1. INTRODUCCIÓN
El aire es una mezcla gaseosa que los seres vivos necesitan para su supervivencia, y que en presencia de agentes extraños denominados contaminantes atmosféricos presenta una reducción en su calidad. La contaminación del aire es una amenaza aguda, acumulativa y crónica para la salud humana y el ambiente1. Numerosas investigaciones asocian las partículas de aire contaminado con el desarrollo de enfermedades y muerte por daño respiratorio, cardiovascular, e irritación de ojos y nariz2)(3)(4. Generalmente estos efectos se atribuyen a que el material particulado tiene como parte de su composición química metales como el aluminio, cadmio, cromo, cobre, hierro, manganeso, níquel, zinc y plomo, al ser en su mayoría de origen antropogénico5 como trastornos respiratorios, cardiovasculares y cáncer. La toxicidad y el efecto inflamatorio de estas partículas están relacionados con su tamaño y características químicas. El objetivo de este estudio fue determinar las características químicas de la fracción hidrosoluble de Material Particulado PM10, recolectado en tres sitios de monitoreo de la ciudad de Cuenca-Ecuador, y evaluar su actividad genotóxica e inducción de especies reactivas de oxígeno (ROS).
El material particulado está constituido por material sólido o líquido en forma de partículas, con excepción del agua no combinada, presente en la atmósfera. Se designa como PM2,5 al material particulado cuyo diámetro aerodinámico es menor a 2,5 micrones. Se designa como PM10 al material particulado de diámetro aerodinámico menor a 10 micrones6.
El material particulado afecta a la vegetación circundante, generando alteraciones en la fotosíntesis, cambios en la composición química del suelo y modificaciones en el crecimiento y reproducción de las plantas7. La vegetación expuesta a contaminantes atmosféricos presenta lesiones como la caída de flores y en la mayoría de casos pierden su color, se ven invadidas por partículas que descansan sobre sus hojas, ocasionando que estos vegetales estén expuestos a cambios físicos o químicos que se pueden manifestar en los distintos órganos de la planta, como por ejemplo en la reducción del crecimiento de la radícula y la planta en general, el enrollamiento foliar, manchas, clorosis, necrosis; existiendo una mayor afección en plantas que se encuentren en áreas con más contaminantes8. Entre los ensayos con plantas vasculares recomendados para la evolución de efectos fitotóxicos, se encuentran aquellos que recurren al uso de semillas de plantas terrestres, evaluando principalmente el efecto de los contaminantes en el proceso de germinación, desarrollo y establecimiento de las plántulas en los primeros días de crecimiento9.
Investigaciones realizadas en el Centro de Estudios Ambientales (CEA) de la Universidad de Cuenca, Ecuador determinaron que el material sedimentable recolectado en el área urbana de la ciudad de Cuenca afectó al desarrollo del vegetal10. Por tanto, los contaminantes atmosféricos causan efectos adversos sobre los vegetales, no obstante, a ciencia cierta, se desconoce el efecto del PM10 sobre estos. De allí la importancia que adquieren los bioensayos llevados a cabo con especies terrestres, consideradas sensibles (Brassica oleracea,Lactuca sativa,Raphanus sativus,Nasturtium officinale,Zea mays), que en un menor tiempo de exposición y sin requerir equipamiento sofisticado ni altos costos, resultan sumamente útiles para ser aplicados en muestras ambientales o en el monitoreo de procesos tóxicos11)(12. Este bioensayo se basa en el crecimiento de la raíz e hipocótilo como puntos finales de lectura, al ser estas partes más sensibles a la toxicidad10. Cabe mencionar que la elongación de la radícula e hipocótilo son indicadores muy sensibles en la evaluación de efectos fitotóxicos13.
El objetivo del presente trabajo es determinar el efecto fitotóxico de extractos acuosos de PM10, recolectados en tres puntos estratégicos de la ciudad de Cuenca, relacionando el efecto con la concentración de metales pesados presentes en el mismo, mediante un bioensayo en las semillas de lechuga (Lactuca sativa), rábano (Raphanus sativus) y brócoli (Brassica oleracea itálica).
2. METODOLOGÍA
2.1 Zona de estudio
Las muestras de PM10, empleadas para desarrollar el trabajo, fueron facilitadas por la empresa de movilidad, Tránsito y Transporte (EMOV EP) de la ciudad de Cuenca, las mismas que se monitorearon con equipos semiautomáticos de alto volumen durante 24 horas consecutivas de exposición, durante el año 2014. Las estaciones se encuentran distribuidas a lo largo de la ciudad (Fig. 1), cuyas coordenadas se detallan en la Tabla I.
2.2 Número de muestras
Por cada punto de monitoreo se analizaron dos filtros, uno de máxima y otro de mínima concentración, con la finalidad de evaluar si el efecto fitotóxico depende de las concentraciones de material particulado y presencia de las especies químicas determinadas en este.
2.3 Ensayos de fitotoxicidad
Para los ensayos de fitotoxicidad se empleó un método de prueba estática de toxicidad aguda en 120 horas de exposición, el mismo que evalúa los efectos fitotóxicos del PM10 en el proceso de germinación de las semillas y en el desarrollo de las plántulas durante los primeros cinco días de crecimiento (radícula e hipocótilo)13.
2.4 Ensayo de viabilidad
Para los ensayos de viabilidad se consideraron seis especies distintas de semillas: lechuga (Lactuca sativa), rábano (Raphanus sativus), cebolla (Allium cepa), remolacha (Beta vulgaris), nabo (Brassica rapa) y brócoli (Brassica oleracea itálica).
Para el bioensayo se utilizaron aquellas especies cuyo porcentaje de germinación fue mayor al 90%, lechuga (Lactuca sativa), rábano (Raphanus sativus) y brócoli (Brassica oleracea itálica).
Las semillas empleadas presentaron las siguientes características: pureza: 99,90%; germinación: 85%; material inerte: 10%; fecha de expiración: 6/201814.
2.5 Obtención del extracto acuosoluble de PM10
El material particulado contenido en los filtros se extrajo con agua ultra pura, por ultrasonicación durante 30 minutos a temperatura ambiente, empleando un ultrasonido marca Cole-Parmer 8894. Por cada filtro se obtuvieron 120 mL de solución o extracto acuoso. Posteriormente el extracto acuoso fue centrifugado a 2500 g durante 30 minutos para sedimentar la materia insoluble. Las soluciones frescas preparadas fueron almacenadas a 4 ºC para su posterior empleo en el ensayo de fitotoxicidad y análisis de metales pesados.
2.6 Caracterización de PM10
El método analítico empleado para determinar la presencia de metales en los filtros fue el Método de la Agencia de Protección Ambiental por sus siglas en inglés EPA 3005ª, “Acid digestion of waters for total recoverable or dissolved metals for analysis by flaa or icp spectroscopy”, el cual contempla la digestión ácida en la que toda muestra se acidifica en el momento de recogida con ácido nítrico. En el análisis, la muestra se calienta con ácido y es reducido sustancialmente en volumen. El digestato se filtra y nuevamente su volumen es disminuido, estando lista para obtener su resultado. Para ello se empleó el equipo de absorción atómica EAA Perkin Elmer AA400.
2.7 Preparación de diluciones
Con el fin de determinar la fitotoxicidad a distintas concentraciones de PM10, se prepararon diluciones seriadas con un factor de 10 y con un medio de dilución agua desionizada, obteniendo concentraciones menores a partir de una concentración madre.
Por cada muestra de papel filtro se prepararon 4 diluciones (100 %, 10 %, 1 %, 0.1 %), y un control negativo (agua destilada).
2.8 Bioensayo
El bioensayo se basó en el método adaptado por Sobrero y Ronco15 en el laboratorio del Centro de Estudios Ambientales. Las pruebas se realizaron con una exposición de los extractos a 120 horas. El análisis de las muestras se hizo por triplicado para cada concentración (control negativo; 100%; 10%; 1%; 0,1%).
2.9 Condiciones del bioensayo
En la Tabla II se resume las condiciones ambientales en las cuales se hizo el bioensayo.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1 Pruebas de viabilidad
Los resultados de las pruebas de viabilidad hechas a las seis especies de semillas se muestran en la Tabla III.
Las semillas deRaphanus sativus,Brassica oleracea itálicayLactuca sativapresentan una germinación mayor al 90%, estas semillas se utilizaron para el bioensayo concordando con las recomendadas por la Agencia de Protección al Medioambiente y por la Administración de Drogas y Alimentos, por su sensibilidad en comparación con otras plantas14)(15.
Los resultados corroboran ciertos estudios donde utilizan estos vegetales para realizar bioensayos. En el estudio de evaluación de la toxicidad de los suelos mediante bioensayos con semillas se obtuvo un valor mayor al 90% de germinación en elBrassica oleracea itálica,Lactuca sativa,Phaseolus vulgarisyZea mays15. En otro estudio denominado Bioensayo de germinación deLactuca sativa(L.) en la determinación de calidad de agua en represas para riego se reportó un porcentaje de germinación mayor al 90%16.
3.2 Caracterización de metales pesados
La Tabla IV expone los resultados de la caracterización de metales pesados en las seis muestras de PM10 para los diferentes puntos de monitoreo.
Las muestras analizadas reportan para el Cd, Mn y Ni la mayor concentración en la estación 3-405** con un valor de 4,694 ng/m3, 55,532 ng/m3 y 62,401 ng/m3, respectivamente, los valores pertenecientes al Cd y Mn se encuentran por debajo del límite máximo permisible que establece un valor de 5 ng/m3 para el Cd y 150 ng/m3 para el Mn valores determinados por la OMS, mientras que el níquel sobrepasa el límite máximo establecido 20 ng/m3 por los estándares de calidad del aire de la legislación de Estados Unidos14)(17.
En el reporte de la concentración del Pb se evidencia que el máximo valor detectable es de 9,35 ng/m3 en la muestra 1-460* y el menor valor es de 3,875 ng/m3 en la estación 2-460* valores que se encuentran por debajo del límite permisible establecido por la OMS (500 ng/m3). Este resultado podría asociarse al elevado tráfico vehicular, ya que este compuesto tiene su origen en el sistema de escape de los vehículos, por el empleo de combustibles18.
3.3 Porcentaje de germinación
La Tabla V presenta la media de los porcentajes de germinación de los tres tipos de semillas empleados en los bioensayos a los diferentes tratamientos aplicados. Las pruebas se hicieron por triplicado para descartar cualquier tipo de error.
La Tabla V muestra que el porcentaje de germinación delBrassica oleracea itálicaes menor al registrado por elRaphanus sativusyLactuca sativa, quienes cumplen con las especificaciones reportadoas por el fabricante (germinación > 85%).
3.4 Determinación de fitotoxicidad
Las figuras 2 y 3 presentan el efecto fitotóxico de los extractos acuosos de PM10 sobre la inhibición del crecimiento en raíz e hipocótilo en semillas a diferentes tratamientos.
El estudio encontró que los extractos acuosos del material particulado PM10, de las estaciones 2-460 y 2-447 (Figs. 2 y 3), presenta inhibición al crecimiento del hipocótilo para los diferentes tratamientos aplicados en las tres especies ensayadas, estos resultados reflejan los de García et. al,10 donde a mayores concentraciones se registra una mayor inhibición al crecimiento. Esto podría atribuirse a la presencia de metales como el níquel, el cual resulta ser tóxico a concentraciones que oscilan entre 0,19 umol g-1 y 0,85 umol g-1 en peso seco de planta, e incluyen la inhibición del crecimiento de la raíz y la aparición de clorosis entre las venas de las hojas19, otro posible efecto sería que el plomo inhibe la germinación de las semillas y retarda el crecimiento de las plantas, además presenta síntomas específicos, los cuales consisten en una disminución del porcentaje e inhibición de la germinación20. Un hallazgo novedoso se observa para el caso delRaphanus sativusyLactuca sativa, en la estación 3-405, en el que a pesar de registrar las mayores concentraciones de metales pesados (Ni, Mn), el efecto fitotóxico se produce con los tratamientos al 10,0% y al 0,10% para el caso del Raphanus sativus y al 0,1% para la Lactuca Sativa. Este hecho podría atribuirse a que la estación se localiza a 300 m al sur del parque industrial donde se registran industrias de producción de hierro, acero y cerámica21. Un resultado que llama la atención es que la semilla más sensible a los tratamientos esLactuca sativa, ya que todos los casos inhibieron el crecimiento del hipocótilo13)(22. La estación 2-447 inhibe el crecimiento de la raíz al 100%, 10% y 1% delBrassica oleracea itálica, para el caso delRaphanus sativusal 10%, 1% y 0,1%, finalmente, para el caso deLactuca sativaal 0,1%, en esta última también la estación 2-460 y 3-405 producen el mismo efecto a concentraciones de 100% y 0,1%, respectivamente; esto se puede atribuir a la presencia de níquel. Al revisar la literatura no se encontraron estudios que evalúen la fitotoxicidad de este contaminante, razón por la cual no se conoce con certeza cuál es el componente del PM10 específico que afecte las especies vegetales estudiadas. En futuras investigaciones, se podrían utilizar sustancias puras que sean componentes del PM10, para evaluar la relación de cada una de ellas con el efecto inhibitorio. Se encontró también que a diferentes concentraciones se tiene un efecto estimulante mayoritario en la raíz, seguido del hipocótilo, tanto del brócoli,Raphanus sativusyLactuca sativa. Lo que llama la atención es el resultado de la estación 2-447 la cual resultó ser la más crítica, ya que inhibió el crecimiento de raíz e hipocótilo en las tres semillas. Este comportamiento podría atribuirse a que la estación se encuentra localizada en el centro histórico (MUN), zona de elevado tráfico vehicular, lo cual permite suponer que existe una sinergia entre metales pesados contenidos en el PM10, muchos de los cuales no fueron analizados. Los resultados de esta investigación, utilizando semillas, indica una amplia variedad en respuesta a los metales, concordando con lo manifestado por Denget. aly Lytle and Lytle23)(24.
Concentraciones de metales pesados en tres sitios de monitoreo (**) estaciones con concentraciones de PM10 que varían entre (17,04 μg/m3 y 29,10 μg/m3) (*) estaciones con concentraciones de PM10 que oscilan entre (28,45 μg/m3 y 52, 44 μg/m3). Los códigos: 1-423 y 1- 460; 2-447 y 2-460; 3-405 y 3-425 corresponde a las estaciones: Escuela Ignacio Escandón (EIE), municipio (MUN) y Colegio Carlos Arízaga (CCA), respectivamente.
Fuente: Los autores
Los códigos: 1-423 y 1-460; 2-447 y 2-460; 3-405 y 3-425 corresponden a las estaciones: Escuela Ignacio Escandón (EIE), municipio (MUN) y Colegio Carlos Arízaga (CCA), respectivamente.
Fuente: Los autores
Ensayos de fitotoxicidad, evaluación de inhibición del crecimiento a la raíz, tratamiento 100%, 10%, 1% y 0,1%: (A)Brassica oleracea itálica, (B)Raphanus sativus, (C)Lactuca sativa; Test ANOVA y post test Kruskal-Wallis (p<0,05). Fuente: Los autores
4. CONCLUSIONES
Las emisiones de material particulado PM10 causan severos daños, entre ellos la alteración en la fotosíntesis, modificaciones en el crecimiento y reproducción de las plantas. Se identificó que la especieLactuca sativapresente mayor sensibilidad a los tratamientos del extracto acuoso de PM10. La estación localizada en el centro histórico de la ciudad resulto ser la más significativa, afectando las tres especies ensayadas, reportándose una mayor concentración de níquel y manganeso. Los tratamientos inhibieron en mayor porcentaje al hipocótilo, antes que a la raíz. Esta investigación es importante por los efectos asociados al PM10. Futuras investigaciones deben caracterizar metales que no han sido considerados en este estudio, así como compuestos orgánicos que podrían estar presentes en los extractos acuosos. Se recomienda a las entidades de control ambiental, implementar programas de monitoreo continuo para valorar los efectos ocasionados a largo plazo y proporcionar información para elaborar un marco normativo en función de los metales pesados.