración vía oral de la molécula de ARNcd sintético específico para la secuencia del gen HhCHS1. Se realizó un lavado del café pergamino verde para retirar el mucílago, después se agregó una solución del fungicida Carbendazim al 0,3 % v/v por un periodo de 8 h y se dejó secar en zarandas al aire libre durante dos días. Luego se almacenó a 4 °C hasta su uso. En los bioensayos se incluyó como control negativo, agua libre de nucleasas. El ARNcd se suministró vía oral a hembras adultas del insecto, y no a estados inmaduros (Aguilera et al., 2011), alimentadas con granos de café así: noventa y seis por repetición y seis hembras por cada pozo, que contenía 0,3 g de café molido mezclado con 2 µg/100 µL de ARNcdCHS1 en una placa tipo ELISA). Los bioensayos se mantuvieron a 25 °C y 75 ± 5 % de humedad relativa. A los siete días, las hembras vivas fueron retiradas de la dieta para efectuar la extracción del ARN total, y finalmente se procedió a realizar el análisis por RT-qPCR.
CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DEL GEN HhCHS1
La secuencia de aminoácidos de la proteína HhCHS1 se predijo por traducción de la secuencia nucleotídica correspondiente, para lo cual se usó el buscador de marco abierto de lectura (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/). Esta secuencia proteica de la broca del café se depositó en el Gen Bank (ID: QIB02551). Las hélices transmembranales de la proteína se predijeron con el software TMHMM v.2.0 (Krogh et al., 2001). En este estudio se emplearon otras herramientas de análisis bioinformático de secuencia de proteínas disponibles en sitio web de ExPASy Proteomics (http://us.expasy.org/), con el fin de determinar el peso molecular (MW) y el punto isoeléctrico (pI) más probable de la proteína HhCHS1. La predicción de los puntos de N-glicosilación de la proteína se realizó a través de la herramienta web http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/.
El árbol filogenético y los alineamientos múltiples de las secuencias de proteínas se generaron mediante el software ClustalW (Corpet, 1988), y los análisis genéticos moleculares con el software MEGA X (Kumar et al., 2018). La historia evolutiva se infirió con el método de máxima verosimilitud y el modelo de Le y Gascuel, con la distribución discreta de gamma y los sitios invariables (Le y Gascuel, 2008). Un análisis de bootstrap no paramétrico se realizó con 1000 pseudoréplicas (Felsenstein, 1985), con el objetivo de calcular los porcentajes de árboles replicados en los que las secuencias se agruparon.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Para el análisis estadístico se usó un análisis de varianza a una vía (ANOVA), seguido de una prueba de Tukey para la expresión relativa. La prueba t de Welch, que no implica homogeneidad en la varianza, se utilizó para determinar las diferencias en el bioensayo de silenciamiento (ARNcdCHS1) mediante el programa estadístico R para Windows versión 3.6.3. Los datos se expresaron como la media ± SE.
PERFILES DE TRANSCRIPCIÓN DEL GEN HhCHS1.
Los patrones de expresión de HhCHS1 en estados de desarrollo inmaduros y adultos de la broca de café (H. hampei) fueron analizados por RT-qPCR. Los resultados mostraron que el transcripto HhCHS1 se expresa en todas las etapas del desarrollo del insecto (Fig. 1a). El transcripto HhCH1S mostró un alto nivel de expresión en larvas de segundo estadio (L2), y una expresión más baja en larvas de primer estadio (L1). Igualmente, el nivel de expresión de HhCHS1 fue mayor en machos adultos que en hembras de H. hampei. Se observó igualmente una reducción drástica en el nivel de expresión de transcriptos de HhCHS1 durante la etapa pupal, en comparación con los niveles de expresión encontrados en larvas de segundo estadio (datos no mostrados). Es importante mencionar que el nivel de expresión de HhCHS1 en varias etapas biológicas de la broca del café también se analizó por RT-PCR semicuantitativa (Fig. 1b). Los resultados indicaron que HhCHS1 se expresa principalmente en larvas del segundo instar (L2) y machos, y un poco menos en las larvas de primer instar (L1) y en hembras, lo que concuerda con los resultados que se obtuvieron por RT-qPCR.
Figura 1 Patrones de expresión del gen HhCHS1 en la broca del café (Hypothenemus hampei). a. qPCR utilizando ADNc de insectos en cada etapa del desarrollo. El perfil de expresión se presenta de manera relativa a la etapa L1, que se definió como 1. b. El inserto se obtuvo mediante PCR semicuantitativa de la expresión diferencial del gen HhCH1S de varias etapas del desarrollo del insecto. MM: marcador molecular 1Kb. El gen Actina (Act) se utilizó como patrón de referencia interno. L1 (larvas de primer instar), L2 (larvas de segundo instar). El nivel de expresión (media ± SE) se basó en cuatro réplicas técnicas y dos biológicas. Las letras minúsculas encima de cada barra indican diferencias significativas entre los diferentes tratamientos mediante un análisis de varianza unidireccional seguido de la prueba de Tukey (p< 0.05), (R versión 3.6.3).
SILENCIAMIENTO DE HhCHS1MEDIADO POR ARNi
Con el objetivo de evaluar la efectividad del silenciamiento génico mediado por ARNcd específico para gen HhCHS1, se realizó la cuantificación del transcripto a través de RT-qPCR del ARN total extraído de hembras adultas del insecto después de siete días de cría en dietas a base de café, que contenían la secuencia de silenciamiento (ARNcd). Los resultados muestran que el gen HhCHS1 fue silenciado de manera efectiva en las hembras adultas del insecto por la maquinaria asociada al ARNi. Los niveles del transcripto de HhCHS1 se redujeron considerablemente en un 84 % (p< 0,005) en comparación con el nivel de transcripción de HhCHS1 en el control (agua libre de nucleasas) (Fig. 2). En ningún bioensayo realizado con la molécula de ARNcdCHS1 se observaron resultados de mortalidades con datos significativos (datos no mostrados).
Figura 2 Expresión relativa del gen HhCHS1 en hembras de la broca del café (Hypothenemus hampei), tratadas con ARNcd. En el control se usó agua libre de nucleasas. El perfil de expresión se presenta relativo a las larvas de primer estadio, que se definió como 1. El nivel de expresión (media ± SE) se basó en cuatro réplicas técnicas y dos biológicas. Las letras minúsculas sobre cada barra indican diferencias significativas entre los diferentes tratamientos mediante el análisis de varianza unidireccional seguido de la prueba t de Welch (R, versión 3.6.3). Valor p < 0.001.
CARACTERIZACIÓN DEL GEN HhCHS1
Los resultados muestran que la secuencia del gen HhCHS1 tiene un marco abierto de lectura de 4695 pb, que codifica una proteína de 1564 residuos de aminoácidos (Anexo 1), denominada quitina sintasa. La secuencia nucleotídica del gen HhCHS1 se presenta con el codón de inicio ATG en las posiciones 1-3, y el codón de parada TAA en las posiciones 4693-4695. El análisis BLAST de la secuencia de nucleótidos de la región del ORF del gen mostró un 93 % de identidad con la secuencia de Dendroctonus ponderosae (DpCHS, XP_019756066.1), 92 % de identidad con la de Sitophilus oryzae (SoCHS2, XP_030746406.1), y 91 % de identidad en la secuencia con la de A. grandis (AgCHS1, AHY28559.1). El peso molecular predicho in silico para la proteína HhCHS1 fue de 178,65 kDa, con un punto isoeléctrico de 6,52. Se predijeron 16 a-hélices transmembrana, lo que sugiere que HhCHS1 es una proteína integral de la membrana, similar a la proteína CHS1 de otros insectos, lo que concuerda con lo reportado por Kramer y Muthukrishnan, (2005) y Merzendorfer (2006). La CHS1 de H. hampei tiene una estructura modular con un dominio N-terminal (dominio A) compuesto por nueve estructuras secundarias tipo a-hélices que probablemente atraviesan la membrana, y un dominio catalítico altamente conservado (dominio B) que contiene los motivos (QRRRW y GEDRW), característicos de quitina sintasas. Así mismo, se encontraron siete regiones transmembrana en el dominio C-terminal (dominio C) de la proteína CHS1 de H. hampei, características de las glicosiltransferasas. El motivo distintivo SWGTRE (10571062), que se supone juega un papel en la translocación de quitina (Merzendorfer, 2006), también se identificó en el dominio C de la proteína. El análisis de alineamiento de secuencias proteicas proporcionó información sobre la secuencia del gen CHS1 de H. hampei, sugiriendo que este gen es miembro del grupo CHS1 (Wang et al., 2019). Inferencia que pudo corroborarse al someter la secuencia de la CHS1 de la broca del café a un análisis en InterProScan con la herramienta PANTHER (PTHR 22914: SF42) (Mi et al., 2019).
ANÁLISIS FILOGENÉTICO DE CHS1 DE BROCA DE CAFÉ
El árbol filogenético se construyó con base en las secuencias de aminoácidos de CHS de varias especies de insectos, esto con el fin de investigar la relación evolutiva de HhCHS1 con las otras especies de insectos seleccionadas (Fig. 3). El análisis mostró que HhCHS1 se agrupó en el mismo clado de A. grandis-AgCHS1 (bootstrap 65,2 %), un insecto plaga del algodón del orden coleóptera. Además, el taxón (D. ponderosae) muy cercano a CHS1 de la broca del café fue agrupado dentro del mismo clado (bootstrap 60,4 %), indicando un mismo ancestro común para estos dos organismos. El análisis también mostró que los coleópteros se agruparon dentro de un mismo clado (área sombreada en gris, bootstrap 100 %). En general, se formaron tres grupos de CHS1 y CHS2 de diferentes especies de insectos (regiones coloreadas en la Fig. 3). El análisis filogenético incluyó secuencias pertenecientes a insectos del orden lepidóptera como un grupo externo.
DISCUSIÓN
En el presente estudio, el patrón de expresión del gen HhCHS1 fue estudiado en todas las etapas de desarrollo de la broca de café usando RT-qPCR. La mayor expresión del transcripto se observó en larvas de segundo estadio (L2), instar que se sabe, en H. hampei, termina en la formación a hembra adulta (Fig. 1a). También se observaron niveles relativos de transcriptos más elevados en los machos adultos en comparación con las hembras adultas. Tales diferencias de expresión del transcripto en cada etapa pueden demostrar la participación diferencial del gen CHS1 en el desarrollo del insecto (Ye et al., 2019). Así mismo, el nivel dinámico de los transcriptos de HhCHS1 a través de las diversas etapas de desarrollo del insecto plaga, sugiere que la expresión constitutiva de HhCHS1 podría ser necesaria en el desarrollo de la broca, como ocurre con otros insectos y como ha sido reportado en investigaciones similares hechas por Arakane et al. (2011) en el coleóptero T. castaneum. En contraste con estos resultados, los niveles de expresión relativos de S. furcifera SfCHS1 fueron más altos justo después de cada muda, y los niveles de expresión más bajos para SfCHS1 se observaron en adultos del tercer día (Wang et al., 2019). Así mismo, estudios realizados con T. castaneum mostraron que el gen de quitina sintasa TcCHS1 está especializado en la síntesis de la cutícula epidérmica (Arakane et al., 2011).
Figura 3 Árbol filogenético del gen quitina sintasa HhCHS1 de la broca del café (Hypothenemus hampei). Análisis basado en el método de neighbour-joining según secuencias de aminoácidos utilizando MEGA X. Los valores de soporte Bootstrap con 1000 pseudoréplicas se muestran en las ramas. Quitina sintasas de Anthonomus grandis (Ag), Dendroctonus ponderosae (Dp), Anoplophora glabripennis (Agl) Sitophilus oryzae (So), Leptinotarsa decemlineata (Ld), Tribolium castaneum (Tc), Diabrotica virgifera virgifera (Dv), Nicrophorus vespilloides (Nv), Onthophagus taurus (Ot), Aedes albopictus (Aa), Helicoverpa armígera (Ha), Spodoptera exigua (Se), Helicoverpa zea (Hz), Manduca sexta (Ms), Bombyxmori (Bm) y Galleria mellonella (Gm), fueron escogidas en este estudio. CHS de Lepidópteros se usaron como un grupo externo.
Estudios sobre la regulación de la síntesis de quitina (CHS1) en los áfidos Toxoptera citricida (Shang et al., 2016) y Sitobion avenae (Zhao et al., 2018) mostraron que TCiCHS y SvCHS juegan un papel importante en el desarrollo de ninfa-adulto; algo que también pudiese ocurrir en las etapas de desarrollo de la broca del café, teniendo en cuenta que el gen CHS es altamente conservado en la mayoría de los insectos. El análisis por RT-PCR (Fig. 1b) indicó que los niveles de transcripción del gen blanco en la broca fueron muy similares a los obtenidos por RT-qPCR. La expresión del gen HhCHS1 muy seguramente está involucrado en el desarrollo embrionario de la broca, como ocurre con otros insectos del orden coleóptera (Arakane et al., 2011).
El ARNcd empleado en este estudio se sintetizó in vitro y se suministró por vía oral a las hembras adultas de la broca en granos de café molido. La eficacia del silenciamiento génico mediado por ARNi de HhCHS1 se evaluó mediante RT-qPCR con el ARN total extraído de las hembras. Se demostró que esta molécula desencadena el silenciamiento génico a través de ARNi, provocando una disminución de la expresión de transcriptos de HhCHS1, en comparación con el control; tal y como se planteó en la hipótesis del estudio (Fig. 2). Estos resultados fueron similares a los reportados en insectos adultos de A. grandis (holometábolo), donde el gen AgraCHS2 fue silenciado mediante tratamiento con ARNcd, lo que redujo los niveles de transcriptos del gen (Macedo et al., 2017). Del mismo modo, Mansur et al. (2014) encontraron en R. prolixus una correlación positiva entre la reducción de la expresión de CHS y la inhibición severa de la muda observada en el 66 % de los insectos sometidos al silenciamiento del gen CHS. Por su parte, resultados obtenidos con ARNcd de CHS1 en A. pisum muestran una supresión de la expresión génica en las etapas de desarrollo del insecto, lo que produjo malformaciones del cuerpo del insecto y su muerte (Ye et al., 2019).
Esto contrasta con los resultados obtenidos con la broca del café, en donde no se observaron diferencias significativas en la mortalidad de los insectos tratados respecto al grupo control (datos no mostrados), probablemente se debió a las concentraciones evaluadas, o eventualmente al tamaño final de la molécula de ARNcd. Sería interesante incluir estados inmaduros del insecto en las evaluaciones posteriores de silenciamiento, con miras a evaluar el impacto del silen-ciamiento del gen HhCHS1 en la mortalidad o malformación en el insecto. Sin embargo, el nivel de silenciamiento de Hh-CHS1 correspondiente al 84 % encontrado en nuestro estudio puede ser de interés para futuros trabajos focalizados en el manejo de este insecto plaga.
Estudios recientes de silenciamiento de genes esenciales para funciones celulares básicas y de respuesta a estrés (hsp, shi, iap) en el escarabajo del pino de montaña D. ponderosae reportados por Kyre et al. (2020), evidenciaron mortalidades de los adultos al cabo de siete días en todos los tratamientos. A diferencia de nuestro trabajo con hembras adultas de broca, ellos observaron mortalidades hasta del 100 %, con datos estadísticamente significativos, probablemente porque combinaron la ingesta oral y la absorción dermal de la molécula silenciadora. Finalmente, Arakane et al. (2005), evaluaron el silenciamiento del gen TcCHS1 y observaron dos fenotipos diferentes durante el silenciamiento de TcCHS1 de T. castaneum en las larvas inyectadas (2 ug de ARNcd) en el penúltimo estadio larvario, las cuales no pudieron mudar para alcanzar la última etapa larval. Dichos estudios contrastan con nuestros resultados con la broca del café, en donde las hembras de este insecto solo fueron alimentadas con ARNcd mezclado con granos de café molido (no inyectadas). Cabe destacar que la eficiencia del silenciamiento génico a través del ARNi basado en la alimentación con ARNcd, es menor en comparación con la inyección de la molécula silenciadora (Ye et al., 2019), lo que podría ser insuficiente para desencadenar algún fenotipo letal en la broca del café.
La mayoría de los organismos e insectos que contienen quitina, un componente esencial de la cutícula de los artrópodos, deben disponer en su maquinaria molecular de quitina sintasas (glicosiltranferasas), proteínas que participan de manera muy activa en las rutas metabólicas que conducen a la síntesis de quitina (Merzendorfer, 2006). Diversos estudios sobre estas enzimas CHSs han reportado su actividad biológica en órdenes de insectos, incluidos Himenóptera, Díptera, Ortóptera, Lepidóptera, Hemíptera, y Coleóptera (Alves et al., 2010; Chen et al., 2013; Zhuo et al., 2014; Alvarenga et al., 2016). Según sus relaciones y funciones de secuencias de aminoácidos, las CHSs de los insectos se clasifican en dos grupos, CHS1 y CHS2. En el presente estudio se reporta la caracterización in silico de la proteína CHS1 de H. hampei, llamada HhCHS1, lo que contribuye a la comprensión de las quitina-sintasas en los insectos, y muy especialmente en la broca de café. El peso molecular y el punto isoeléctrico predicho para la proteína de broca del café son similares a los reportados para otros insectos (Bansal et al., 2012; Wang et al., 2012; Macedo et al., 2017).
Idéntico a las CHSs de otros insectos, se predice que HhCHS1 es una proteína integral de membrana con 16 alfa hélices hidrofóbicas atravesando la membrana. Esta distribución y el número conservado de estos segmentos transmembranales de HhCHS1 permiten que el dominio medio (dominio B), que es el dominio catalítico, se disponga hacia el citoplasma, lugar donde el sustrato enzimático está disponible para el comienzo de la reacción (Tellam et al., 2000). Su dominio catalítico es altamente conservado entre las CHSs de insectos, incluyendo las regiones conservadas de la familia de las glicosiltransferasas, GEDRW y QRRRW (Tellam et al., 2000; Kramer y Muthukrishnan, 2005; Merzendorfer, 2006; Mansur et al., 2014; Wang et al., 2019). Entre las 16 regiones transmembrana previstas, la CHS1 de la broca del café tiene siete segmentos ubicados inmediatamente después del dominio catalítico medio, características típicas de las glicosiltransferasas, las cuales crean una topología que está presente en las CHSs de hongos e insectos (Merzendorfer, 2011). Otro motivo distintivo, el SWGTR que se supone juega un papel en la translocación de quitina (Merzendorfer, 2006), se encontró igualmente en el dominio C de la proteína CHS1 de la broca del café (Material suplementario 1) Además, se logró predecir que al menos nueve aminoácidos presentes en la estructura primaria de la proteína contienen sitios de N-glicosilación (Material suplementario 1).
El análisis del multialineamiento también se realizó con el objetivo de determinar el dominio catalítico medio de la estructura de la proteína. Este análisis mostró un dominio catalítico medio altamente conservado (dominio B) en H. hampei. Otros estudios sobre quitina sintasas (CHS) para otras especies, tales como T. castaneum, Acyrthosiphon pisum y N. lugens; muestran la proteína con aproximadamente 400 aminoácidos y con tres motivos definidos, a saber, GEDRW, QRRRW y SWGTR. En este estudio se encontraron resultados similares para la broca del café (Material suplementario 2). Además, se encontraron otros motivos de quitina-sintasas en las alineaciones de la secuencia de CHS1 de la broca con otros insectos, tales como; DID, FEYA y CSPGCFSLFR (Mansur et al., 2014).
El análisis in silico de la proteína deducida predijo que CHS1 de la broca tiene un potencial intrínseco para múltiples modificaciones postraduccionales como la N-y O-glicosilación, los cuales pueden participar en la regulación de la actividad enzimática como se encontró en el CHS2 de A. grandis (Macedo et al., 2017). El tamaño del marco de lectura del gen (4695 pb) que codifica para la CHS1 de la broca fue similar al marco de lectura del gen CHS1 en muchos insectos del orden coleóptera, díptera, lepidóptera, y hemíptera, principalmente. En consecuencia, los resultados de este estudio sugieren que el gen que codifica la quitina-sintasa en la broca del café pertenece al grupo CHS1, grupo que fue clasificado por Merzendorfer (2006).
Los hallazgos reunidos en el árbol filogenético fueron similares a los trabajos de Wang et al. (2012); Mansur et al. (2014); Ye et al. (2019); Wang et al. (2019), quienes hicieron agrupaciones dentro de los árboles filogenéticos construidos, con secuencias CHS1 y CHS2 de varios órdenes de insectos, tal y como se hizo con la broca del café, donde se logró evidenciar una alta relación evolutiva del gen HhCHS1 con los de otros coleópteros (AgraCHS1 y DpCHS) (Fig. 3). De igual manera el taxón D. ponderosae se agrupó en un clado monofilético, con la broca; corroborando la cercanía evolutiva de este coleóptero con H. hampei. De igual manera, como era de esperarse, el orden lepidóptera se agrupó en un clado aparte de los demás ordenes incluidos en el análisis.
CONCLUSIONES
Se logró caracterizar exitosamente el gen de la quitina sintasa (HhCHS1) de H. hampei, el cual se expresó en todas las etapas biológicas del insecto. El árbol fi logenético demostró que el gen pertenece a la familia de CHS1, y que está altamente expresado en larvas de segundo instar y machos adultos principalmente. El silenciamiento génico basado en ARNi suprimió los niveles de transcriptos de CHS1 en las hembras adultas de la broca del café. Sin embargo, no se obtuvieron datos de mortalidad con diferencias estadísticas significativas después de la alimentación de ARNcd en mezcla con café molido. Quizás si se suministraran las secuencias de ARNcd para CHS1 a estados inmaduros del insecto a través de otras vías, como dietas artificiales o inmersión en solución conteniendo secuencias de silenciamiento, podrían obtenerse fenotipos con alguna malformación en el desarrollo.
Los resultados indican que HhCHS1 podría ser un objetivo potencial para el control de la broca del café basado en ARNi, porque se trata de un gen de interés para el crecimiento y desarrollo del insecto. Deben abordarse estudios futuros que involucren variantes del gen CHS1 (CHS1a y CHS1b), que se sabe están involucrados en la función fisiológica de diferentes tejidos en otras especies de insectos y posiblemente en H. hampei, en caso de que la broca del café presente en su transcriptoma dichas variantes de los transcriptos de CHS1 .
